化合物KYP-2047在制备抗病毒药物中的应用转让专利
申请号 : CN202211375192.5
文献号 : CN115813914B
文献日 : 2023-07-18
发明人 : 郑海学 , 郝荣增 , 茹毅 , 卢炳州 , 杨洋 , 李亚军 , 李丹 , 张克山 , 田宏 , 刘华南 , 毛玉涵 , 王凌云 , 张贵财 , 张越 , 陈娇 , 吴秀萍 , 任蕊芳
申请人 : 中国农业科学院兰州兽医研究所
摘要 :
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种化合物KYP‑2047在制备抗病毒药物中的应用。本发明意外发现，化合物KYP‑2047能够降低口蹄疫病毒和塞内卡病毒的复制水平，抑制口蹄疫病毒和塞内卡病毒结构蛋白的表达，具有抑制口蹄疫病毒和塞内卡病毒感染的作用，可用于制备抗口蹄疫病毒和塞内卡病毒感染的药物或佐剂，用于抑制口蹄疫病毒和塞内卡病毒的复制。但本发明并不局限于口蹄疫病毒和塞内卡病毒，在本发明所述的化合物KYP‑2047能够抑制口蹄疫病毒和塞内卡病毒的复制的基础上，同样也能抑制小RNA病毒科其他病毒的复制，也可用于抑制其他病毒的复制，制备抗病毒感染的药物，或佐剂。
权利要求 :
1.化合物KYP‑2047在制备预防病毒感染药物中的应用，所述化合物KYP‑2047的结构式如下式(Ⅰ)所示：所述病毒为口蹄疫病毒或塞内卡病毒。
2.化合物KYP‑2047在制备治疗病毒感染药物中的应用，所述化合物KYP‑2047的结构式如下式(Ⅰ)所示：所述病毒为口蹄疫病毒或塞内卡病毒。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述化合物KYP‑2047加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成药学上可接受的任一剂型。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述剂型包括粉针剂、胶囊剂、片剂、混悬剂。
说明书 :
化合物KYP‑2047在制备抗病毒药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种化合物KYP‑2047在制备抗病毒药物中的应用。
背景技术
[0002] 口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus，FMDV)属于小RNA病毒科(Picornaviridae)、口疮病毒属(Aphthovirus)，基因组为单股正链RNA，约为8500nt，FMDV主要感染猪、牛和羊等偶蹄动物引起急性、热性、高度接触性和可快速远距离传播的动物烈性传染病，易感动物多达70余种；引发口腔粘膜、蹄部和乳房等处皮肤或无毛部位出现水疱和溃烂症状，导致生产力下降或丧失。该病可引起巨大的畜牧业经济损失和社会政治影响，被世界动物卫生组织(WOAH)列为法定报告的动物疫病，也是我国重点防范的I类动物疫病。
至今仍在多个国家和地区流行，FMDV包含7种血清型(A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1)、80多种亚型的毒株，不同血清型之间无有效的交叉保护，这使得FMD的防控更加困难。目前，免疫接种疫苗是抵御FMD最有效的措施。但其病原变异导致的宿主免疫及致病机理等方面的研究仍有待突破。因此，对于抑制口蹄疫病毒感染药物的筛选和研究至关重要。
至今仍在多个国家和地区流行，FMDV包含7种血清型(A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1)、80多种亚型的毒株，不同血清型之间无有效的交叉保护，这使得FMD的防控更加困难。目前，免疫接种疫苗是抵御FMD最有效的措施。但其病原变异导致的宿主免疫及致病机理等方面的研究仍有待突破。因此，对于抑制口蹄疫病毒感染药物的筛选和研究至关重要。
[0003] 塞内卡病毒A(Senecavirus A，SVA)属于小RNA病毒科(Picornaviridae)、塞内卡病毒属(Senecavirus)成员，是引起猪水泡病的病原之一。2002年从常规细胞培养中发分离出第一个SVA毒株SVV‑001。SVA包含单链正义RNA基因组，基因组编码一个多肽，该多肽被切割成先导蛋白L和三个前体蛋白P1、P2和P3。随后，P1被切割成VP4、VP2、VP3和VP1结构蛋白，而P2和P3被切割成2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D非结构蛋白。SVA可导致猪口腔和鼻粘膜的水泡损伤、嗜睡、厌食、跛行，甚至仔猪急性死亡。由于SVA诱发与FMDV、猪水泡病病毒(SVDV)和水疱性口炎病毒(VSV)相似的水泡性疾病，因此在临床上很难区分。
[0004] 化合物KYP‑2047最初是作为脯氨酰寡肽酶抑制剂JTP‑4819的衍生物之一合成的，具有更好的药理学特性(即更高的脑渗透率，在海马、纹状体和皮质中的分布均匀，在细胞内位置的可用性更好)。
[0005] 本发明意外发现，化合物KYP‑2047能够使FMDV和SVA的复制水平降低，抑制病毒结构蛋白的表达，具有抑制病毒感染的作用，可用于制备抗小RNA病毒感染的药物或佐剂，用于抑制病毒的复制。
发明内容
[0006] 本发明提供了一种化合物KYP‑2047在制备抗病毒感染药物中的应用。具体包括以下内容：
[0007] 第一方面本发明提供了一种化合物KYP‑2047或其药学上可接受的盐在制备预防病毒感染药物中的应用，所述化合物KYP‑2047的结构式如下式(Ⅰ)所示：
[0008]
[0009] 优选地，所述病毒为小RNA病毒科病毒。
[0010] 优选地，所述病毒为口蹄疫病毒、塞内卡病毒。
[0011] 优选地，所述化合物KYP‑2047或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成药学上可接受的任一剂型。
[0012] 优选地，所述剂型包括粉针剂、胶囊剂、片剂、混悬剂。
[0013] 第二方面，本发明提供了一种化合物KYP‑2047或其药学上可接受的盐在制备治疗病毒感染药物中的应用，所述化合物KYP‑2047的结构式如下式(Ⅰ)所示：
[0014]
[0015] 优选地，所述病毒为小RNA病毒科病毒。
[0016] 优选地，所述病毒为口蹄疫病毒、塞内卡病毒。
[0017] 优选地，所述化合物KYP‑2047或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成药学上可接受的任一剂型。
[0018] 优选地，所述剂型包括粉针剂、胶囊剂、片剂、混悬剂。
[0019] 本发明的有益效果是：本发明意外发现，化合物KYP‑2047能够使FMDV和SVA的复制水平降低，抑制病毒结构蛋白的表达，具有抑制病毒感染的作用，可用于制备抗小RNA病毒感染的药物或佐剂，用于抑制病毒的复制。
附图说明
[0020] 图1化合物KYP‑2047对FMDV滴度的影响结果；
[0021] 图2化合物KYP‑2047在IBRS‑2细胞中抑制FMDV复制的结果图；
[0022] 图3化合物KYP‑2047抑制FMDV结构蛋白VP1表达的结果图；
[0023] 图4化合物KYP‑2047对SVA滴度的影响结果；
[0024] 图5化合物KYP‑2047在IBRS‑2细胞中抑制SVA复制的结果图；
[0025] 图6化合物KYP‑2047抑制SVA结构蛋白VP2表达的结果图；
[0026] 图7化合物KYP‑2047的安全性。
具体实施方式
[0027] 为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。
[0028] 以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和口蹄疫实验室活动许可：
[0029] 中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(BSL‑3)和生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安全委员会逐级上报，获得农业部关于开展FMDV等病原及动物研究许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。
[0030] 以下实施例中所述的实验细胞、病毒来源：
[0031] 细胞培养：IBRS‑2细胞来源于猪科(Sus scrofa)动物，和BHK‑21细胞保存于本实验室；用含有10％胎牛血清(FBS)、1％双抗的DMEM培养基置于含有5％ CO2温箱(37℃)中进行培养。
[0032] 病毒来源：FMDV毒株(O/BY/CHA/2010)和SVA毒株(CH/FJ/2017)保存于中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫与新发病流行病学团队和国家口蹄疫参考实验室。
[0033] 化合物KYP‑2047购自MCE公司，货号HY‑100475；
[0034] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买获得。
[0035] 实施例1化合物KYP‑2047抑制FMDV的复制
[0036] 1.含化合物KYP‑2047培养基的制备
[0037] KYP‑2047干粉溶解于DMSO溶解中配制成浓度为10mM储存液。实验前，在DMEM培养基中，分别加入不同剂量的化合物KYP‑2047，使其浓度分别为1.0μM、10μM和100μM。
[0038] 2.化合物KYP‑2047孵育细胞的样品制备
[0039] IBRS‑2细胞计数后铺在六孔板中，待细胞生长至70％～80％融合度时，实验组用不同浓度的KYP‑2047(1μM、10μM和100μM)处理细胞4h后，感染对照组用DMSO(1％)处理细胞4h后；然后接种FMDV(MOI＝0.1)，接种后1h，弃去接种液体，用PBS洗细胞一遍，补充维持液，接种后12～14h分别收取上清和细胞。以未接种FMDV株为Mock对照；以DMSO(不含化合物KYP‑2047)为空白对照。
[0040] 3.FMDV滴度测定
[0041] 测定上步骤2中获得的上清的TCID50，进行病毒滴度分析。
[0042] TCID50的测定步骤如下：提前16h将BHK‑21细胞接种96孔板，在细胞形成单层细胞‑1 ‑10后，用PBS洗3遍IBRS‑2细胞，接种步骤2收取的上清(10 ～10 倍比稀释)作为感染孔，另设两列阴性对照孔。在感染孔中加入100μL病毒滤液或倍比稀释病毒稀释液，37℃吸附1h，每
10min轻轻摇晃一次，保证病毒吸附均匀。吸附1h后，吸去上清，用PBS轻轻洗板1次。加入病毒维持液，待48h后，每12h观察一次细胞病变情况，72h后记录病变孔数，计算TCID50，平行测定三次，取平均值为最终病毒滴度。
10min轻轻摇晃一次，保证病毒吸附均匀。吸附1h后，吸去上清，用PBS轻轻洗板1次。加入病毒维持液，待48h后，每12h观察一次细胞病变情况，72h后记录病变孔数，计算TCID50，平行测定三次，取平均值为最终病毒滴度。
[0043] 实验结果如图1所示，在培养过程中，IBRS‑2细胞加入化合物KYP‑2047处理后，FMDV的TCID50显著降低，且呈剂量依赖性。表明，化合物KYP‑2047显著降低了FMDV的病毒的滴度，抑制了FMDV的复制。
[0044] 4.FMDV复制的测定
[0045] 测定上步骤2中获得的上清中病毒RNA拷贝数，进行病毒RNA复制分析。
[0046] 病毒RNA复制测定步骤如下：按照病毒RNA提取试剂盒(OMEGA公司)说明书提取收获样品中的病毒RNA，使用一步法qPCR试剂盒(TAKARA公司)进行荧光定量PCR扩增，检测FMDV的RNA依赖的RNA复制酶3D基因的拷贝数。
[0047] qPCR反应体系：总体积20μL，包括10μM的上下游引物和荧光标记探针各0.4μL，2×One Step RT‑PCR BufferⅢ10μL，TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)0.4μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.4μL，90ng的RNA 2μL，RNase Free dH2O 5.6μL。反应条件为：42℃、5min，95℃、10s，1Cycle；95℃、5s，60℃、20s，40cycles。
[0048] 其中qPCR的引物和探针序列为：上游引物5'‑ACTGGGTTTTACAAACCTGTGA‑3'，下游引物5'‑GCGAGTCCTGCCACGGA‑3'，荧光标记探针5'‑FAM‑TCCTTTGCACGCCGTGGGAC‑TAMRA‑3'。
[0049] 结果如图2所示，在IBRS‑2细胞培养过程中，加入化合物KYP‑2047后，FMDV的RNA复制显著降低，且呈剂量依赖性。表明，化合物KYP‑2047显著抑制了FMDV的RNA复制。5.FMDV结构蛋白VP1的表达
[0050] 测定细胞样品中FMDV结构蛋白VP1的表达，进行病毒结构蛋白表达水平分析。
[0051] 病毒结构蛋白表达水平分析步骤如下：IBRS‑2细胞计数后铺在35mm培养皿中，待细胞生长至80％融合度时，实验组用不同浓度的KYP‑2047(1μM、10μM和100μM)处理细胞4h后，感染对照组用DMSO(1％)处理细胞4h后；然后接种FMDV(MOI＝0.1)，接种后1h，弃去接种液体，用PBS洗细胞一遍，补充维持液，接种后12～14h分别收取细胞。以未接种FMDV株为Mock对照；以DMSO(不含化合物KYP‑2047)为空白对照。提取总蛋白，进行Western‑blotting实验检测FMDV VP1蛋白的表达差异。
[0052] 结果如图3所示，在IBRS‑2细胞培养过程中，加入化合物KYP‑2047后，FMDV结构蛋白VP1的表达显著降低，且呈剂量依赖性。表明，化合物KYP‑2047显著抑制FMDV结构蛋白VP1的表达，抑制FMDV的复制和感染。
[0053] 实施例2化合物KYP‑2047抑制SVA的复制
[0054] 1.含化合物KYP‑2047培养基的制备
[0055] KYP‑2047干粉溶解于DMSO溶解中配制成浓度为10mM储存液。实验前，在DMEM培养基中，分别加入不同剂量的化合物KYP‑2047，使其浓度分别为1.0μM、10μM和100μM。
[0056] 2.化合物KYP‑2047孵育细胞的样品制备
[0057] IBRS‑2细胞计数后铺在六孔板中，待细胞生长至70％～80％融合度时，实验组用不同浓度的KYP‑2047(1μM、10μM和100μM)处理细胞4h后，感染对照组用DMSO(1％)处理细胞4h后；然后接种SVA(MOI＝0.1)，接种后1h，弃去接种液体，用PBS洗细胞一遍，补充维持液，接种后12～14h分别收取上清和细胞。以未接种SVA株为Mock对照；以DMSO(不含化合物KYP‑
2047)为空白对照。
2047)为空白对照。
[0058] 3.SVA滴度测定
[0059] 测定上步骤2中获得的上清的TCID50，进行病毒滴度分析。
[0060] TCID50的测定步骤如下：提前16h将IBRS‑2细胞接种96孔板，在细胞形成单层细胞‑1 ‑10后，用PBS洗3遍细胞，接种步骤2收取的上清(10 ～10 倍比稀释)作为感染孔，另设两列阴性对照孔。在感染孔中加入100μL病毒滤液或倍比稀释病毒稀释液，37℃吸附1h，每10min轻轻摇晃一次，保证病毒吸附均匀。吸附1h后，吸去上清，用PBS轻轻洗板1次。加入病毒维持液，待48h后，每12h观察一次细胞病变情况，72h后记录病变孔数，计算TCID50，平行测定三次，取平均值为最终病毒滴度。
[0061] 实验结果如图4所示，在培养过程中，IBRS‑2细胞加入化合物KYP‑2047处理后，SVA的TCID50显著降低，且呈剂量依赖性。表明，化合物KYP‑2047显著降低了SVA的病毒的滴度，抑制了SVA的复制。
[0062] 4.SVA复制的测定
[0063] 测定上步骤2中获得的上清中病毒RNA拷贝数，进行病毒RNA复制分析。
[0064] 病毒RNA复制测定步骤如下：按照病毒RNA提取试剂盒(OMEGA公司)说明书提取收获样品中的病毒RNA，使用一步法qPCR试剂盒(TAKARA公司)进行荧光定量PCR扩增，检测SVA的RNA依赖的RNA复制酶3D基因的拷贝数。
[0065] qPCR反应体系：总体积20μL，包括10μM的上下游引物和荧光标记探针各0.4μL，2×One Step RT‑PCR BufferⅢ10μL，TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)0.4μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ0.4μL，90ng的RNA 2μL，RNase Free dH2O 5.6μL。反应条件为：42℃、5min，95℃、10s，1Cycle；95℃、5s，60℃、20s，40cycles。
[0066] 其中qPCR的引物和探针序列为：上游引物5'‑GCCAACGTCCCTTATCAACC‑3'，下游引物5'‑CTAATGGCGTAGGGCAAACC‑3'，荧光标记探针5'‑FAM‑AGCAATCCTGGGCATCCCTGGA‑TAMRA‑3'。
[0067] 结果如图5所示，在IBRS‑2细胞培养过程中，加入化合物KYP‑2047后，SVA的RNA复制显著降低，且呈剂量依赖性。表明，化合物KYP‑2047显著抑制了SVA的RNA复制。5.SVA结构蛋白VP1的表达
[0068] 测定细胞样品中SVA结构蛋白VP2的表达，进行病毒结构蛋白表达水平分析。
[0069] 病毒结构蛋白表达水平分析步骤如下：IBRS‑2细胞计数后铺在35mm培养皿中，待细胞生长至80％融合度时，实验组用不同浓度的KYP‑2047(1μM、10μM和100μM)处理细胞4h后，感染对照组用DMSO(1％)处理细胞4h后；然后接种SVA(MOI＝0.1)，接种后1h，弃去接种液体，用PBS洗细胞一遍，补充维持液，接种后12～14h分别收取细胞。以未接种SVA株为Mock对照；以DMSO(不含化合物KYP‑2047)为空白对照。提取总蛋白，进行Western‑blotting实验检测SVA VP2蛋白的表达差异。
[0070] 结果如图6所示，在IBRS‑2细胞培养过程中，加入化合物KYP‑2047后，SVA结构蛋白VP2的表达显著降低，且呈剂量依赖性。表明，化合物KYP‑2047显著抑制SVA结构蛋白VP2的表达，抑制SVA的复制和感染。
[0071] 实施例3化合物KYP‑2047的细胞毒性
[0072] 利用CCK‑8实验检测小分子化合物KYP‑2047对细胞的毒性。在96孔板中用DMEM+5
10％FBS培养基准备IBRS‑2细胞(2×10/孔)，过夜培养，弃去细胞培养基，向孔中加入不同浓度的KYP‑2047(1μM、2μM、5μM、8μM、10μM、20μM、50μM、80μM、100μM)，同时设置空白孔(仅含细胞培养基)，对照孔(含有细胞和培养基)，将培养板在培养箱中孵育24h后，向细胞板的每孔中加入10μL的CCK‑8溶液，将培养板在培养箱中孵育1‑4小时，在读取平板之前，可以在振荡器上轻柔的混匀。然后用酶标仪测量450nm处的吸光度，计算细胞存活率。
10％FBS培养基准备IBRS‑2细胞(2×10/孔)，过夜培养，弃去细胞培养基，向孔中加入不同浓度的KYP‑2047(1μM、2μM、5μM、8μM、10μM、20μM、50μM、80μM、100μM)，同时设置空白孔(仅含细胞培养基)，对照孔(含有细胞和培养基)，将培养板在培养箱中孵育24h后，向细胞板的每孔中加入10μL的CCK‑8溶液，将培养板在培养箱中孵育1‑4小时，在读取平板之前，可以在振荡器上轻柔的混匀。然后用酶标仪测量450nm处的吸光度，计算细胞存活率。
[0073] 结果如图7所示，化合物KYP‑2047对细胞的毒性较小，甚至使用剂量达到100μM时，细胞活度依然可达到90％以上，细胞毒性小，安全性较好。
[0074] 综上，本发明实施例以宿主细胞IBRS‑2为例，研究证明了化合物KYP‑2047能够在宿主细胞IBRS‑2中抑制FMDV和SVA的复制，表明，本发明所述的化合物KYP‑2047能够抑制FMDV和SVA的复制，可用于制备抗FMDV和SVA病毒感染的药物或佐剂。
[0075] 需要说明的是，小RNA病毒科主要包括以下五个属：肠道病毒属、鼻病毒属、心病毒属、口疮病毒属、塞内卡病毒属，而FMDV属于口疮病毒属，SVA属于赛尼卡病毒属。由于小RNA病毒科四个属之间的病毒结构蛋白具有高度保守性。本发明虽然以小RNA病毒科病毒的FMDV和SVA为例，证明了化合物KYP‑2047可以抑制FMDV和SVA的复制，但本发明并不局限于FMDV和SVA，在本发明所述的化合物KYP‑2047能够抑制FMDV和SVA的复制的基础上，同样也能抑制小RNA病毒科其他病毒的复制，也可用于抑制其他病毒的复制，制备抗病毒感染的药物，或佐剂。