一株具有溶藻能力的假交替单胞菌及其应用

摘要

本发明公开了一种杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)，已于2022年10月31日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC NO.26001；本发明了还公开了一种溶藻菌剂，包含该杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)菌液和/或胞外分泌物。通过“以菌治藻”，利用生物方法治理有害藻华，作为一种环境友好型的有害藻华控制方法，具有相当广阔的应用前景。

权利要求

1.一种杀鱼假交替单胞菌（Pseudoalteromonas piscicida），其特征在于，所述杀鱼假交替单胞菌（Pseudoalteromonas piscicida）于2022年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 26001。

2.一种溶藻菌剂，包含权利要求1所述的杀鱼假交替单胞菌（Pseudoalteromonas piscicida）菌液和/或胞外产物，所述胞外产物为将OD600为1.94‑2.20的杀鱼假交替单胞菌（Pseudoalteromonas piscicida）的菌液离心，将上清液过滤后得到。

3.根据权利要求2所述的溶藻菌剂，其特征在于，所述溶藻菌剂中的杀鱼假交替单胞菌（Pseudoalteromonas piscicida）菌液OD600为1.94‑2.20。

4.权利要求1所述的杀鱼假交替单胞菌（Pseudoalteromonas piscicida）或权利要求

2‑3任一项所述的溶藻菌剂在防治藻类中的应用，所述藻类为赤潮异弯藻（Heterosigma akashiwo）、斯氏异冒藻（Heterocapsa steinii）、浮动弯角藻（Eucampia zoodiacus）、血红哈卡藻（Akashiwo sanguinea）和/或海洋原甲藻（Prorocentrum micans）中的一种或多种。

说明书

一株具有溶藻能力的假交替单胞菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及环境微生物领域，尤其一株具有溶藻能力的假交替单胞菌及其应用。

背景技术

[0002] 赤潮是指某些藻类在水体中会暴发性增殖或聚集，而国际学界则将其中造成危害的赤潮统称为有害藻华。近年来有害藻华已成为一个全球性的科学和环境问题，在我国近海发生的频率和规模明显增加。有害藻华的发生不仅会影响海洋生态系统的稳定，还会影响海洋相关产业的发展，造成经济损失，甚至危害人类健康。甲藻是形成有毒有害赤潮的主要种群，一些甲藻在遇到不利环境时，会在沉积物的表层形成暂时性、可逆的藻类孢囊。伊姆裸甲藻(Gymnodinium impudicum)是形成有害藻华的典型生物之一，其孢囊在我国多个海域都曾被检测到，在我国近海也存在形成大规模有害藻华的风险，开展其赤潮防治等相关研究工作变得尤为重要和迫切。近年来的研究发现，海洋水体中的一些异养细菌和有害藻华的暴发及消亡有着密切的关系，有些细菌在有害藻华的突然消亡过程中起到重要的作用。因此，溶藻细菌可能是调控有害藻华的主要因素之一。

[0003] 目前提出的治理赤潮的方法包括物理法、化学法和生物法。物理方法(围隔法、超声波法、高压除藻法等)不适宜大范围水体治理，在实际应用中受限；化学方法(高锰酸钾、粘土矿物、硫酸铜)虽然高效，但是成本高，不容易被生物降解，存在二次污染的问题。无论是物理方法还是化学方法都会对环境中其他生物造成一定程度的伤害。

发明内容

[0004] 发明目的 ：本发明的 第一目的是提供了一种杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)，用于防治伊姆裸甲藻(Gymnodinium impudicum)。

[0005] 本发明的第二目的是提供一种包含杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)的溶藻菌剂。

[0006] 本发明的第三目的是提供了杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)在防治藻类中的应用。

[0007] 技术方案：本发明提供了一种杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)，2022年10月31日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.26001，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

[0008] 本发明还提供了一种溶藻菌剂，包含所述的杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)菌液和/或胞外分泌物。

[0009] 优选的，所述杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)菌液OD600为1.94‑2.20。

[0010] 优选的，所述胞外分泌物为将OD600为1.94‑2.20的杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)的菌液离心，将上清液过滤后得到。

[0011] 本发明还提供了所述的杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)或所述的溶藻菌剂在防治藻类中的应用。

[0012] 优选的，所述藻类为赤潮异弯藻(Heterosigma  akashiwo)、斯氏异冒藻(Heterocapsa steinii)、浮动弯角藻(Eucampia zoodiacus)、血红哈卡藻(Akashiwo sanguinea)和/或海洋原甲藻(Prorocentrum micans)中的一种或多种。

[0013] 有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)通过生物方法治理有害藻华，对于生态环境友好；(2)杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)的溶藻效率高，实施方法简单，具有极大的应用价值。

附图说明

[0014] 图1为杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)对伊姆裸甲藻细胞形态的影响；对照组(a和c)；杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)添加组(b和d)；

[0015] 图2为杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)16S rDNA构建系统发育树；

[0016] 图3为不同浓度杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)对伊姆裸甲藻的溶藻效果；(a)：不同体积比添加组的藻密度变化；(b)：不同体积比添加组的溶藻率变化；误差代表标准偏差(n＝3)

[0017] 图4为不同生长周期的杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)对伊姆裸甲藻的溶藻效果；图中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别代表不同生长时期；*表示差异显著(p<0.05)；

[0018] 图5为杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)对不同赤潮原因藻的溶藻效果；

[0019] 图6为杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)对伊姆裸甲藻的溶藻方式；

[0020] 图7为杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)对伊姆裸甲藻最大光合效率(Fv/Fm)的影响。

具体实施方式

[0021] 下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

[0022] 实施例1溶藻菌的筛选

[0023] 从江苏连云港近岸海域采集伊姆裸甲藻藻华发生海区的表层海水，将其梯度稀释后涂布，挑取形态差异明显的单一菌落进行划线，获得纯化菌株24株。将各个纯化后的单菌落接种在2216E液体培养基中，28℃、180rpm培养48小时，分别以2％的体积比(200μL菌液添加至2mL伊姆裸甲藻藻液中)在24孔板中进行共培养。利用倒置显微镜观察藻细胞形态变化及其存活情况，并通过藻细胞计数计算溶藻率。溶藻率计算公式：溶藻率(％)＝(Nc‑Nt)/Nc×100％其中Nc和Nt分别代表对照组和实验组藻细胞浓度。藻细胞计数均采用赛吉计数(Sedgewick‑Rafter)法在显微镜下测定藻细胞浓度。藻细胞浓度(cells/mL)＝N×稀释倍数×50，其中N为显微镜下观察藻细胞数的三次平均值。

[0024] 选取其中溶藻效果最好的一株细菌，伊姆裸甲藻与该溶藻菌共培养结果如图1所示，伊姆裸甲藻绝大多数细胞由原来的链状逐渐变成单细胞或短链状，运动能力由强变弱，直到停止运动。细胞形态由椭圆形变成圆形，且细胞鲁格氏染色由深变浅，最终部分细胞破裂，内容物释放。

[0025] 挑取该溶藻菌单菌落于50μL无菌水中，100℃温浴10min后快速转移至冰上，取1μL的细菌裂解液用作模板，利用细菌鉴定通用引物16S‑27F和16S‑1492R进行PCR扩增，对扩增子进行纯化、克隆和测序。该菌株的16s rDNA基因序列，在GenBank中查找到GENE ID为OP615104，与杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida WCPW15003)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.EPP07)的16S rDNA相似性均为100％。16SrDNA进化树分析如图2。

[0026] 该杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)已于2022年10月31日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.26001。

[0027] 本发明的杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)的培养方式如下：

[0028] (1)斜面培养：将杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)的菌种接种于2216E固体斜面培养基上，在28℃条件下培养24小时，于4℃下保存；

[0029] (2)初级培养：用接种环挑取固体斜面培养基上的杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)单菌落于10mL 2216E液体培养基中，28℃下，摇床180rpm培养，培养至对数期(OD600：0.6‑0.7)获得初级培养菌液；

[0030] (3)菌液：将1mL初级培养菌液接种于100mL 2216E液体培养基中，28℃下，摇床180rpm进一步扩大培养。根据其生长曲线(图4a)，培养不同时长可以获得不同浓度的菌液；
培养0‑12h获得对数期(OD600：0‑1.69)菌液，培养12‑52h获得稳定期(OD600：1.69‑2.22)菌液、培养52‑72h获得衰退期(OD600：2.22‑1.82)菌液。

[0031] 上述2216E固体斜面培养基配方为：蛋白胨10g/L、酵母提取物2g/L、硫酸亚铁0.2g/L、琼脂20g/L于无菌天然海水中溶解，121℃高温蒸汽灭菌20min；

[0032] 2216E液体培养基配方为：蛋白胨10g/L、酵母提取物2g/L、硫酸亚铁0.2g/L于无菌天然海水中溶解，121℃高温蒸汽灭菌20min。

[0033] 所用藻种伊姆裸甲藻、赤潮异弯藻、斯氏异冒藻、血红哈卡藻、海洋原甲藻采用f/2‑Si培养基培养，中肋骨条藻和浮动弯角藻采用f/2培养基培养。培养温度20℃，光照强度‑2 ‑1
100±10μE m s ，光暗周期为14：10h，此时以上所有藻种的细胞密度均为8000cells/mL。
在正式开展溶藻实验之前，所有藻种都利用终浓度为200mg/L的氨苄、100mg/L的卡那霉素和100mg/L的链霉素进行预处理，以降低培养体系中细菌污染对实验结果的影响。

[0034] f/2培养基配方：75mg/L NaNO3、5mg/L NaH2PO4·H2O、20mg/L Na2SiO3·9H2O、4.36mg/L Na2EDTA、3.16mg/L FeCl3·6H2O、0.01mg/L CuSO4·5H2O、0.023mg/LZnSO4·
7H2O、0.012mg/L CoCl2·6H2O、0.18mg/L MnCl2·4H2O、0.07mg/L Na2MoO4·2H2O、0.1μg/L维生素B1、0.5μg/L维生素B12、0.5μg/L生物素。以上成分溶解于无菌天然海水，在121℃下高温蒸汽灭菌20分钟。

[0035] f/2‑Si培养基配方：无20mg/L Na2SiO3·9H2O成分，其他与f/2培养基一致。

[0036] 实施例2杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)对伊姆裸甲藻的溶藻效果

[0037] 取实施例1培养48h得到的杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)菌液(OD600：2.20)，以及实施例1培养得到的伊姆裸甲藻藻液(8000cells/mL)。在50mL的伊姆裸甲藻藻液中分别加入0.25mL、0.5mL、1mL、2mL杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)菌液，对照组在50mL的伊姆裸甲藻藻液中分别加入0.25mL、0.5mL、1mL、2mL的无菌2216E液体培养基。每组实验设置3个生物学重复。分别在共培养0h、6h、24h、48h、72h后取样，进行藻细胞浓度计数，并进一步计算溶藻率。

[0038] 结果如图3所示，随着杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)浓度的增加和共培养时间的延长，以1％、2％和4％体积比添加杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)的实验组伊姆裸甲藻密度显著降低，72h溶藻率分别达60.43％、81.06％和95.92％。

[0039] 实施例3杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)对伊姆裸甲藻的溶藻效果

[0040] 分别取实施例1中培养8h(对数期，OD600：1.48)、培养48h(稳定期OD600：2.20)、培养68h(衰退期，OD600：1.94)的杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)菌液，以及实施例1培养得到的伊姆裸甲藻藻液(8000cells/mL)。按照2％的体积比分别将1mL菌液和50mL伊姆裸甲藻藻液共培养。在共培养72h时内统计藻细胞浓度，并计算溶藻率。

[0041] 结果如图 4所示 ，对数期、稳定期、衰退期的杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)群体对伊姆裸甲藻均有溶藻作用。在菌液添加72h后，处于对数生长期的杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)群体溶藻率较低，为
54.65％。处于稳定期和衰退期的杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)群体溶藻率分别达到81.40％和84.88％，显著高于处于对数生长期的杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)群体。

[0042] 实施例4杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)对赤潮藻类的溶藻效果

[0043] 取实施例1培养48h得到的杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)菌液(OD600：2.20)，以2％的体积比分别接种于实施例1培养得到的赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)、斯氏异冒藻(Heterocapsa steinii)、浮动弯角藻(Eucampia zoodiacus)、血红哈卡藻(Akashiwo sanguinea)、海洋原甲藻(Prorocentrum micans)藻液(8000cells/mL)中，即1mL菌液添加至50mL藻液中。每种藻的处理设置三个重复，在48h取样统计藻细胞浓度，并进一步计算溶藻率。

[0044] 结果如图5所示，在添加2％体积比菌液48h后，假交替单胞菌对中肋骨条藻和斯氏异冒藻溶藻效果最为明显，溶藻率分别达99.20％和91.60％，对赤潮异弯藻48h溶藻率达到79.73％。杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)对血红哈卡藻、浮动弯角藻和海洋原甲藻也有一定溶藻效果，但溶藻率均未超过70％；其中对浮动弯角藻的溶藻效果最差，溶藻率仅有约33％。

[0045] 实施例5杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)溶藻方式的研究[0046] 取实施例1培养48h得到的杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)菌液(OD600：2.20)，取实施例1培养得到的伊姆裸甲藻(藻细胞密度为8000cells/mL)，分成4组进行实验。

[0047] 第一组，按照2％的体积比将杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)菌液和藻液共培养，即1mL菌液添加至50mL藻液中；

[0048] 第二组，将15mL的杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)菌液在4200rpm下，离心10min后获得上清液，上清液经孔径0.22μm的滤膜过滤后，取1mL获得的胞外产物添加至50mL伊姆裸甲藻藻液中共培养；

[0049] 第三组，将上述第二组离心过滤后留下来的杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)细胞，加入无菌海水漂洗后，再次加入15mL无菌海水制备
8
菌悬液，取1mL菌悬液(1.92×10cfu/mL)添加至50mL伊姆裸甲藻藻液中共培养；

[0050] 第四组，按照2％的体积比，即1mL无菌2216E培养基添加至50mL伊姆裸甲藻藻液中，作为对照组。

[0051] 根据藻细胞计数结果计算不同组别溶藻率。结果如图6所示，第一组的菌液处理和第二组的上清液处理，溶藻率随时间显著上升；而第三组单纯以漂洗后的杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)细胞处理，溶藻率随时间基本无变化。说明杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)通过分泌胞外溶藻物质间接溶藻。

[0052] 实施例6杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)对伊姆裸甲藻光合效率的影响

[0053] 取实施例1培养48h得到的杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)菌液(OD600：2.20)，取实施例1培养得到的伊姆裸甲藻(藻细胞密度为8000cells/mL)，以2％体积比共培养，即1mL菌液添加至加至50mL藻液中，同时另在50mL伊姆裸甲藻藻液中添加1mL无菌2216E培养基作为对照。分别在共培养6、24、48和72h后取5mL共培养物，利用锡箔纸包裹后在20℃培养箱中暗适应20min后，上下轻轻颠倒混匀藻液，参考AquaFluor仪器说明，测定藻细胞的最大光合效率Fv/Fm值。如图7所示，随着共培养时间的增加，添加杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)的实验组Fv/Fm值显著降低于对照组，说明杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)会抑制伊姆裸甲藻光合效率。