抗肺纤维化药效筛选流程

摘要

本发明提供了一种抗肺纤维化药效筛选流程，通过如下操作实现抗纤维化药效筛选：（1）由多能干细胞诱导产生多谱系肺类器官；（2）对（1）中肺类器官进行质量检定，包括形态表征与谱系类型检定；（3）对（2）中过检的类器官进行纤维化造模与药物处理；（4）对（3）中的纤维化模型质量检定，包括纤维化血清标志物检定；（5）对（4）中过检的模型进行药效测试，包括病理染色分析与纤维化相关标志物免疫染色分析以及肺纤维化血清标志物分析。该流程从不同角度进行抗纤维化药效测试，可为后续靶点验证、特异性验证等环节提供更丰富准确的信息支撑；有望成为新一代抗纤维化新药评价方法，用以缩短新药开发周期，提高成功率。

权利要求

1.一种抗肺纤维化药效筛选流程，其特征在于：该流程包括如下步骤：

1）多谱系肺类器官的构建

S1、诱导hPSC分化为定形内胚层：

S1中使用的培养基包括培养基A和培养基B，培养基A添加有人肌肉抑制素GDF8和CHIR99021，培养基B添加有人肌肉抑制素GDF8、人成纤维细胞生长因子2 FGF2和维生素C，hPSC依次在培养基A和培养基B中进行培养1‑3天；GDF8的使用量为20‑500ng/ml，CHIR99021的使用量为0.1‑10μM，FGF2的使用量为1‑100ng/ml，维生素C的使用量为5‑300μg/ml；

S2、诱导定形内胚层分化为肺芽：

在S2进行前期阶段之前先使用培养基C培养1‑3天，其中含有BMP抑制剂NOG、TGFβ抑制剂SB431542，且培养基中还添加EGM2；NOG的使用量为50‑500ng/ml，SB431542使用量为1‑50μM；

S2分为前期阶段和后期阶段，其中前期阶段使用培养基D和培养基E，后期阶段使用培养基F，前期阶段持续加入全反式维甲酸ATRA，ATRA的使用量为0.01‑10μM；在培养基D中培养1‑3天，培养基D添加有Wnt抑制剂IWP2、TGFβ抑制剂SB431542和全反式维甲酸ATRA，Wnt抑制剂使用量为0.1‑10μM，TGFβ抑制剂使用量为为1‑50μM；在培养基E中培养2‑5天，培养基E中添加肺上皮细胞相关诱导分化因子GSK‑3抑制剂CHIR99021、人骨形成蛋白4 BMP4、人角质细胞生长因子KGF、人成纤维细胞生长因子10 FGF10和全反式维甲酸ATRA；其中，CHIR99021的使用量为0.1‑10μM，BMP4的使用量为1‑50ng/ml，FGF10的使用量为1‑50ng/ml，KGF的使用量为1‑50ng/ml；在培养基F中培养8‑12天，培养基F在培养基E的基础上增加血管内皮细胞与巨噬细胞诱导分化的共性因子人上皮生长因子EGF、人血管内皮细胞生长因子VEGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF，同时减少全反式维甲酸的用量，并且在前期阶段和后期阶段的培养基中均添加EGM2，其中，EGF的使用量为1‑50ng/ml，VEGF的使用量为0.5‑

100ng/ml，bFGF的使用量为0.5‑50ng/ml，各阶段添加的EGM2的体积百分比为5%‑60%；

S3、诱导肺芽分化为多谱系肺脏类器官；

采用含有I型胶原蛋白与III型胶原蛋白的ECM对肺芽进行包被，ECM用来模拟细胞生长的三维微环境，其中，ECM为三层结构，从下至上分别为A层、B层和C层；A层为100% Matrigel；B层为S2形成的肺芽和体积比40%的Matrigel、体积比40%的I型胶原蛋白、体积比

20%的III型胶原蛋白；C层为100% Matrigel；随后使用培养基G进行培养，培养基G在培养基F的基础上再添加肺上皮促成熟因子，所述肺上皮促成熟因子为地塞米松、PDE抑制剂IBMX、PKA激活剂cAMP，地塞米松的使用量为10‑1000nM，PDE抑制剂的使用量为0.01‑1mM，PKA激活剂的使用量为0.01‑1mM；培养最终得到多谱系肺类器官，并验证该类器官兼具呼吸道远端与近端主要上皮细胞类型以及肺驻留巨噬细胞；

2）药效筛选模型

设置对照组、造模组和药物组，其中，造模组使用含有造模药物的培养基连续孵育类器官，药物组使用含有造模药物和抗纤维化药物的培养基连续孵育类器官，对照组添加PBS进行对照；

3）药效分析

对培养得到的模型进行病理染色分析和/或纤维化相关标志物免疫染色分析和/或肺纤维化血清标志物分析，当结果P值＜0.05，表明存在抗纤维化效应。

2.根据权利要求1所述的抗肺纤维化药效筛选流程，其特征在于：在形成肺芽后期阶段至形成类器官阶段ATRA的使用量为0.01‑0.5μM。

3.根据权利要求1所述的抗肺纤维化药效筛选流程，其特征在于：造模药物为博来霉素或TGF‑β1，其中博来霉素的使用浓度为10‑100μg/ml，TGF‑β1的使用浓度为10‑100ng/ml，对照组、造模组和药物组均处理8‑30天。

4.根据权利要求1所述的抗肺纤维化药效筛选流程，其特征在于：抗纤维化药物为吡非尼酮或尼达尼布。

5.根据权利要求1所述的抗肺纤维化药效筛选流程，其特征在于：病理染色分析为采用Masson或Sirius Red或H&E对样本切片染色，分析各组中类器官的细胞/组织形态改变以及胶原沉积情况，并通过ImageJ软件基于胶原沉积面积进行定量分析。

6.根据权利要求1所述的抗肺纤维化药效筛选流程，其特征在于：纤维化相关标志物免疫染色分析为通过纤维化标志物染色比较各组类器官的表达情况，并通过Image J软件基于阳性信号进行定量分析。

7.根据权利要求6所述的抗肺纤维化药效筛选流程，其特征在于：纤维化标志物包括：

胶原沉积标志物COL1、COL3、FN；肌成纤维细胞标志物α‑SMA、FAP；上皮‑间质转化标志物SLUG、SNAIL、TWIST；间质标志物VIM、PDGFRα/β、THY1、DES。

8.根据权利要求1所述的抗肺纤维化药效筛选流程，其特征在于：肺纤维化血清标志物分析为取各组培养上清，采用ELISA技术检测上清中至少2种经典肺纤维化血清标志物的含量。

说明书

抗肺纤维化药效筛选流程

技术领域

[0001] 本发明涉及干细胞生物学及再生医学领域，尤其是涉及一种抗肺纤维化药效筛选流程。

背景技术

[0002] 作为最常见的特发性间质肺病，特发性肺纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）的死亡率高于多数肿瘤，患者中位生存期仅2‑3年。截至目前，仅有吡非尼酮与尼达尼布2种药物因有效缓解纤维化的进展而获批。然而，现有数据表明，其疗效并未转化为生存收益，且患者一旦产生耐受，将面临无药可用的困境。仍亟待开发缓解甚至逆转肺纤维化的新药。

[0003] 作为临床试验前的“患者替身”，药物评价模型的可靠性对新药开发的成败至关重要。据统计，基于传统的临床前药物评价体系（细胞模型+动物模型），近20年来有＞70种抗纤维化药物虽然在这些模型上呈现了抗纤维化效应，但最终却纷纷在临床试验阶段遭遇失败，造成了难以计数的资源浪费。实际上，已有大量数据表明，细胞模型在生理相关性上的缺失与动物模型在种属差异上的天然短板是当下药物开发低成功率的重要原因（仅约7.8%）。开发一个人源的、具备生理相关性的药效筛选模型已然成为学界与产业界的共同目标。

[0004] 近年来，随着干细胞生物学与组织工程学的迅速发展，类器官技术应运而生。相比传统的2D/3D细胞模型，类器官具备更好的细胞多样性、结构多谱系性与功能性特异性，有望成为新一代的人源体外药物评价模型，弥补传统细胞模型与动物模型的不足。目前，基于人成体干细胞（hASC，human adult stem cell）或人多能干细胞（hPSC，human pluripotent stem cell）的肺类器官诱导分化技术均已成功建立；但无论基于以上任何一类种子细胞，产生的类器官均仅包含肺上皮谱系类型（如肺泡细胞、杯状细胞、纤毛细胞等），尚缺乏其他生理病理相关的重要的细胞类型，如巨噬细胞。在IPF中，肺驻留巨噬细胞是TGF‑β1的主要分泌源（其他少部分源于上皮，如肺泡细胞），而后者作为纤维化中枢信号，决定了纤维化的发生发展。倘若存在一种肺类器官在具备不同上皮细胞类型的的基础上，兼具肺驻留巨噬细胞，则可真正实现肺纤维化的准确模拟与药效筛选。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明旨在提供了一种抗肺纤维化药效筛选流程，基于该肺类器官的谱系全面性（不仅具备肺主要上皮细胞类型，还兼具肺驻留巨噬细胞），抗纤维化药效评价准许从病理分析、纤维化标志物染色分析、纤维化血清标志物分析等不同角度进行抗纤维化的药效测试，可为后续靶点验证、特异性验证等环节提供更丰富准确的信息支撑；有望成为新一代抗纤维化新药评价方法，用以缩短新药开发周期，提高成功率。

[0006] 为达到上述目的，本发明的技术方案实现方式如下：

[0007] 一种抗肺纤维化药效筛选流程，该流程包括如下步骤：

[0008] 1）多谱系肺类器官的构建

[0009] 使用含有GDF、ATRA、肺上皮细胞相关诱导分化因子、血管内皮细胞与巨噬细胞诱导分化的共性因子、肺上皮促成熟因子、EGM2的培养基诱导培养hPSC得到多谱系肺类器官，并验证该类器官兼具呼吸道远端与近端主要上皮细胞类型以及肺驻留巨噬细胞；

[0010] 2）药效筛选模型

[0011] 设置对照组、造模组和药物组，其中，造模组使用含有造模药物的培养基连续孵育类器官，药物组使用含有造模药物和抗纤维化药物的培养基连续孵育类器官，对照组添加PBS进行对照；

[0012] 3）药效分析

[0013] 对培养得到的模型进行病理染色分析和/或纤维化相关标志物免疫染色分析和/或肺纤维化血清标志物分析，当结果P值＜0.05，表明存在抗纤维化效应。

[0014] 进一步，GDF为GDF3、GDF5、GDF7、GDF8中的任一种，GDF的使用量为20‑500ng/ml；在形成肺芽前期阶段ATRA的使用量为0.01‑10μM，在形成肺芽后期阶段至形成类器官阶段ATRA的使用量为0.01‑0.5μM。

[0015] 进一步，血管内皮细胞与巨噬细胞诱导分化的共性因子包括EGF、VEGF、bFGF，其中，EGF的使用量为1‑50ng/ml，VEGF的使用量为0.5‑100ng/ml，bFGF的使用量为0.5‑50ng/ml；各阶段添加的EGM2的体积百分比为5%‑60%。

[0016] 进一步，肺上皮细胞相关诱导分化因子包括GSK‑3抑制剂、BMP4、FGF10、KGF、ATRA；其中，GSK‑3抑制剂的使用量为0.1‑10μM，BMP4的使用量为1‑50ng/ml，FGF10的使用量为1‑
50ng/ml，KGF的使用量为1‑50ng/ml，ATRA的使用量为0.01‑10μM；

[0017] 肺上皮促成熟因子包括地塞米松、PDE抑制剂、PKA激活剂。

[0018] 进一步，造模药物为博来霉素或TGF‑β1，其中博来霉素的使用浓度为10‑100μg/ml，TGF‑β1的使用浓度为10‑100ng/ml，对照组、造模组和药物组均处理8‑30天。

[0019] 进一步，抗纤维化药物为吡非尼酮或尼达尼布。

[0020] 进一步，病理染色分析为采用Masson或Sirius Red或H&E对样本切片染色，分析各组中类器官的细胞/组织形态改变以及胶原沉积情况，并通过ImageJ软件基于胶原沉积面积进行定量分析。

[0021] 进一步，纤维化相关标志物免疫染色分析为通过纤维化标志物染色比较各组类器官的表达情况，并通过Image J软件基于阳性信号进行定量分析。

[0022] 进一步，纤维化标志物包括：胶原沉积标志物COL1、COL3、FN；肌成纤维细胞标志物α‑SMA、FAP；上皮‑间质转化标志物SLUG、SNAIL、TWIST；间质标志物VIM、PDGFRα/β、THY1、DES。

[0023] 进一步，肺纤维化血清标志物分析为取各组培养上清，采用ELISA技术检测上清中至少2种经典肺纤维化血清标志物的含量。

[0024] 相对于现有技术，本发明所述的抗肺纤维化药效筛选流程具有以下优势：

[0025] 目前，无论基于hASC还是hPSC的肺类器官诱导分化技术，均只能产生肺上皮谱系类型，缺乏其他生理病理相关的关键细胞类型，如巨噬细胞。在IPF中，肺驻留巨噬细胞是TGF‑β1的重要分泌来源，而后者作为纤维化中枢信号，决定了纤维化的发生发展。因此，肺驻留巨噬细胞的存在对于体外重现IPF病理从而实现精准药效筛选而言不可或缺。在本发明专利中，基于肺类器官的谱系全面性（不仅包含肺主要上皮细胞类型，还兼具肺驻留巨噬细胞），建立的药效评价方法准许从病理分析、纤维化标志物染色分析、纤维化血清标志物分析等不同角度进行抗纤维化的药效测试；可为后续靶点验证、特异性验证等环节提供更丰富准确的信息支撑，有望成为新一代抗纤维化新药评价方法，用以缩短新药开发周期，提高成功率。

附图说明

[0026] 构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

[0027] 图1为实施例1所述的Day60多谱系肺类器官形态表征检定结果；

[0028] 图2为实施例1的多谱系肺类器官切片免疫荧光染色检定谱系构成；A图为PDPN+I+ + +型肺泡细胞，B图为SP‑BII型肺泡细胞，C图为acTUB纤毛细胞，D图为MUC5AC杯状细胞，E图+ + + +
为CC10棒状细胞，F图为CHGA 神经内分泌细胞，G图为P63基底细胞，H图为CD68肺巨噬细胞；

[0029] 图3为实施例2肺纤维化血清标志物ELISA定量分析，A图为对照组与造模组的培养上清中KL6含量分析，B图为对照组与造模组的培养上清中CCL18含量分析，C图为对照组与造模组的培养上清中TGF‑β1含量分析；**，P＜0.01；***，P＜0.001；类器官样本n=4；

[0030] 图4为实施例2的Masson染色结果；图A为对照组，图B为造模组，图C为药物组，药物组使用100ug/ml吡非尼酮；

[0031] 图5为实施例2基于Masson染色结果的胶原沉积定量分析结果；**，P＜0.01；每组n=9个切片，来源于3个肺类器官；

[0032] 图6为实施例2的免疫荧光染色结果，图A为对照组，图B为造模组，图C为药物组，药物组使用100ug/ml吡非尼酮；

[0033] 图7为实施例2的荧光信号定量分析，***，P＜0.001；每组n=9个切片，来源于3个肺类器官；

[0034] 图8为实施例2的肺纤维化血清标志物ELISA定量分析，A图为对照组、造模组、药物组的培养上清中KL6含量分析，B图为对照组、造模组、药物组的培养上清中CCL18含量分析；药物组使用100ug/ml吡非尼酮；*，P＜0.05；**，P＜0.01；类器官样本n=4；

[0035] 图9为实施例3肺纤维化血清标志物ELISA定量分析，A图为对照组与造模组的培养上清中KL6含量分析，B图为对照组与造模组的培养上清中CCL18含量分析，C图为对照组与造模组的培养上清中PDGF含量分析；**，P＜0.01；***，P＜0.001；类器官样本n=4；

[0036] 图10为实施例3的Masson染色结果；图A为对照组，图B为造模组，图C为药物组，药物组使用1μM尼达尼布；

[0037] 图11为实施例3基于Masson染色结果的胶原沉积定量分析结果；**，P＜0.01；每组n=9个切片，来源于3个肺类器官；

[0038] 图12为实施例3的免疫荧光染色结果，图A为对照组，图B为造模组，图C为药物组，药物组使用1μM尼达尼布；

[0039] 图13为实施例3的荧光信号定量分析，**，P＜0.01；每组n=9个切片，来源于3个肺类器官；

[0040] 图14为实施例3的肺纤维化血清标志物ELISA定量分析，A图为对照组、造模组、药物组的培养上清中KL6含量分析，B图为对照组、造模组、药物组的培养上清中PDGF含量分析；药物组使用1μM尼达尼布；*，P＜0.05；**，P＜0.01；类器官样本n=4。

具体实施方式

[0041] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

[0042] 定形内胚层：定型内胚层（definitive endoderm）指胚胎发育早期肺脏、肝脏、小肠、大肠等内脏器官主要组成细胞的原始发育位点。

[0043] 本发明提供了一种多谱系肺类器官，该肺类器官由包括如下步骤的方法构建而成：

[0044] S1、用含有GDF的培养基诱导hPSC分化为定形内胚层；

[0045] S2、诱导定形内胚层分化为肺芽，包括两个阶段：前期阶段和后期阶段；

[0046] 在前期阶段形成肺祖细胞球，期间要持续添加ATRA；后期阶段形成囊状肺芽，期间在使用肺上皮细胞相关诱导分化因子进行肺定向分化的基础上，添加血管内皮细胞与巨噬细胞诱导分化的共性因子；并且在前期阶段和后期阶段的培养基中均添加EGM2；

[0047] S3、诱导肺芽分化为多谱系肺脏类器官；

[0048] 采用含有I型胶原蛋白与III型胶原蛋白的ECM对肺芽进行包被，ECM用来模拟细胞生长的三维微环境；随后向培养基中添加血管内皮细胞与巨噬细胞诱导分化的共性因子和EGM2继续培养得到多谱系肺脏类器官。

[0049] 具体来说，S1中使用的培养基包括培养基A和培养基B，培养基A添加有GDF和GSK‑3抑制剂，培养基B添加有GDF、FGF2和维生素C，hPSC依次在培养基A和培养基B中进行培养，[0050] GDF的使用量可以为20‑500ng/ml，优选地50‑200ng/ml，或更优选地100‑150ng/ml，在该范围内均可以实现本发明目标，具体的可使用100ng/ml；GSK‑3抑制剂的使用量可以为0.1‑10μM，优选地0.5‑5μM，或更优选地2‑5μM，在该范围内均可以实现本发明目标，具体可使用3μM；FGF2的使用量可以为1‑100ng/ml，优选地2.5‑30ng/ml，或更优选地5‑20ng/ml，在该范围内均可以实现本发明目标，具体可使用10ng/ml；维生素C（AA）的使用量可以为5‑300μg/ml，优选地10‑200μg/ml，或更优选地20‑100μg/ml，在该范围内均可以实现本发明目标，具体可使用50μg/ml。

[0051] 其中，GDF为Nodal信号激活剂，GDF可以为GDF3、GDF5、GDF7、GDF8中的任一种，优选为GDF8；GDF8使得细胞生长更均质，并为后期提高S2阶段的SOX2表达量和足量的肺祖细胞球打下基础；

[0052] GSK‑3抑制剂可以为CHIR99021与其盐化物、BIO、SB216763、AT7519、CHIR‑98014、TWS119、Tideglusib，但不总是限于此，具体可以选为CHIR99021；

[0053] FGF2可以替换为FGF4、FGF10，优选为FGF2；

[0054] 分别在培养基A和培养基B中培养1‑3天，优选为1天。

[0055] 在S2的前期阶段持续添加ATRA并保持其浓度在0.01‑10μM，优选地0.25‑5μM，或更优选地0.5‑2μM，具体可以为1μM，以保证可产生足量的、悬浮态的肺祖细胞球，用于收集并继续分化。后期阶段添加血管内皮细胞与巨噬细胞诱导分化的共性因子EGF、VEGF、bFGF，并且在整个S2阶段的培养基中均添加EGM2，更有利于内皮细胞与免疫细胞标志物的表达。

[0056] 各阶段添加的EGM2的体积百分比为5%‑60%，优选地10‑50%，或更优选地15‑30%。

[0057] 另外，在S2的前期阶段之前还可以先用含有BMP抑制剂、TGFβ抑制剂的培养基培养，且培养基中还添加EGM2。添加EGM2的体积百分比为5%‑60%，优选为23.5%。

[0058] 前期加EGM2是为了产生中胚层祖细胞，也就是巨噬细胞与血管内皮细胞的前体细胞。

[0059] BMP抑制剂为NOG、CC、LDN193189、DMH1、LDN‑212854、UK‑383367、K02288中的任一种，优选NOG；TGFβ抑制剂为SB431542、RepSox、A83‑01、Galunisertib、Vactosertib、R‑268712、ML347、SD‑208、R‑268712、LY2109761、LY‑364947、AZ12601011、LY3200882、GW788388中的任一种，优选SB431542。

[0060] 具体来说，S2中使用的培养基包括培养基C、培养基D、培养基E和培养基F，培养基D‑E为前期阶段使用的，培养基F为后期阶段使用的；其中，培养基C添加有BMP抑制剂、TGFβ抑制剂，培养基D添加有Wnt抑制剂、TGFβ抑制剂和ATRA，培养基E中添加肺上皮细胞相关诱导分化因子，肺上皮细胞相关诱导分化因子为GSK‑3抑制剂、BMP4、角质细胞生长因子KGF、FGF10和ATRA；培养基F在培养基E的基础上增加EGF、VEGF、bFGF，同时减少ATRA的用量。

[0061] 培养基C中BMP抑制剂的使用量可以为50‑500ng/ml，优选地100‑400ng/ml，或更优选地150‑300ng/ml，在该范围内均可以实现本发明目标，具体优选使用200ng/ml；TGFβ抑制剂使用量可以为1‑50μM，优选地5‑30μM，或更优选地5‑10μM，在该范围内均可以实现本发明目标，具体优选使用10μM；在培养基C中培养1‑3天，优选为1天。

[0062] 培养基D中Wnt抑制剂可以为IWP2、IWR‑1、IWP‑4、CCT251545、KY1220，但不总是限于此，具体可以优选为IWP2，其使用量可以为0.1‑10μM，优选地0.25‑5μM，或更优选地0.5‑2μM，具体优选使用1μM；TGFβ抑制剂同上述可以有多种选择，具体优选为SB431542，其使用量可以为1‑50μM，优选地5‑30μM，或更优选地5‑10μM，具体优选使用10μM；在培养基D中培养1‑3天，优选为1天。

[0063] 培养基E中GSK‑3抑制剂同上述可以有多种选择，具体优选为CHIR99021，其使用量可以为0.1‑10μM，优选地1‑7.5μM，或更优选地2‑5μM，具体优选使用3μM；BMP4的使用量可以为1‑50ng/ml，优选地5‑20ng/ml，具体优选为10ng/ml；角质细胞生长因子KGF的使用量可以为1‑50ng/ml，优选地5‑20ng/ml，具体优选为10ng/ml；FGF10的使用量可以为1‑50ng/ml，优选地5‑20ng/ml，具体优选为10ng/ml；在培养基E中培养2‑5天，优选为3天。

[0064] 培养基F中EGF的使用量可以为1‑50ng/ml，优选地5‑20ng/ml，具体优选为10ng/ml；VEGF的使用量可以为0.5‑100ng/ml，优选地10‑30ng/ml，具体优选为15ng/ml；bFGF的使用量可以为0.5‑50ng/ml，优选地2‑10ng/ml，具体优选为5ng/ml；ATRA的使用量为0.01‑0.5μM，优选地0.05‑0.2μM，具体优选为0.1μM；在培养基F中培养8‑12天，优选为10天。

[0065] 具体来说，S3中使用的培养基为培养基G，培养基G在培养基F的基础上再增加促进肺脏类器官成熟的因子。

[0066] 其中，促进肺脏类器官成熟的因子为地塞米松、PDE抑制剂、PKA激活剂。

[0067] PDE抑制剂为IBMX、Rolipram、Sildenafil、Milrinone中的任一种，优选为IBMX；其使用量可以为0.01‑1mM，优选地0.05‑0.2mM，具体优选为0.1mM；

[0068] PKA激活剂可以为cAMP与其盐化物、FSK、CW008、Taxol、Belinostat与其盐化物中的任一种，优选为cAMP；其使用量可以为0.01‑1mM，优选地0.05‑0.2mM，具体优选为0.1mM；

[0069] 地塞米松MK125的使用量可以为10‑1000nM，优选地25‑100nM，具体优选为50nM。

[0070] 特别地，ECM为三层结构，从下至上分别为A层、B层和C层；

[0071] A层为100% Matrigel；

[0072] B层为S2形成的肺芽和体积比40%的Matrigel、体积比40%的I型胶原蛋白、体积比20%的III型胶原蛋白；

[0073] C层为100% Matrigel。

[0074] 使用时，依次于12孔transwell上层小室加入层A、B、C；期间分别静置10min、60min、10min使其完全凝固。此后，上下小室均加入阶段3诱导培养基。

[0075] 下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

[0076] 然而，以下实施例仅用于说明本发明，本发明的内容不限于此。

[0077] 实施例中用到的相关试剂示于表1和表2，使用的相关抗体示于表3。

[0078] 实施例1 多谱系肺类器官的构建

[0079] 1.1 产生多谱系肺类器官

[0080] 在肺上皮类器官诱导分化因子的基础上，通过三个方面的创新实现上皮细胞+内皮细胞+免疫细胞的人多谱系肺类器官诱导分化：1）基础培养基：加入适合中胚层谱系生长的培养基EGM2，2）诱导因子：加入血管内皮细胞与巨噬细胞诱导分化的共性因子EGF、VEGF、bFGF，3）ECM（细胞外基质）：加入Collagen I（I型胶原蛋白）和Collagen III（III型胶原蛋白），促进多谱系成熟。

[0081] 本实施例整体分为3个阶段，历时天：

[0082] S1（阶段1）：诱导hPSC分化为定形内胚层（Day 1‑2）

[0083] 待hPSC汇合度达40‑70%，可启动分化。具体的，本实施例待hPSC汇合度达40%，依次加入S1阶段的培养基A和培养基B中进行诱导分化。

[0084] S11（Day 1）：

[0085] 将人多能干细胞在培养基A中培养24h，培养基A为添加有100ng/ml的rhGDF8、3μM的CHIR99021的RPMI‑1640培养基。

[0086] S12（Day 2）：

[0087] 之后在培养基B中继续培养24h，培养基B添加有100ng/ml的rhGDF8、10ng/ml的rhFGF2、50μg/ml的维生素C（AA），且培养基B为含有2%（体积比）SM1的RPMI‑1640。

[0088] S2（阶段2）：诱导定形内胚层分化为肺芽（Day 3‑17）

[0089] S21（Day 3）：

[0090] 该阶段使用培养基C培养24h，培养基C添加有200ng/ml的NOG、10μM的SB431542，且培养基C包含0.5%（体积比）N2(A)、1%（体积比）SM1、75%（体积比）IMDM、23.5%（体积比）EGM2和0.05%（固液比）BSA、0.4μM的MTG。

[0091] S22（Day 4）：

[0092] 该阶段使用培养基D培养24h，培养基D添加有1μM的IWP2、10μM的SB431542、1μM的ATRA，且培养基D包含0.5%（体积比）N2(A)、1%（体积比）SM1、75%（体积比）IMDM、23.5%（体积比）EGM2和0.05%（固液比）BSA、0.4μM的MTG。

[0093] S23（Day 5‑7）：

[0094] 再使用培养基E继续培养3天，每24h更换培养基。培养基E添加有3μM的CHIR99021、10ng/ml的rhBMP4、10ng/ml的rhKGF、10ng/ml的rhFGF10、1μM的ATRA，且培养基E包含0.5%（体积比）N2(A)、1%（体积比）SM1、75%（体积比）IMDM、23.5%（体积比）EGM2和0.05%（固液比）BSA、0.4μM的MTG。

[0095] 截至第7天（Day7），2D细胞上层出现大量SOX2+、NKX2.1+肺祖细胞构成的实心球（以下称为肺祖细胞球），收集并转入超低吸附培养板中，并继续使用阶段S24培养基培养。

[0096] S24（Day 8‑17）：

[0097] 使用培养基F培养10天，每24‑48h更换培养基。培养基F添加有3μM的CHIR99021、10ng/ml的rhBMP4、10ng/ml的rhKGF、10ng/ml的rhFGF10、10ng/ml的rhEGF、15ng/ml的rhVEGF、5ng/ml的bFGF、0.1μM的ATRA，培养基F包含0.5%（体积比）N2(A)、1%（体积比）SM1、
75%（体积比）IMDM、23.5%（体积比）EGM2和0.05%（固液比）BSA、0.4μM的MTG。

[0098] 截至第17天（Day17），肺祖细胞球将分化为表达EpCAM+、NKX2.1+、FOXA1+、SOX9+囊状肺芽，进入S3阶段。

[0099] S3：诱导肺芽分化为多谱系肺脏类器官（Day 18‑60）

[0100] ECM制作与肺芽包被：

[0101] ECM分为三层，各层组分为：

[0102] A层：100% Matrigel；

[0103] B层：Day17肺芽+40% Matrigel+40%Collagen I（2.0 mg/ml）+20% Collagen III（2.0 mg/ml）；

[0104] C层：100% Matrigel。

[0105] 依次于12孔transwell上层小室加入层A、B、C；期间分别静置10min、60min、10min使其完全凝固。此后，上下小室均加入S2阶段的培养基G。

[0106] Day 18‑60：

[0107] 最后用培养基G培养43天，每24‑72h更换培养基。培养基G添加有3μM的CHIR99021、10ng/ml的rhBMP4、10ng/ml的rhKGF、10ng/ml的rhFGF10、10ng/ml的rhEGF、15ng/ml的rhVEGF、5ng/ml的bFGF、0.1μM的ATRA、50nM的MK125、0.1mM的IBMX、0.1mM的cAMP，培养基G包含0.5%（体积比）N2(A)、1%（体积比）SM1、75%（体积比）AECGM、23.5%（体积比）EGM2和0.05%（固液比）BSA、0.4μM的MTG。

[0108] 截至第60天（Day 60），可获得兼具近端与远端结构的人多谱系肺类器官。

[0109] 1.2 类器官样本质量检定

[0110] 每批次类器官需进行下列质检：

[0111] 1）形态表征检定：取Day60肺类器官，光镜下通过形态外观检定其结构完整性。

[0112] 结果判读：当其兼具远端的肺泡样结构与近端的气管样结构时，视为过检。

[0113] 2）谱系构成检定：取Day60类器官，通过切片后的免疫荧光/免疫组化染色技术检定谱系多样性。

[0114] 具体地，使用4%多聚甲醛固定后，采用冰冻或石蜡切片方法将样本制成3‑8μm的切片。此后，使用0.5%Triton透化、5%驴血清封闭、并依次通过谱系特异性标志物的一抗与相应二抗标记，在显微镜下鉴定。

[0115] 结果判读：当类器官兼具呼吸道远端与近端主要上皮细胞类型以及肺驻留巨噬细胞时，视为过检。

[0116] 这些细胞包括：I型肺泡细胞（PDPN+）、II型肺泡细胞（SP‑B+）、基底细胞（P63+）、纤+ + + +毛细胞（acTUB）、杯状细胞（MUC5AC）、棒状细胞（CC10）、神经内分泌细胞（CHGA）以及巨噬+
细胞（CD68）等。

[0117] 通过以上2项质检的批次，可进行药效筛选步骤。

[0118] 实施例2以抗纤维化药物吡非尼酮为例，利用博来霉素纤维化模型进行药效测试[0119] 2.1 纤维化造模与药物处理

[0120] 类器官过检后，平行设置为3组：对照组、造模组、以及药物组（每组类器官数n≥3）。

[0121] 在培养基G基础上，各组分别加入PBS、50μg/ml博来霉素以及50μg/ml博来霉素+测试药物（本实施例采用的抗纤维化药物为100μg/ml吡非尼酮）；连续孵育类器官20天，期间每48h更换培养基。

[0122] 2.2 纤维化模型质量检定

[0123] 肺纤维化血清标志物检定：取对照组与造模组的培养上清（要求类器官数n≥3），采用ELISA技术检测上清中至少2种经典肺纤维化血清标志物的含量，标志物可选择譬如KL6、CCL18、TGF‑β1、PDGF、MMP7、SP‑D等。检测方法遵循相应试剂盒的操作说明。

[0124] 结果判读：当造模组上清中肺纤维化血清标志物的含量显著高于对照组时（P＜0.05），表明纤维化程度明显，视为过检。

[0125] 2.3 药效分析

[0126] 模型过检后，可选择地，通过以下1‑3种方法考察药效。

[0127] 1）病理染色分析：

[0128] 采用Masson（马松）/Sirius Red（天狼星红）/H&E（苏木精‑伊红）染色等病理染色方法对样本切片染色（要求类器官数n≥3），染色方法遵循相应试剂盒的操作说明；分析各组中类器官的细胞/组织形态改变以及胶原沉积情况，并通过ImageJ软件基于胶原沉积面积进行定量分析（要求类器官数n≥3，每个类器官切片染色数n≥3）。

[0129] 结果判读：当药物组胶原沉积面积显著少于造模组时（P值＜0.05），表明存在抗纤维化效应。

[0130] 2）纤维化相关标志物免疫染色分析：

[0131] 操作方法同“1.2”，通过纤维化标志物染色，标志物可选择A.胶原沉积标志物，譬如COL1、COL3、FN等；B.肌成纤维细胞标志物，譬如α‑SMA、FAP等；C.上皮‑间质转化标志物，譬如SLUG、SNAIL、TWIST等；D.间质标志物，譬如VIM、PDGFRα/β、THY1、DES等，比较各组类器官的表达情况，并通过Image J软件基于阳性信号进行定量分析（要求类器官数n≥3，每个类器官切片染色数n≥3）。

[0132] 结果判读：在选定标志物表达模式正确的前提下，当药物组阳性信号面积显著少于造模组时（P＜0.05），视为存在相应药效。

[0133] 如：选择A类标志物COL1与C类标志物SLUG进行免疫荧光染色，在染色结果分别呈现细胞外基质表达与细胞核表达的前提下，定量分析结果呈现药物组阳性信号面积显著少于造模组（P值均＜0.05），则表明该药物存在抗胶原沉积效应、可有效抑制上皮‑间质转化。

[0134] 3）肺纤维化血清标志物分析：操作方法同“2.2”。

[0135] 结果判读：当药物组上清中肺纤维化血清标志物的含量均显著低于造模组时（P＜0.05），视为存在抗肺纤维化疗效。

[0136] 实施例3 以抗纤维化药物尼达尼布为例，利用TGF‑β1纤维化模型进行药效测试[0137] 3.1 纤维化造模与药物处理

[0138] 类器官过检后，平行设置为3组：对照组、造模组、以及药物组（每组类器官数n≥3）。

[0139] 在培养基G基础上，各组分别加入PBS、50ng/ml TGF‑β1、以及50ng/ml TGF‑β1+测试药物（本实施例采用的抗纤维化药物为1μM尼达尼布）；连续孵育类器官20天，期间每48h更换培养基。

[0140] 3.2 纤维化模型质量检定

[0141] 操作方法同“2.2”。

[0142] 3.3 药效分析

[0143] 操作方法同“2.3”。

[0144] 结果与分析：

[0145] 1、取Day60肺类器官进行样本质检：

[0146] 1）形态表征检定结果表明：其兼具远端的肺泡样结构与近端的气管样结构（图1），故判定为通过该项检定。

[0147] 2）冰冻切片后的免疫荧光的检定结果表明：该肺类器官不仅包含呼吸道远端与近+ + + +端的主要上皮细胞类型（PDPNI型肺泡细胞、SPBII型肺泡细胞、acTUB纤毛细胞、CC10 棒+ + +
状细胞、CHGA神经内分泌细胞、MUC5AC杯状细胞、P63 基底细胞，如图2中A‑G图），还兼具肺+
驻留巨噬细胞（CD68，图2中H图），故视为过检。

[0148] 2、利用博来霉素纤维化模型进行药效测试

[0149] A.过检类器官经造模后，进行模型质检：

[0150] 如图3，ELISA检测结果明，与对照组相比，造模组上清中KL6、CCL18、以及TGF‑β1等纤维化血清标志物的含量显著上升，组间P均＜0.01，表明出现明显肺纤维化，故视为过检。

[0151] B.纤维化模型过检后，进入药效分析。

[0152] 1）病理染色以Masson染色为例，其结果表明：

[0153] 图4表明：与对照组相比，造模组原本排列有序的上皮发生结构皱缩、形成了实质化结构；其中呈现梭形的间质样细胞数量明显增多，胶原沉积面积明显增加。而与造模组相比，药物组在结构上尚未完全实质化，仍具大量可识别的上皮样组织结构，尽管内部呈现出柱状上皮细胞的排列错乱。

[0154] 图5定量结果表明：与造模组相比，药物组胶原沉积面积显著更少（P＜0.01），因此吡非尼酮具有抗纤维化疗效。

[0155] 2）免疫染色以免疫荧光为例，其染色结果表明：

[0156] 在COL1A标志物表达模式正确，定位于细胞外基质（图6中A‑C图）。

[0157] 图7荧光定量结果表明：药物组的荧光信号面积显著少于造模组（P＜0.001），因此吡非尼酮具有抗胶原沉积效应。

[0158] 3）肺纤维化血清标志物分析中，以经典肺纤维化血清标志物KL6与CCL18为例，药物组培养上清中二者含量均显著低于造模组（分别是P＜0.01与P＜0.05，如图8），因此吡非尼酮具有抗肺纤维化疗效。

[0159] 3、利用TGF‑β1纤维化模型进行药效测试

[0160] A.过检类器官经造模后，进行模型质检：

[0161] 如图9，ELISA检测结果明，与对照组相比，造模组上清中KL6、CCL18以及PDGF等纤维化血清标志物的含量显著上升，组间P均＜0.01，表明出现明显肺纤维化，故视为过检。

[0162] B.纤维化模型过检后，进入药效分析。

[0163] 1）病理染色以Masson染色为例，其结果表明：

[0164] 图10表明：与对照组相比，造模组原本排列有序的上皮发生结构皱缩、呈现实质化，并出现大量胶原沉积。而与造模组相比，药物组在结构上具有可识别的柱状上皮组织结构，但其内部柱状上皮细胞仍呈现排列错乱。

[0165] 图11定量结果表明：与造模组相比，药物组胶原沉积面积显著更少（P＜0.01），因此尼达尼布具有抗纤维化疗效。

[0166] 2）免疫染色以免疫荧光为例，其染色结果表明：

[0167] 在COL3A标志物表达模式正确，定位于细胞外基质（图12中A‑C图）。

[0168] 图13荧光定量结果表明：药物组的荧光信号面积显著少于造模组P＜0.01），因此尼达尼布具有抗胶原沉积效应。

[0169] 3）肺纤维化血清标志物分析中，以经典肺纤维化血清标志物KL6与PDGF为例，药物组培养上清中二者含量均显著低于造模组（P＜0.05与P＜0.01，如图14），因此尼达尼布具有抗肺纤维化疗效。

[0170] 基于以上药效分析结果，可判定为存在抗肺纤维化疗效，即可根据药物靶点与相应分子机制进行靶点验证、特意性验证等后续分析验证。

[0171] 表1 试剂列表

[0172]

[0173] 表2 试剂对应名称

[0174]

[0175]

[0176] 表3 抗体列表

[0177]

[0178] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。