检测MET基因14号外显子跳跃突变的引物、探针及其试剂盒

摘要

本公开涉及一种检测样本中MET基因14号外显子跳跃突变的引物、探针及其试剂盒，具体涉及采用特异性上游引物(跨越13号和15外显子，并在15号外显子引入dI修饰)、下游引物和探针，以及内参基因评估样本中MET基因14号外显子跳跃突变的发生情况。本方法所引入的[dI]修饰使反应体系具有高灵敏度和特异性，仅扩增突变型模板，大大降低假阳性的发生率，提高检测效率。

权利要求

1.一种检测样本中MET基因14号外显子跳跃突变的试剂盒，其包括检测引物和检测探针，所述检测引物包括上游引物和下游引物，其中，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括内参，所述内参包括内参上游引物、内参下游引物和内参检测探针；

所述内参上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

所述内参下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

所述内参检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述的样本检测探针和内参探针的5’端修饰有荧光基团和/或3’端修饰有淬灭基团。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述荧光基团选自以下中的一种：FITC、TET、JOE、R110、FAM、CY‑5、HEX或CY‑3。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述淬灭基团选自以下中的一种：TAMRA、BHQ‑

2、Dabcyl或MGB。

6.体外非诊断目的的检测样本中MET基因14号外显子跳跃突变的方法，包括以下步骤：(1)从待测样本中获取RNA并逆转录为cDNA；

(2)将步骤(1)获取的cDNA、权利要求1‑5所述的用于检测MET基因14号外显子跳跃突变的上游引物、下游引物、检测探针以及任选的内参混合；

(3)进行PCR反应；

(4)检测荧光信号，根据样本检测探针的荧光信号判定检测样本中是否存在MET基因14号外显子跳跃突变。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，步骤(3)中，使用荧光PCR仪或数字PCR仪对样本进行PCR反应。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述待测样本选自肿瘤细胞、血液、血浆、外泌体溶液、胸腔积液、腹腔积液、唾液、尿液、组织中的一种或多种。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述肿瘤细胞为脑星形胶质母细胞瘤、咽头癌、AIDS‑相关癌症、星形细胞瘤、膀胱癌、骨癌、脑和脊髓癌、转移性脑瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、宫颈癌、脊索瘤、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、室管膜细胞瘤、尤文肿瘤、骨纤维发育不全、骨纤维性发育不良、胆囊或胆管癌、胃癌、恶性畸胎癌、卵巢胚胎性肿瘤，病毒性肝炎、肝硬化妊娠滋养细胞病、生殖细胞瘤、头颈癌、胰岛细胞瘤、肾癌、白血病、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、胆道细胞癌、脑膜瘤、多发性内分泌瘤病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺瘤、小儿癌症、外周神经鞘瘤、垂体肿瘤、前列腺癌、黑色素瘤、横纹肌样瘤、肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移性癌或子宫癌细胞中的一种或多种。

10.根据权利要求9所述的方法，所述肉瘤包括软组织肉瘤和软骨肉瘤。

11.根据权利要求10所述的方法，所述软组织肉瘤为腺泡状软组织肉瘤、卡波西肉瘤、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤性肿瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤中的一种或多种。

12.根据权利要求10所述的方法，所述软骨肉瘤为骨外黏液样软骨肉瘤。

13.根据权利要求9所述的方法，所述肝癌为原发性肝癌或肝细胞癌。

14.根据权利要求9所述的方法，所述肾癌为肾上腺肿瘤、肾嫌色细胞癌、肾转移性癌中的一种或多种。

15.根据权利要求9所述的方法，所述神经内分泌肿瘤为成神经细胞瘤、嗜铬细胞瘤中的一种或多种。

16.根据权利要求8所述的方法，所述肿瘤细胞为非小细胞肺癌、肺腺癌、肺肉瘤样癌、胃癌、结直肠癌和/或脑胶质瘤细胞中的一种或多种。

17.根据权利要求8所述的方法，所述肿瘤细胞为非小细胞肺癌细胞。

18.根据权利要求8所述的方法，所述肿瘤细胞为人的肿瘤细胞。

19.权利要求1‑5任一项所述的试剂盒在制备检测MET基因14号外显子跳跃突变的试剂盒中的应用。

说明书

检测MET基因14号外显子跳跃突变的引物、探针及其试剂盒

技术领域

[0001] 本公开属于生物基因检测领域，具体为一种检测MET基因14号外显子跳跃突变的引物、探针及其试剂盒，以及检测方法。

背景技术

[0002] MET也称为c‑MET(cellular‑mesenchymal to epithelial transition factor)，是位于人染色体7上的原癌基因，也是受体酪氨酸激酶家族的成员之一，具有酪氨酸激酶活性。MET受体与肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)结合，可诱导MET二聚体处于激活状态，从而产生磷酸化，激活了下游信号通路。这种的异常活化会造成多方面的影响：包括细胞生长、侵袭及转移等。持续的信号传递会造成细胞过度增殖，因此导致肿瘤的发生与进展。MET通路的异常激活有多种类型，包括MET基因14号外显子跳跃突变、MET扩增、MET重排和MET蛋白过表达等。MET基因14外显子跳跃突变在非小细胞肺癌中的总发生率为3％‑6％，在肺腺癌中的发生率为3％‑4％，在肺肉瘤样癌中的发生率可高达22％。另外其他癌症类型如胃癌，结直肠癌，脑胶质瘤都发现了MET基因的14号外显子跳跃突变。同时研究发现，克唑替尼治疗MET基因14号外显子突变的晚期肺癌有显着和持久的反应(肿瘤部分缓解)，其后陆续有多个MET靶向药治疗MET基因14号外显子跳跃突变的晚期肺癌疗效良好的案例报道，例如卡博替尼、卡马替尼(INC280)、特普替尼、Tivantinib(ARQ197)、Amuvatinib(MP‑470)、Foretinib(XL880)、Rilotumumab(AMG102)、Ficlatuzumab(AV‑299)、Onartuzumab(Metmab)(参见Li Anna,et al.Expert Opinion on Therapeutic Targets,
2014,19(5),663–674；Joseph J.Sacco,et al.Translational Lung Cancer Research,
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Anthony Markham,Drugs,2020,80:829–833；K.K.Sankhala,et al.Journal of Clinical Oncology,2011,29(15):3074；Daniel Rayson,et al.Journal of Clinical Oncology,
2012,30(15),1036；Kimberly Perez,et al.Journal of Clinical Oncology,2020,38(4):693；David R Spigel,et al.Journal of Clinical Oncology,2017,35(4):412‑
420.)。MET基因14号外显子跳跃突变已成为靶向治疗非小细胞肺癌的重要靶点。

[0003] 目前MET基因14外显子跳跃突变检测主要应用的是NGS、一代测序或者荧光PCR。NGS是目前获得美国NCCN指南推荐的MET基因14号外显子跳跃突变的检测方法。但是它的检测过程繁琐，需要较长的建库和检测周期，而且实验数据庞大，需要专业的生物信息人员进行筛选与分析，无法形成标准化的分析流程。同时检测的价格也是相当昂贵，对患者造成很大的经济负担。此外，一代测序灵敏度不足，荧光PCR检测特异性或灵敏度不足。因此，需要一种能够快速、精准、高效地检测MET基因14号外显子跳跃突变的试剂盒及方法，从而支持患者后续的靶向精准治疗。

发明内容

[0004] 为了解决现有技术中存在的问题，本公开的目的在于提供一种新的精准检测MET基因14号外显子跳跃突变的试剂盒，具有较高的特异性和灵敏性，该试剂盒中的上游引物能有效阻断检测体系中的野生型模板扩增，仅扩增突变型模板，有效避免假阳性结果，提高检测准确性。

[0005] 为了实现上述目的，本公开采用以下具体方案：

[0006] 在一方面，本公开提供了一种检测样本中MET基因14号外显子跳跃突变的试剂盒，其包括样本检测引物和检测探针，所述检测引物包括上游引物和下游引物，其中所述上游引物选自SEQ ID NO.1‑7任一所示的核苷酸序列，所述下游引物选自SEQ ID NO.8‑11任一所示的核苷酸序列，所述检测探针选自SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列。

[0007] 在另一方面，本公开提供了一种体外检测MET基因14号外显子跳跃突变的方法，包括以下步骤：

[0008] (1)从待测样本中获取RNA并逆转录为cDNA；

[0009] (2)将步骤(1)获取的cDNA、前述的用于检测MET基因14号外显子跳跃突变的引物、探针以及任选的内参混合；

[0010] (3)进行PCR反应；

[0011] (4)检测荧光信号，根据样本检测探针的荧光信号判定检测样本中是否存在MET基因14号外显子跳跃突变。

[0012] 在另一方面，本公开提供了一种利用前述试剂盒或检测方法在针对MET基因14号外显子跳跃突变的靶向药用药前的伴随基因检测中的应用。

[0013] 本发明的有益效果：

[0014] (1)本公开提供了一种检测样本中MET基因14号外显子跳跃突变的引物与探针，具有较高的特异性和灵敏性，最低可以检测到15copy/μL突变型模板。

[0015] (2)本公开通过设计一种位于MET基因13号和15号外显子交界处(跨13和15号外显子)且15外显子5’端带有dI修饰的上游引物，有效阻断检测体系中的野生型模板扩增，仅扩增突变型模板，有效避免假阳性结果，提高检测准确性。

[0016] (3)本公开的检测方法简单安全，检测速度快，用荧光PCR方法检测可在2小时内完成，数字PCR方法检测可在2.5‑3小时内完成。

附图说明

[0017] 图1示出了带有dI修饰的上游引物1036对应的扩增和熔解曲线。

[0018] 图2示出了带有spacer C3修饰的上游引物1041对应的扩增和熔解曲线。

[0019] 图3示出了不带修饰的上游引物930对应的扩增和熔解曲线。

[0020] 图4示出了特异性引物和探针组合1104/984/1037的扩增曲线。

[0021] 图5示出了特异性引物和探针组合1105/984/1037的扩增曲线。

[0022] 图6示出了引物和探针组合1036/984/1037的扩增曲线。

[0023] 图7示出了引物和探针组合1036/919/922的扩增曲线。

[0024] 图8示出了引物和探针组合1036/977/922的扩增曲线。

[0025] 图9示出了引物和探针组合1036/982/922的扩增曲线。

[0026] 图10示出了引物和探针组合1036/984/922的扩增曲线。

[0027] 图11示出了退火温度为60℃时的扩增曲线。

[0028] 图12示出了退火温度为58℃时的扩增曲线。

[0029] 图13示出了退火温度为56℃时的扩增曲线。

[0030] 图14示出了内参引物和探针组合951/953/966扩增曲线及标曲。

[0031] 图15示出了内参引物和探针组合951/952/965扩增曲线及标曲。

[0032] 图16示出了内参引物和探针组合949/950/965扩增曲线及标曲。

[0033] 图17示出了检测体系在野生型模板下的扩增曲线。

[0034] 图18示出了检测体系在突变型模板下的扩增曲线。

[0035] 图19示出了各模板数字PCR后FAM信号统计结果。

[0036] 图20示出了各模板数字PCR后HEX信号统计结果。

[0037] 图21示出了临床样本数字PCR后FAM信号统计结果。

[0038] 图22示出了临床样本数字PCR后HEX信号统计结果。

具体实施方式

[0039] 在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。

[0040] 本公开的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

[0041] 在本公开中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

[0042] 在本公开中使用的术语“dI修饰”是指脱氧次黄嘌呤修饰(deoxyInosine，dI)，是自然天然存在的碱基，与碱基A、G、C和T均能结合，结合力依次为dI∶dC>dI∶dA>dI∶dG>dI∶dT。但是其与碱基共价结合能力很弱，引物中引入一定数量的dI修饰可以有效降低PCR特异性扩增。

[0043] 在本公开中使用的术语“spacer修饰”可为寡核苷酸标记提供必要的间隔以减少标记基团与寡核苷酸间的相互作用，主要应用于DNA发夹结构和双链结构研究。spacer C3主要用于模仿核糖的3'和5'羟基间的三碳间隔，或“替代”一个序列中未知的碱基。3'‑Spacer C3用于引进一个3'间臂从而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶发挥作用。Spacer 18常用于引进一个强疏水基团。

[0044] 在本公开中使用的术语“外显子跳跃突变”是基因突变的一种类型，该突变使基因的某些外显子缺失。本公开中的MET基因14外显子跳跃突变是指MET基因中的14号外显子缺失。

[0045] 在一方面，本公开提供了一种检测样本中MET基因14号外显子跳跃突变的试剂盒，其包括检测引物和探针，所述引物包括上游引物和下游引物，其中所述上游引物选自SEQ ID NO.1‑7任一所示的核苷酸序列，所述下游引物选自SEQ ID NO.8‑11任一所示的核苷酸序列，所述检测探针选自SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列。

[0046] 在本公开的一些实施方案中，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

[0047] 在本公开的一些实施方案中，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

[0048] 在本公开的一些实施方案中，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

[0049] 在本公开的一些实施方案中，所述试剂盒还包括内参，所述内参包括内参上游引物、内参下游引物和内参检测探针。

[0050] 在本公开的一些实施方案中，所述内参上游引物包括SEQ ID NO.15所示的内参上游引物。

[0051] 在本公开的一些实施方案中，所述内参下游引物包括SEQ ID NO.18所示的内参下游引物。

[0052] 在本公开的一些实施方案中，所述内参检测探针包括SEQ ID NO.20所示的内参检测探针。

[0053] 在本公开的一些实施方案中，所述样本检测探针和内参探针的非端点序列具有或不具有修饰。

[0054] 在本公开的一些实施方案中，所述样本检测探针和内参探针的非端点序列不具有修饰。

[0055] 在本公开的一些实施方案中，所述修饰选自锁核酸修饰、肽核酸修饰或MGB修饰的一种或多种。

[0056] 在本公开的一些实施方案中，所述样本检测探针和内参探针的5’端修饰有荧光基团和/或3’端修饰有淬灭基团。

[0057] 在本公开的一些实施方案中，所述荧光修饰选自以下的一种：FITC、TET、JOE、R110、FAM、CY‑5、HEX或CY‑3；

[0058] 在本公开的一些实施方案中，所述淬灭基团选自以下的一种：TAMRA、BHQ‑2、Dabcyl或MGB。

[0059] 在另一方面，本公开提供了一种利用上述试剂盒检测样本中MET基因14号外显子跳跃突变的方法，其包括以下步骤：

[0060] (1)从待测样本中获取RNA并逆转录为cDNA；

[0061] (2)将步骤(1)获取的cDNA、前述的用于检测MET基因14号外显子跳跃突变的引物、探针以及任选的内参混合；

[0062] (3)进行PCR反应；

[0063] (4)检测荧光信号，根据样本检测探针的荧光信号判定检测样本中是否存在MET基因14号外显子跳跃突变。

[0064] 在本公开的一些实施方案中，所述步骤(3)中使用荧光PCR仪或数字PCR仪对样本进行PCR反应。

[0065] 在本公开的一些实施方案中，所述待测样本选自肿瘤细胞、血液、血浆、外泌体溶液、胸腔积液、腹腔积液、唾液、尿液、组织中的一种或多种。

[0066] 在本公开的一些实施方案中，所述肿瘤细胞为脑星形胶质母细胞瘤、咽头癌、肾上腺肿瘤、AIDS‑相关癌症、腺泡状软组织肉瘤、星形细胞瘤、膀胱癌、骨癌、脑和脊髓癌、转移性脑瘤、乳腺癌、颈动脉体瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、肾嫌色细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、室管膜细胞瘤、尤文肿瘤、骨外黏液样软骨肉瘤、骨纤维发育不全、骨纤维性发育不良、胆囊或胆管癌、胃癌、原发性肝癌、恶性畸胎癌、卵巢胚胎性肿瘤，病毒性肝炎、肝硬化妊娠滋养细胞病、生殖细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌、白血病、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤性肿瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、胆道细胞癌、脑膜瘤、多发性内分泌瘤病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺瘤、小儿癌症、外周神经鞘瘤、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、前列腺癌、黑色素瘤、肾转移性癌、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移性癌或子宫癌细胞中的一种或多种。

[0067] 在本公开的一些实施方案中，所述肿瘤细胞为非小细胞肺癌、肺腺癌、肺肉瘤样癌、胃癌、结直肠癌和/或脑胶质瘤细胞中的一种或多种；优选为非小细胞肺癌细胞。

[0068] 在本公开的一些实施方案中，所述肿瘤细胞为人的肿瘤细胞。

[0069] 在另一方面，本公开提供了一种利用上述试剂盒和/或方法在针对MET基因14号外显子跳跃突变的靶向药用药前的伴随基因检测中的应用。

[0070] 在本公开的一些实施方案中，所述靶向药选自以下的一种或多种：克唑替尼、卡博替尼、卡马替尼(INC280)、特普替尼、ARQ197、MP470、XL880、AMG102、AV‑299、Metmab。

[0071] 实施例

[0072] 下面通过具体实施的方式来进一步说明本公开的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本公开，不应视为对本公开的具体限制。

[0073] 实施例1MET基因14号外显子跳跃突变检测反应体系的筛选与建立

[0074] 本实施例中，用于检测MET基因14号外显子跳跃突变的引物、探针和内参序列由NCBI Blast设计完成，引物长度在18‑25个核苷酸之间，各引物的Tm值大致接近，以确保引物对能在同一退火温度下高效扩增。设计完成后将各引物用NCBI Blast软件进行比对，确保各引物特异性。设计引物时选择跨越MET基因13和15号外显子，结合位点为两个外显子交界处，考虑到MET基因14号外显子和15号外显子的前三位碱基相同，均为atc，因此在引物设计过程中，引入部分修饰，利用引物与模板之间的碱基错配有效地抑制特异性PCR反应，进而达到区别野生型和突变型样本的目的。dI是指脱氧次黄嘌呤(deoxyInosine，dI)修饰，dI是天然存在的碱基，与碱基A、G、C和T均能结合，但其与碱基共价结合能力很弱。spacer C3主要用于模仿核糖的3'和5'羟基间的三碳间隔，或“替代”一个序列中未知的碱基。具体的序列信息及修饰位置见表1。

[0075] 表1序列信息表

[0076]

[0077]

[0078] 注：表1中，“+”表示“+”右侧碱基带有锁核酸修饰。

[0079] 1.特异性上游引物修饰基团的筛选

[0080] 1.1实验步骤

[0081] (1)分别提取人胃癌细胞系Hs 746T细胞(购自ATCC，货号HTB‑135)和人结直肠癌细胞系HCT116细胞(购自上海中科院细胞库，货号TCHu 99)的RNA并逆转录得到的cDNA，分别作为MET基因14号外显子跳跃突变的突变型模板和野生型模板，比较不同基团修饰下的上游引物对检测体系的影响。

[0082] (2)将步骤(1)获得的cDNA按表2的反应体系进行加样扩增反应，选取序列919作为下游引物，分别检测引物组930和919、1036和919、1041和919在MET基因14号外显子跳跃野生型模板和突变型模板的扩增情况，比较不带修饰、带有dI修饰或带有spacer C3修饰的三种上游引物对模板扩增的影响，具体的PCR反应体系和扩增程序见下。

[0083] 表2PCR反应体系

[0084]

[0085] PCR扩增程序见表3。

[0086] 表3扩增程序

[0087]

[0088] 1.2实验结果

[0089] 各引物组的扩增曲线和熔解曲线见图1‑3。由图1可见，带dI修饰的特异性引物组1036/919对照组中，只有突变型模板扩增，野生型模板无法扩增，无假阳性情况存在。而带有spacer C3修饰的特异性引物组1041/919导致野生型和突变模板均无法扩增，具体见图
2。不带修饰的特异性引物组930/919会导致部分野生型模板同样扩增，该检测体系存在假阳性的情况，见图3。综上，筛选dI修饰作为本公开检测体系中特异性上游引物的修饰基因。

[0090] 2.特异性引物dI修饰位点的探究

[0091] 2.1实验步骤

[0092] (1)分别提取人胃癌细胞系Hs 746T细胞和人结直肠癌细胞系HCT116细胞的RNA并逆转录得到的cDNA，分别作为MET基因14号外显子跳跃突变的突变型模板和野生型模板。

[0093] (2)选取下游引物984和荧光探针1037，分别检测不同dI修饰位置的上游引物在MET基因14号外显子跳跃野生型模板和突变型模板的扩增情况，并记录Ct值。具体的引物和探针组合(上游引物/下游引物/荧光探针)包括1104/984/1037、1105/984/1037、1036/984/1037。

[0094] 具体的配制体系见表4。

[0095] 表4反应体系

[0096] 试剂 体积(μL)2x Superstart Premix plus(Probe qPCR) 12.5
FOR Primer(10μM) 0.5
REV Primer(10μM) 0.5
Probe(10μM) 0.25
H2O 9.25
模板 2
共计 25

[0097] PCR扩增程序见表5。

[0098] 表5扩增程序

[0099]

[0100] 2.2实验结果

[0101] 不同引物和探针组合在野生型模板和突变型模板下的Ct值见表6，退火/延伸温度下的扩增结果见图4‑6。1104/984/1037的扩增曲线见图4，1105/984/1037的扩增曲线见图5，1036/984/1037的扩增曲线见图6。

[0102] 表6不同引物和探针组合在野生型模板和突变型模板下的Ct值

[0103]

[0104]

[0105] 注：“NoCt”表示样本未扩增

[0106] 结合表6和图4‑6可见，降低退火/延伸温度后，当特异性引物dI修饰位点是1104(图4)和1105(图5)序列中的情况时，部分野生型模板也扩增，存在假阳性情况，效果无法达到要求。因此确定dI的修饰位点位于1036序列(图6)中的位置时最适合本检测体系。

[0107] 3引物组与荧光探针的组合探究

[0108] 3.1实验步骤

[0109] (1)分别提取人胃癌细胞系Hs 746T细胞和人结直肠癌细胞系HCT116细胞(来源)的RNA并逆转录得到cDNA，分别作为MET基因14号外显子跳跃突变的突变型模板和野生型模板。

[0110] (2)选取1036作为上游引物，检测不同下游引物和荧光探针的组合在MET基因14号外显子跳跃野生型模板和突变型模板的扩增情况，并记录Ct值。具体的引物和探针组合(上游引物/下游引物/荧光探针)包括1036/919/922、1036/977/922、1036/982/922、1036/984/922、1036/984/1037。探针1037的序列位置不在其他引物组范围内。

[0111] 按照表4的配方进行体系配置，按照表5的条件进行扩增程序。

[0112] 3.2实验结果

[0113] 各引物和探针组合的Ct值如表7所示，扩增结果见图6‑10。组合1036/984/1037的扩增曲线见图6，组合1036/919/922的扩增曲线见图7，组合1036/977/922的扩增曲线见图8，组合1036/982/922的扩增曲线见图9，组合1036/984/922的扩增曲线见图10。

[0114] 表7样本扩增CT值

[0115] 引物和探针组合 1036/984/1037 1036/919/922 1036/977/922 1036/982/922 1036/984/922野生型CT值 NoCt NoCt NoCt NoCt NoCt突变型CT值 29.91 34.025 34.07 35.01 41.495

[0116] 结合表7和图6‑10可知，所有组合的野生型模板均无扩增，即均无假阳性情况出现，其中组合1036/984/1037在野生型模板下扩增的Ct值最小，扩增效果最佳，因此选择该组合作为检测体系的引物和探针。

[0117] 4反应体系条件探究(退火温度探究)

[0118] 4.1实验步骤

[0119] (1)分别提取人胃癌细胞系Hs 746T细胞和人结直肠癌细胞系HCT116细胞的RNA并逆转录得到的cDNA，分别作为MET基因14号外显子跳跃突变的突变型模板和野生型模板。

[0120] (2)检测不同的退火温度下引物组1036和919在MET基因14号外显子跳跃野生型模板和突变型模板的扩增情况。

[0121] 按照表2的配方进行体系配置。

[0122] PCR扩增程序如表8所示。

[0123] 表8不同退火温度的反应程序

[0124]

[0125]

[0126] 4.2实验结果

[0127] 不同退火/延伸温度下的扩增情况见图11‑13，反应条件是60℃时扩增曲线见图11，反应条件是58℃时扩增曲线见图12，反应条件时56℃时扩增曲线见图13。升高退火/延伸温度后，突变型模板的Ct值变大，扩增效率降低，野生型模板仍无扩增，无假阳性情况。因此，退火/延伸温度是56℃时效果最佳。

[0128] 5内参的设计与筛选

[0129] 5.1实验步骤

[0130] (1)采用人结直肠癌细胞系HCT116细胞提取并逆转录获得的cDNA为模板。样本初始浓度为40ng/μL，做4倍梯度稀释，共4个梯度，分别为HCT116‑1‑cD‑W‑1、HCT116‑1‑cD‑W‑2、HCT116‑1‑cD‑W‑3、HCT116‑1‑cD‑W‑4。

[0131] (2)分别检测内参引物和探针组合951/953/966、951/952/965和949/950/965在4个梯度样本中的扩增情况，记录HEX Ct值，得到浓度与Ct的标准曲线，并计算各个内参引物和探针组合的扩增效率。

[0132] 5.2实验结果

[0133] 各个内参引物和探针组合在不同梯度样本中的HEX Ct值如见表9，扩增结果和标准曲线分别见14‑16。组合951/953/966的扩增曲线和标曲见图14，组合951/952/965的扩增曲线和标曲见图15，组合949/950/965的扩增曲线和标曲见图16。

[0134] 表9样本扩增Ct值

[0135]

[0136] 经计算可得扩增效率，见表10。

[0137] 表10不同内参引物和探针组合的扩增效率

[0138] 引物和探针组合 扩增效率951/953/966 97％
951/952/965 76％
949/950/965 86％

[0139] 由表9‑10和图14‑16可见，物探针和探针组合951/953/966的扩增效率97％，满足一般要求(90％‑105％)。其他两组引物探针的扩增效率略低。因此，选择探针组合951/953/966作为内参探针引物组合。

[0140] 实施例2数字PCR检测体系的建立与测试

[0141] 1.检测体系的建立

[0142] 1.1实验步骤

[0143] (1)分别提取人胃癌细胞系Hs 746T细胞和人结直肠癌细胞系HCT116细胞的RNA并逆转录得到的cDNA，分别作为MET基因14号外显子跳跃突变的突变型模板和野生型模板。

[0144] (2)采用RNA提取试剂盒(RNeasy Mini Kit(50)，购自QIAGEN，货号74104)从待测样本中获取RNA，并用逆转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)，购自Takara，货号RR047A)将其逆转录为cDNA；

[0145] (3)将步骤(2)获取的cDNA、特异性引物和探针组1036/984/1037和内参引物和探针组951/953/966混合；

[0146] (4)进行PCR反应；

[0147] (5)检测荧光信号，根据样本检测探针的荧光信号判定检测样本中是否存在MET基因14号外显子跳跃突变。

[0148] 按照表11的配方进行体系配置。

[0149] 表11反应体系

[0150] 试剂 体积(μL)2x Superstart Premix plus(Probe qPCR) 15
FOR Primer(10μM)——1036 0.5
REV Primer(10μM)——984 0.5
Probe 1037 0.25
FOR Primer(10μM)——951 0.5
REV Primer(10μM)——953 0.5
Probe——966 0.25
H2O 10.5
cDNA 2
共计 30

[0151] PCR扩增程序见表5。

[0152] 1.2实验结果

[0153] 特异性引物和探针组1036/984/1037和内参引物和探针组951/953/966的检测结果见表12和图17‑18。

[0154] 由表12和图17‑18可见，模板是野生型时，内参探针的HEX信号有扩增信号，特异性引物和探针组合的FAM信号无扩增信号；模板是突变型时，HEX信号和FAM均有信号产生。综上所述，特异性引物和探针组1036/984/1037和内参引物和探针组951/953/966的检测体系能满足MET基因14号外显子跳跃突变检测的要求，且无假阳性的出现。

[0155] 表12样本扩增Ct值

[0156]

[0157]

[0158] 2.检测体系灵敏度验证

[0159] 2.1实验步骤

[0160] (1)分别提取人胃癌细胞系Hs 746T细胞和人结直肠癌细胞系HCT116细胞的RNA并逆转录得到的cDNA，分别作为MET基因14号外显子跳跃突变的突变型模板和野生型模板；将突变型模板做5倍梯度稀释，以最低浓度为1x，其他依次向上x5；

[0161] (2)采用RNA提取试剂盒(RNeasy Mini Kit(50)，购自QIAGEN，货号74104)从待测样本中获取RNA，并用逆转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)，购自Takara，货号RR047A)将其逆转录为cDNA；

[0162] (3)将步骤(2)获取的cDNA、特异性引物和探针组1036/984/1037和内参引物和探针组951/953/966混合；

[0163] (4)使用数字PCR设备进行样本制备、PCR扩增和阅读分析；

[0164] (5)根据芯片阅读仪的结果判定样本是否存在MET基因14号外显子跳跃突变。

[0165] 按表13的反应体系进行加样。

[0166] 表13PCR反应体系

[0167]试剂 体积(μL)
10×dPCR Buffer 3
酶 1
FOR Primer(10μM)——1036 0.6
REV Primer(10μM)——984 0.6
Probe(10μM)——1037 0.3
FOR Primer(10μM)——951 0.6
REV Primer(10μM)——953 0.6
Probe(10μM)——966 0.3
H2O 21
DNA 2
共计 30

[0168] 扩增程序见表5。

[0169] 2.2实验结果

[0170] 各模板的FAM信号和HEX数字PCR检测结果及其标准曲线见表14和图19‑20。

[0171] 由图19‑20和表14可见，野生型模板FAM信号未检测到信号，HEX信号可正常检测到信号；突变型模板FAM和HEX信号均可检测到信号，且梯度稀释模板之间存在线性关系，最低可检测到15copy/μL突变型模板。

[0172] 表14样本检测结果

[0173]

[0174] 实施例3临床样本检测验证

[0175] 选取5例已经过二代测序检测的组织石蜡切片样本，其中1例是MET基因14号外显子跳跃突变阳性的肺腺癌患者样本(临床样本5)，4例是MET基因14号外显子跳跃突变阴性的患者样本(临床样本1/2/3/4)。利用上述检测体系进行临床样本检测验证。

[0176] 1.1实验步骤：

[0177] (1)分别采用RNA提取试剂盒(RNeasy Mini Kit(50)，购自QIAGEN，货号74104)从临床组织石蜡切片样本(临床样本1‑5)中获取RNA，并用逆转录试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)，购自Takara，货号RR047A)将其逆转录为cDNA；

[0178] (2)将步骤(2)获取的cDNA、特异性引物和探针组1036/984/1037和内参引物和探针组951/953/966混合；

[0179] (3)使用数字PCR设备进行样本制备、PCR扩增和阅读分析。

[0180] (4)根据芯片阅读仪的结果判定样本是否存在MET基因14号外显子跳跃突变。

[0181] 按表13的反应体系进行加样。PCR扩增程序见表5。

[0182] 1.2实验结果

[0183] 临床样本1‑5的FAM信号和HEX信号结果见表15和图21‑22。

[0184] 由表15和图21‑22可知，临床样本1/2/3/4检测均有HEX信号产生，无FAM信号，说明样本检测结果为阴性；临床样本5中FAM和HEX信号均有荧光信号产生，检测结果为阳性，与NGS检测结果一致。实验结果表明，本发明建立的检测体系能应用于临床样本检测，准确区分临床样本是否存在MET基因14号外显子跳跃突变。

[0185] 表15临床样本检测结果

[0186] 样本编号 临床样本1 临床样本2 临床样本3 临床样本4 临床样本5FAM 0 0 0 0 5426
HEX 887 126 578 1043 5983
检测结果 阴性 阴性 阴性 阴性 阳性

[0187] 以上所述实施例仅表达了本公开的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本公开构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本公开的保护范围。因此，本公开专利的保护范围应以所附权利要求为准。