一种罗非鱼Igλ单克隆抗体及应用

摘要

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种罗非鱼Igλ单克隆抗体及应用，所述的单抗由杂交瘤细胞株（CCTCC NO:C202137）分泌获得，该抗体能够特异性识别血清中Igλ链及组织中Igλ+ B细胞，进一步的使用鼠抗Igλ的单抗检测了无乳链球菌感染后罗非鱼血清中识别无乳链球菌表面抗原Sip的抗体水平，结果显示罗非鱼血清中识别Sip的抗体水平显著增加，表明此抗体可以用于检测罗非鱼免疫后的抗体水平，为罗非鱼疫苗的研发和免疫效果的评价奠定了基础。

权利要求

1.一株杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株的保藏编号为：CCTCC NO: C202137。

2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌得到的单抗。

3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单抗在制备检测罗非鱼免疫球蛋白Igλ试剂盒中的应用。

+

4.根据权利要求3所述的应用，是用于制备罗非鱼Igλ B细胞的分选试剂盒。

+

5.根据权利要求3所述的应用，是用于制备罗非鱼Igλ B细胞比例分析试剂盒。

6.根据权利要求3所述的应用，用于制备检测研究罗非鱼免疫后的抗体水平试剂盒。

说明书

一种罗非鱼Igλ单克隆抗体及应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程技术领域，涉及一种罗非鱼Igλ单克隆抗体及应用。

背景技术

[0002] 罗非鱼(Oreochromis mossambicus)是世界性经济鱼类，具有生长快、肉质好、繁殖能力强、适应性广等优点。但近年来病害频发，其中由无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)引起的链球菌病尤为突出，给养殖户造成巨大的经济损失。由于抗生素的不断使用，抗生素耐药性问题日益严重，严重影响水产养殖业的可持续发展，而疫苗可激活鱼类免疫系统，提高机体针对特定病原的抗病力，将是罗非鱼链球菌病的重要免疫预防手段，也是未来鱼类疾病防控的主流方向。但对于疫苗免疫效果的评价往往过程繁琐，耗时较长，且缺乏评价标准，而以鱼类免疫球蛋白(Ig)的单克隆抗体为基础，通过分析被接种疫苗的鱼类的血液和黏液中抗体(分泌到体液中的抗原特异性Ig)水平变化规律来评价疫苗免疫效果的方法，将为建立罗非鱼疫苗免疫效果的评价标准体系提供有力的工具。因此对罗非鱼Ig单克隆抗体的研究有助于深入了解罗非鱼体液免疫应答规律，并能帮助建立罗非鱼抗体分析与检测方法，继而建立以罗非鱼抗体水平为基础评价疫苗免疫效果的方法，推动罗非鱼免疫诊断与疫苗接种等疫病防控技术的发展。

[0003] 硬骨鱼类含有3种免疫球蛋白，即：IgM、IgT和IgD，其中起抗体功能的主要为IgM和IgT。现有研究表明，硬骨鱼类IgM主要在系统免疫中起功能，而IgT主要在黏膜免疫中起功能。很多疫苗，尤其是口服和浸泡疫苗，能同时激活机体的系统免疫和黏膜免疫，因此，要准确评价此类疫苗的接种效果，就需要同时检测IgM和IgT的抗体滴度，这需要同时有这两类Ig的抗体，且制备和检测都费时费力。

[0004] 鱼类Ig轻链包括Igλ、Igσ和Igκ三个亚型，由于鱼类Ig轻链的恒定区只有一个Ig结构域，而重链恒定区至少含有4个Ig结构域，因此在单抗筛选过程中针对轻链的杂交瘤细胞较少，所以抗鱼类Ig轻链的单克隆抗体比抗重链的单克隆抗体更难获得。到目前为止，已报道的能识别鱼类Ig轻链的单克隆抗体只有抗斑点叉尾鮰Igσ和Igκ的单克隆抗体，尚无针对Igλ的单克隆抗体。

发明内容

[0005] 本发明针对现有技术中罗非鱼Igλ单克隆抗体缺失的问题，提供了一种分泌鼠抗罗非鱼Igλ单克隆抗体的杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为：CCTCC NO:C202137。

[0006] 本发明的另一个目的在提供了罗非鱼Igλ单克隆抗体，其由保藏编号为：CCTCC NO:C202137的杂交瘤细胞分泌得到。

[0007] 本发明的最后一个目的在于提供了上述杂交瘤细胞分泌的单抗在检测罗非鱼免疫球蛋白Igλ中的应用。

[0008] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

[0009] 申请人利用纯化的天然罗非鱼IgM作为抗原，免疫小鼠，进行阳性B细胞、WB、单抗产量等条件的筛选，最终获得了一株杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的单抗，特异性地识别Igλ，单抗产量大，效价高，上述杂交瘤细胞，已于2021年01月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名：杂交瘤细胞株4‑6，保藏编号为：CCTCC NO:C202137，地址为：中国武汉武汉大学。

[0010] 本发明的保护范围还包括：由保藏编号为：CCTCC NO:C202137的杂交瘤细胞分泌得到的单抗。

[0011] 上述杂交瘤细胞分泌的单抗在检测罗非鱼免疫球蛋白Igλ中的应用，包括可利用+ +上述单抗进行罗非鱼IgλB细胞的分选，或是分析罗非鱼IgλB细胞比例，或是用于研究罗非鱼免疫后的抗体水平。

[0012] 以上所述的应用，均可将上述杂交瘤细胞，或是杂交瘤细胞分泌的单抗制备成相关的检测试剂盒。与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0013] 本发明针对现有技术中罗非鱼Igλ单克隆抗体缺失的问题，采用天然的罗非鱼IgM作为抗原免疫小鼠并筛选得到了一株可特异性分泌鼠抗罗非鱼Igλ单克隆抗体的杂交瘤细胞株4‑6，所述杂交瘤细胞株4‑6分泌产生的单克隆抗体可特异性地识别罗非鱼Igλ，而不与罗非鱼的其他蛋白(包括IgM的H链)发生反应，并且效价高，纯化后的效价为128000，因此可用于特异性检测罗非鱼Igλ及罗非鱼免疫后的抗体水平，特异性高，反应灵敏，为罗非鱼疫苗的研发和免疫效果的评价奠定了基础。此外，该鼠抗罗非鱼Igλ单克隆抗体可用于特异性+ +检测罗非鱼IgλB细胞，实现对罗非鱼IgλB细胞的分离与功能研究。

[0014] 识别IgM和IgT共用的Igλ的单抗，可准确评价疫苗的接种效果，省时省力且结果精准可靠。

附图说明

[0015] 图1为本发明实施例1中SDS‑聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)在还原条件下分析罗非鱼血清中纯化的IgM的重链(Igμ)和轻链(Igk、Igλ和/或Igσ)，然后用考马斯亮蓝染色的结果图；

[0016] 图2为本发明实施例3中通过免疫印迹(Western blot)分别在还原和非还原条件下用鼠抗罗非鱼Igλ单克隆抗体检测纯化的罗非鱼IgM的L链和多聚体的结果图；

[0017] 图3为本发明实施例4中原核表达罗非鱼轻链Igκ和Igλ恒定区蛋白的考马斯亮蓝染色结果，然后使用鼠抗罗非鱼Igλ单克隆抗体只识别Igλ；

[0018] 图4为本发明实施例5中使用鼠抗罗非鱼Igλ单克隆抗体分选罗非鱼头肾白细胞，将淋巴细胞分为Igλ阳性(Positive)和阴性(Negative)两个类群的结果图；

[0019] 图5为本发明实施例5中定量分析所分选的罗非鱼头肾中Igλ阳性(Positive)细胞和阴性(Negative)细胞中CD4、CD8以及IgT、IgM1、IgM2的H链基因和L链基因(Igκ、Igλ)表达情况的结果图，以β‑actin为内参，显示的值为四条鱼的平均值±标准差，“*”表示差异显著(p<0.05)。

[0020] 图6为本发明实施例6中流式细胞术检测罗非鱼头肾、脾脏和外周血中的白细胞。A：将头肾白细胞用鼠抗罗非鱼IgM重链单克隆抗体(购自Aquatic Diagnostics公司)和鼠抗罗非鱼Igλ单克隆抗体共同染色的结果；B：将脾脏白细胞用鼠抗罗非鱼IgM重链单克隆抗体和鼠抗罗非鱼Igλ单克隆抗体共同染色的结果；C：将外周血白细胞用鼠抗罗非鱼IgM重链+
单克隆抗体和鼠抗罗非鱼Igλ单克隆抗体共同染色的结果；D：头肾、脾脏和外周血中IgMIg+ + + ‑ +
λB细胞占总的IgMB细胞的比例以及IgλIgMB细胞占总的IgλB细胞的比例。显示的值为四条鱼的平均值±标准差，“*”表示差异显著(p<0.05)。

[0021] 图7为本发明实施例7中对照组(PBS)和感染组(S.agalactiae)罗非鱼血清中无乳链球菌表面免疫原性蛋白Sip特异性抗体的ELISA检测结果。

具体实施方式

[0022] 下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

[0023] 实施例1：

[0024] 天然罗非鱼IgM的纯化

[0025] (1)罗非鱼血清中IgM的分离和纯化

[0026] 1)亲和柱的准备：将5mg Protein A+G Agarose(购自碧云天生物技术有限公司)用5mL 10mM PBS‑20mM EDTA(pH 7.4)悬浮，然后吸入PD‑10纯化柱中，并用5倍柱体积的10mM PBS‑20mM EDTA(pH7.4)流穿平衡柱子；

[0027] 2)共孵育：将平衡好的柱料用5mL 10mM PBS‑20mM EDTA(pH 7.4)重悬，然后加到用PBS按1:1的比例稀释的罗非鱼血清中，于4℃共旋转孵育过夜，使血清中的抗体与Protein A+G充分结合，孵育后将混合物转移至PD‑10纯化柱中流穿；

[0028] 3)中性洗脱：用10倍柱体积的10mM PBS‑20mM EDTA(pH 7.4)进行洗涤，除去非特异性吸附的杂蛋白；

[0029] 4)酸性洗脱：用100mM glycine(pH 2.5)作为洗脱液，每管500μL收集洗脱的IgM，并且立即用1M Tris调节pH至中性；

[0030] 5)脱盐：将洗脱得到的IgM立即在PD‑10脱盐柱上脱盐，将IgM置换于PBS溶液中，4℃暂存。

[0031] (3)纯化后罗非鱼IgM的检测

[0032] 采用SDS‑PAGE法检测血清中IgM的纯化效果。配制12％ Tris‑甘氨酸聚丙烯酰胺下层分离胶和5％上层浓缩胶。取收集的样品与还原型蛋白上样缓冲液(含β‑巯基乙醇)按比例加入，于100℃恒温金属浴加热10min，瞬时离心后上样进行电泳，电泳电压为120V，电泳时间1h，电泳后用考马斯亮蓝染色液染色，再用沸水脱色后成像。

[0033] 罗非鱼IgM纯化结果如图1所示，在还原条件下分为IgH链和IgL链两条主带，重链大小约75kD，轻链大小约27kD，该大小与之前报道的其他硬骨鱼类IgM的H链和L链的分子量范围一致。

[0034] 实施例2：

[0035] 鼠抗罗非鱼Igλ单克隆抗体的制备

[0036] (1)小鼠免疫

[0037] 用亲和纯化的罗非鱼IgM免疫7～8周龄的健康雌性BALB/c小鼠3次，每次间隔2周，首免加弗氏完全佐剂，二免、三免加弗氏不完全佐剂，二免后开始采血以检测抗体产生情况。

[0038] (2)细胞融合

[0039] 融合前3～5d准备饲养细胞，按照常规方法取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞铺于96孔细胞培养板中待用。断颈处死抗体阳性小鼠，无菌取其脾脏细胞，脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按5:1的比例用PEG‑4000进行融合，融合后的细胞铺于准备好的饲养细胞上。

[0040] (3)阳性杂交瘤细胞株的筛选及克隆

[0041] 用纯化的罗非鱼IgM包被聚苯乙烯板，收取融合后第10～15d的细胞培养上清进行间接ELISA检测；将检测为阳性的杂交瘤细胞扩大培养，同时用有限稀释法进行阳性杂交瘤细胞的克隆，至少克隆3轮，将克隆好的阳性杂交瘤细胞及时冻存。

[0042] 申请人已于2021年01月27日将本发明筛选出的杂交瘤细胞送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO:C202137，分类命名：杂交瘤细胞株4‑6，地址为：中国，武汉，武汉大学。

[0043] (4)单克隆抗体的大量生产

[0044] 给10周龄左右的健康BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡，0.5mL/只，1周后给每只预处7
理小鼠腹腔注射5×10 个杂交瘤细胞，10～14天后当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，隔2d抽1次，抽取的腹水于10000r/min离心10min，取上清进行亲和层析纯化，即得所述鼠抗罗非鱼Igλ单克隆抗体，纯化后单抗的效价为1:128000。

[0045] 实施例3：

[0046] 鼠抗罗非鱼Igλ单克隆抗体的鉴定

[0047] 1抗体亚类

[0048] 将纯化的罗非鱼IgM包被至ELISA板中，4℃孵育过夜；用洗涤液洗涤3次，随后每孔加入100μL鼠抗罗非鱼Igλ单克隆抗体，37℃孵育1h；洗涤3次后分别加入稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA和IgM单克隆抗体，每孔100μL，37℃孵育1h；洗涤3次后，每孔加入100μL TMB显色液(购自碧云天生物技术有限公司)，37℃避光孵育30min；随后每孔加入50μL终止液(2M H2SO4)终止反应。用酶标仪在450nm波长下检测吸光值，以阳性反应孔所用的HRP标记的羊抗鼠Ig亚类为待测抗体类别。鉴定结果表明，本发明制备的鼠抗罗非鱼Igλ单克隆抗体亚类为IgG2a。

[0049] 2Western blot检测

[0050] (1)制备血清样品

[0051] 制备健康罗非鱼的血清，用PBS稀释20倍后，分别加入1/4体积的5×还原(Reducing)型和非还原(Non‑reducing)型SDS‑PAGE上样缓冲液，涡旋混匀，100℃金属浴10min，置于冰上备用或‑80℃冻存。

[0052] (2)SDS‑PAGE

[0053] 分别配制12％和8％ Tris‑甘氨酸聚丙烯酰胺下层分离胶和5％上层浓缩胶。上样进行电泳，电泳电压为80V，0.5h；120V，1h。

[0054] (3)转膜

[0055] 将SDS‑PAGE胶从胶板中卸下，浸泡在事先配制好的转膜缓冲液(25mM Tris，192mM甘氨酸，15％甲醇)中，取0.22μm的PVDF膜，裁剪至合适大小，于甲醇中浸泡30s，再转入转膜缓冲液。按照滤纸‑PVDF膜‑胶‑滤纸的顺序从下往上排列，保证每层都不能有气泡，300mA半干转膜60min，将SDS‑PAGE胶上的蛋白转移至PVDF膜上。

[0056] (4)封闭

[0057] 转膜完成后，将PVDF膜转入含5％脱脂奶粉的TBST(25mM Tris，150mM NaCl，0.1％ Tween‑20)溶液中，室温孵育2h。

[0058] (5)一抗孵育

[0059] 弃去封闭液，用含5％脱脂奶粉的TBST溶液将鼠抗罗非鱼Igλ单克隆抗体稀释到2μg/mL，4℃孵育过夜。

[0060] (6)二抗孵育

[0061] 去除一抗溶液，TBST洗膜3次，每次约10min，取HRP标记的羊抗鼠IgG(H+L)抗体(购自Thermo Fisher Scientific公司)按1:5000的比例用含5％脱脂奶粉的TBST溶液稀释，室温孵育1h。

[0062] (7)ECL显色

[0063] 去除二抗溶液，TBST洗膜3次，每次10min，按1:1配制适量的ECL显色液(购自Biosharp公司)，将显色液滴加到膜上，充分接触后使用化学发光成像仪分析并拍照。

[0064] 鼠抗罗非鱼Igλ单克隆抗体对罗非鱼IgM的识别情况如图2所示，在还原条件下该单克隆抗体识别的是罗非鱼IgM的L链，大小约27kD。在非还原条件下，该单克隆抗体可以识别IgM的单聚体和多聚体形式。实施例4：鼠抗罗非鱼Igλ单克隆抗体仅识别Igλ[0065] 1.原核表达

[0066] (1)表达载体构建

[0067] 以罗非鱼的头肾cDNA为模板，在正反向引物的5’末端分别加入EcoR I和Not I限制性酶切位点(IgκF：ATAGAATTCAGTGATACCCGTCCCATCCT，IgκR：ATAGCGGCCGCTCAGGACTGGGAACACTGGA；IgλF：ATAGAATTCTCCAGCCTCCCTCCTCCTG，IgλR：

[0068] ATAGCGGCCGCTTCAGTGGAACATTCTGACTTC)，PCR扩增罗非鱼Igκ和Igλ的恒定区。将pET‑32a质粒和PCR产物用EcoR I和Not I进行双酶切，37℃，1h。回收酶切后的产物，将酶切后的载体与基因序列连接，16℃，12h。回收酶切后的产物，将酶切后的载体与基因序列连接，16℃，12h。回收酶切后的产物，将酶切后的载体与基因序列连接，16℃，12h。回收酶切后的产物，将酶切后的载体与基因序列连接，16℃，12h。

[0069] (2)转化

[0070] 将连接完成的pET32a‑Igκ和pET32a‑Igλ重组质粒(5μL)转入DH5α(50μL)感受态中，冰上孵育30min，42℃热激90s，立即在冰上冷却3min，加入400μL已灭菌的LB培养基，置于37℃摇床中，100rpm振荡45min，吸取150μL的菌液涂布于含Amp(100μg/mL)的LB平板上，待菌液晾干后倒置放在37℃恒温培养箱中，培养14h。

[0071] (3)阳性质粒筛选

[0072] 将平板上的单菌落用无菌枪头挑选至400μL含Amp(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃摇床中震荡培养4h，取1μL菌液作为模板做PCR验证，将结果呈阳性的菌液送至擎科(武汉)生物科技有限公司测序。

[0073] (4)质粒提取

[0074] 将测序结果正确的菌液扩大培养至50mL含Amp(100μg/mL)的LB液体培养基中，恒温摇床37℃，200rpm培养9h，收集菌体，使用HiPure Plasmid Micro Kit快速质粒小提试剂盒(购自Magen公司)提取质粒。

[0075] (5)诱导表达

[0076] 将提取的质粒(5μL)转入表达菌株BL21(DE3)，具体步骤参考(4)。将阳性克隆接种于500mL含Amp(100μg/mL)的LB液体培养基中，恒温摇床37℃，180rpm培养至菌液OD600＝0.6‑0.8，加入IPTG至终浓度为1mM，诱导蛋白表达，37℃摇床培养4h，收集菌体。

[0077] (6)蛋白纯化

[0078] 将收集的菌体用PBS重悬，至于细胞高压破碎仪破碎，破碎后的菌悬液12000rcf，4℃离心30min，收集上清。将上清与Ni填料(购自汇研生物科技有限公司)室温孵育1h，用120mL含有50mM咪唑的PBS(pH＝7.5)洗杂，用含有300mM咪唑的PBS(pH＝7.5)洗脱蛋白，进行SDS‑PAGE凝胶电泳，检测蛋白纯度。挑选纯度高的蛋白溶液，12000rcf，4℃离心15min，上清吸入2mL无菌注射器，弹出气泡后推入AKTA蛋白纯化仪的上样口，利用分子筛原理纯化蛋白，SDS‑PAGE检测纯化的pET32a‑Igκ和pET32a‑Igλ重组蛋白的纯度(图3)。

[0079] 2.Western blot检测

[0080] (1)制备蛋白样品

[0081] 将纯化的pET32a‑Igκ和pET32a‑Igλ重组蛋白稀释成相同浓度，加入5×还原(Reducing)型SDS‑PAGE上样缓冲液，涡旋混匀，100℃金属浴10min，置于冰上备用或‑80℃冻存。

[0082] (2)SDS‑PAGE

[0083] 配制12％ Tris‑甘氨酸聚丙烯酰胺下层分离胶和5％上层浓缩胶。上样进行电泳，电泳电压为80V，0.5h；120V，1h。

[0084] (3)转膜

[0085] 将SDS‑PAGE胶从胶板中卸下，浸泡在事先配制好的转膜缓冲液(25mM Tris，192mM甘氨酸，15％甲醇)中，取0.22μm的PVDF膜，裁剪至合适大小，于甲醇中浸泡30s，再转入转膜缓冲液。按照滤纸‑PVDF膜‑胶‑滤纸的顺序从下往上排列，保证每层都不能有气泡，25V半干转膜15min，将SDS‑PAGE胶上的蛋白转移至PVDF膜上。

[0086] (4)封闭

[0087] 转膜完成后，将PVDF膜转入含5％脱脂奶粉的TBST(25mM Tris，150mM NaCl，0.1％ Tween‑20)溶液中，室温孵育2h。

[0088] (5)一抗孵育

[0089] 弃去封闭液，用含5％脱脂奶粉的TBST溶液将鼠抗罗非鱼Igλ单克隆抗体稀释到2μg/mL，4℃孵育过夜。

[0090] (6)二抗孵育

[0091] 去除一抗溶液，TBST洗膜3次，每次约10min，取HRP标记的羊抗鼠IgG(H+L)抗体(购自Thermo Fisher Scientific公司)按1:5000的比例用含5％脱脂奶粉的TBST溶液稀释，室温孵育1h。

[0092] (7)ECL显色

[0093] 去除二抗溶液，TBST洗膜3次，每次10min，按1:1配制适量的ECL显色液(购自Biosharp公司)，将显色液滴加到膜上，充分接触后使用化学发光成像仪分析并拍照。结果表明鼠抗Igλ单克隆抗体仅识别Igλ，不识别Igκ(图3)。

[0094] 实施例5：

[0095] 鼠抗罗非鱼Igλ单克隆抗体将淋巴细胞分为阳性和阴性两个类群

[0096] (1)将用Percoll密度梯度离心分离的罗非鱼头肾白细胞分装在流式管中，用2mL8
含2％胎牛血清(FBS)的PBS重悬约10个细胞；

[0097] (2)加入鼠抗罗非鱼Igλ单克隆抗体，抗体终浓度为2μg/mL，冰上孵育60min，每15min涡旋混匀一次；(3)用4mL PBS冲洗两次；

[0098] (4)二抗孵育，用1mL含2％ FBS的PBS重悬，加入APC标记的羊抗鼠IgG(购自BioLegend公司)，终浓度为2μg/mL，避光在冰上孵育30min，每15min涡旋混匀一次；

[0099] (5)避光用4mL PBS冲洗两次；

[0100] (6)用4mL PBS重悬细胞，透过细胞滤网后用流式细胞仪分选；

[0101] (7)流式细胞分选时，准备15mL离心管收集分选的细胞，预先在离心管中装约5mL的PBS；

[0102] (8)离心收集分选的细胞，进行后续的RNA提取和荧光定量PCR等实验操作。

[0103] 流式细胞分选结果如图4所示，该鼠抗罗非鱼Igλ单克隆抗体可以将罗非鱼头肾淋巴细胞分为Igλ阳性细胞和阴性细胞。这两个类群细胞中免疫相关基因的表达情况如图5所示，CD4和CD8基因在Igλ阴性的细胞中高表达，而阳性细胞中的表达量很少。相反地，免疫球蛋白IgT、IgM1、IgM2的H链基因和L链Igκ和Igλ基因则在阳性细胞中表达高于阴性细胞，表+ +明Igλ抗体同时识别了大部分IgM和IgTB细胞。在Igλ阳性细胞中Igλ的表达水平显著高于Igλ阴性细胞。

[0104] 实施例6：

[0105] 鼠抗罗非鱼Igλ单克隆抗体分析IgM+、Igλ+和IgM+Igλ+B细胞的比例[0106] (1)将用Percoll密度梯度离心分离的罗非鱼头肾、脾脏和外周血的白细胞分装在6
流式管中，用含2％ FBS的PBS调细胞浓度为4×10细胞/mL；

[0107] (2)将细胞悬液分装到1.5mL EP管中，每管200μL，分别加入鼠抗罗非鱼IgM重链单克隆抗体(IgG1亚型)和鼠抗罗非鱼Igλ单克隆抗体(IgG2a亚型)，抗体终浓度为2μg/mL，冰上孵育45min，每15min涡旋混匀一次；

[0108] (3)用含2％ FBS的PBS洗两次后重悬到200μL，分别加入APC标记的羊抗鼠IgG1抗体(购自Jackson公司)和FITC标记的羊抗鼠IgG2a抗体(购自Jackson公司)，抗体终浓度为2μg/mL，避光在冰上孵育30min，每15min涡旋混匀一次；

[0109] (4)用含2％ FBS的PBS洗两次后重悬到200μL，透过细胞滤网后用流式细胞仪检测。

[0110] 检测结果如图6所示，根据双染结果显示，头肾和外周血中IgM+Igλ+B细胞占总IgM+‑ + +B细胞的约30％，而脾脏中比例约为45％；头肾和外周血中IgM IgλB细胞占Igλ B细胞的约
45％，脾脏中比例约为25％。

[0111] 实施例7：ELISA检测罗非鱼血清抗体水平

[0112] 实验所用罗非鱼体重350±50g，饲养于华中农业大学水产学院养殖基地，暂养2周后开始正式试验。将罗非鱼随机分为两组，对照组腹腔注射200μL无菌PBS，感染组腹腔注射8
200μL 1×10cfu/mL无乳链球菌，21d后对照组腹腔注射200μL无菌PBS，感染组腹腔注射
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200μL 1×10cfu/mL无乳链球菌进行二次免疫，14d后分别从对照组和感染组随机抽取10尾鱼进行抽血，制备血清，用于ELISA检测，ELISA检测步骤如下：(1)用包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH 9.6)稀释抗原蛋白(重组无乳链球菌表面免疫原性蛋白Sip)到10μg/mL，酶标板每孔包被100μL蛋白，4℃孵育过夜；

[0113] (2)用PBST(10mM PBS，0.05％ Tween‑20)洗涤5次后，每孔加入250μL含5％脱脂奶粉的PBST溶液，37℃孵育2h；

[0114] (3)用PBST洗涤5次后，将对照组血清和免疫组血清分别稀释50倍，每孔加入100μL，用PBS作为空白对照，28℃孵育3h；

[0115] (4)用PBST洗涤5次后，用含5％脱脂奶粉的PBST溶液将鼠抗罗非鱼Igλ单克隆抗体稀释到2μg/mL，每孔加入100μL，37℃孵育1h；

[0116] (5)用PBST洗涤5次后，用含5％脱脂奶粉的PBST溶液按1:2000的比例稀释HRP标记的羊抗鼠IgG(H+L)抗体(购自Thermo Fisher Scientific公司)，每孔加入100μL，37℃孵育1h；

[0117] (6)用PBST洗涤5次后，每孔加入100μL TMB显色液，37℃避光显色30min；

[0118] (7)每孔加入50μL终止液(2M H2SO4)终止反应10min，混匀后用酶标仪在450nm波长下检测吸光值。

[0119] 检测结果如图7所示，感染组血清中Sip特异性抗体水平显著高于PBS对照组血清。