海蒿子多酚在制备治疗阿尔兹海默病药物中的应用

摘要

本发明涉及海洋生物技术领域，特别涉及海蒿子多酚在制备治疗阿尔兹海默病药物中的应用，本发明发现海蒿子多酚可以显著抑制乙酰胆碱酯酶活力，同时可以提高阿尔兹海默病模型大鼠的记忆能力。因此提供了其在制备治疗阿尔兹海默病药物中的应用，并进一步给出了海蒿子多酚的提取方法。

权利要求

1.海蒿子多酚在制备治疗阿尔兹海默病药物中的用途，所述海蒿子多酚的制备方法为：(1)新鲜的海蒿子冷冻干燥40小时，将其剪碎，然后将其放入粉碎机中并通过60目筛得到海蒿子粉末；

(2)准确称取一定量的海蒿子粉末，按照料液比1∶35(w/v)加入体积浓度为50％的乙醇水溶液，充分混匀浸泡；

(3)用数控超声波清洗器进行多酚的提取，超声功率为500W、超声频率为40kHZ，提取时间为40min，提取温度65℃，抽滤，滤渣在相同条件下再次提取，抽滤；

(4)将两次提取得到的滤液合并，在旋转蒸发仪上40～50℃蒸发浓缩，得到海蒿子多酚提取液；

(5)用大孔树脂LS‑305A对海蒿子多酚粗提取液进行初步纯化，以1.0BV/h流速进行上样，静置吸附1h，用1个柱体积的去离子水洗除杂质，用2.5个柱体积的50％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，40～45℃真空旋蒸浓缩，冻干得海蒿子多酚初纯品粉末；

(6)取经大孔树脂纯化后的海蒿子多酚初纯品粉末，精密称定，用少量水超声溶解，离心，上清液上样于葡聚糖凝胶LH‑20层析柱，分别以水、50％乙醇、无水乙醇洗脱，各组分洗脱液经旋蒸、冻干，50％乙醇组分即为制备的海蒿子多酚。

2.如权利要求1所述的用途，海蒿子多酚通过抑制乙酰胆碱酯酶发挥治疗阿尔兹海默病的疗效。

说明书

海蒿子多酚在制备治疗阿尔兹海默病药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及海洋生物技术领域，特别涉及海蒿子多酚的应用。

背景技术

[0002] 海蒿子(Sargassum pallidum)属于褐藻门马尾藻科，广泛分布于中国山东和辽宁等沿海地区，是一种即可食用又可药用的植物。

[0003] 阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease，AD)是最常见的痴呆形式(占60％～80％)，以认知能力进行性减退为主要临床表现，并伴有社交和行为人格退化。目前中国约有980万、全球约有4700万AD患者，2050年AD患病人数预计将增加两倍多(约1.31亿)。然而，AD缺少可阻止或逆转疾病病程的治疗药物，目前美国食品和药物管理局(FDA)批准的AD治疗药物均为对症治疗药物，包括乙酰胆碱酯酶抑制剂(他克林、多奈哌齐、加兰他敏和卡巴拉汀)、N‑甲基‑D‑天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂美金刚和靶向β淀粉样蛋白(Aβ)的阿杜那单抗(Aducanumab)。此外，2019年中国国家药品监督管理局有条件批准甘露特钠胶囊(GV‑971)上市，用于治疗轻度至中度AD。上述对症治疗药物常伴随着副作用，包括恶心、腹泻、呕吐与高血压等，因此寻找和开发有效、安全的AD治疗药物至关重要。海洋植物因为独特的生存环境而具有一些陆生植物不具备的特性，且海洋植物分布广泛、数量庞大，从海洋植物中获取具有治疗AD活性的有效成分是一种新颖且具发展前景的思路。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种新的海洋植物提取物，该提取物可以用于对阿尔兹海默病的治疗和预防。

[0005] 为了实现本发明目的，具体采用如下技术手段：

[0006] 海蒿子多酚在制备治疗阿尔兹海默病药物中的用途。

[0007] 海蒿子多酚在制备对乙酰胆碱酯酶抑制作用的药物中的应用。

[0008] 前述所述的海蒿子多酚的制备方法，所述的海蒿子多酚通过如下方法制备：

[0009] (1)新鲜的海蒿子洗净、冻干、粉碎、过筛，得海蒿子粉末；

[0010] (2)海蒿子粉末，按照料液比1∶15～60(w/v)加入体积浓度为30％～80％的乙醇水溶液，充分混匀浸泡；

[0011] (3)超声提取海蒿子多酚，提取温度40～80℃，提取时间为20～200min，提取后抽滤，收集滤液；

[0012] (4)重复步骤(3)提取1～3次，合并滤液；

[0013] (5)将滤液30～60℃蒸发浓缩，得到海蒿子多酚粗提物；

[0014] (6)用大孔树脂或聚酰胺树脂对粗提物初步纯化，得到海蒿子多酚粗品；

[0015] (7)用葡聚糖凝胶对海蒿子多酚粗品进一步纯化；

[0016] (8)真空冷冻干燥，得到海蒿子总多酚。

[0017] 所述步骤(2)的料液比优选为1∶25～45，进一步优选为1∶31～1∶40。乙醇浓度优选为40％～60％，进一步优选为45％～55％。

[0018] 所述步骤(3)的提取温度优选为50～70℃，进一步优选为60～70℃。超声时间优选为为20～100min，进一步优选为20～53min。

[0019] 所述步骤(5)的浓缩温度优选为40～50℃。

[0020] 所述步骤(6)初步纯化海蒿子多酚粗提物选用的树脂型号优选为LS‑305A、AB‑8、XDA‑7、BS‑45、NKA‑9、ADS‑17、ADS‑21、HPD100、DA201、XAD16N，进一步优选为LS‑305A、DA201、XAD16N，聚酰胺树脂型号优选为尼龙‑6和尼龙‑66，进一步优选为尼龙6。

[0021] 所述步骤(7)进一步纯化多酚样品的葡聚糖凝胶型号优选为G‑100、G‑75、G‑25、G15、LH‑20，进一步优选为LH‑20。

[0022] 有益效果

[0023] (1)本发明提供了一种高纯度海蒿子多酚的制备方法。

[0024] (2)采用该方法制备的海蒿子多酚在体外显示出抑制乙酰胆碱酯酶的活性，在体内显示出提高AD模型大鼠记忆的能力。

具体实施方式

[0025] 下面将结合本发明实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0026] 实施例1

[0027] 海蒿子多酚提取方法如下：

[0028] (1)新鲜的海蒿子冷冻干燥40小时，将其剪碎。然后将其放入粉碎机中并通过60目筛得到海蒿子粉末；(2)准确称取一定量的海蒿子粉末，按照料液比1∶35(w/v)加入体积浓度为50％的乙醇水溶液，充分混匀浸泡；

[0029] (3)用数控超声波清洗器进行多酚的提取，超声功率为500W、超声频率为40kHZ，提取时间为40min，提取温度65℃，抽滤，滤渣在相同条件下再次提取，抽滤；

[0030] (4)将两次提取得到的滤液合并，在旋转蒸发仪上40～50℃蒸发浓缩，得到海蒿子多酚提取液。

[0031] (5)以没食子酸为标准品，采用GB/T8313‑2008《福林酚试剂比色法》测定多酚含量为：7.5mgGAE/g干海藻。

[0032] (6)用大孔树脂LS‑305A对海蒿子多酚粗提取液进行初步纯化，以1.0BV/h流速进行上样，静置吸附1h，用1个柱体积的去离子水洗除杂质，用2.5个柱体积的50％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，40～45℃真空旋蒸浓缩，冻干得海蒿子多酚初纯品粉末。

[0033] (7)取经大孔树脂纯化后的海蒿子总多酚，精密称定，用少量水超声溶解，离心，上清液上样于葡聚糖凝胶LH‑20层析柱，分别以水、50％乙醇、无水乙醇洗脱，各组分洗脱液经旋蒸、冻干得海蒿子多酚精制粉末，测得50％乙醇组分海蒿子多酚纯度最高，为70.5％。

[0034] 实施例2

[0035] 实施例1提取得到的海蒿子多酚的成分定性鉴别实验如下：

[0036] 采用Q‑TOF/MS仪器分析海蒿子多酚样品，收集Phenol‑Explorer系统数据库及文献中有关海蒿子的化学成分信息包括名称、分子式、结构式(.mol格式)等，建立海蒿子化学成分数据库，并将其导入UNIFI 2.0软件中。将正离子模式下采集的质谱数据与UNIFI及QI软件中数据库进行自动匹配，选择偏差在20mDa范围内的化合物，并对其进行鉴定和验证，得到最终结果。在海蒿子多酚样品中共鉴定出50个化合物，其中有机酸类7个，酯类5个，酚类8个，糖类2个，黄酮类19个，三萜类2个，以及其他类7个。化合物具体信息见表1。

[0037] 表1海蒿子化学成分鉴定

[0038]

[0039]

[0040] 实施例3

[0041] 实施例1提取得到的海蒿子多酚抑制乙酰胆碱酯酶活性实验如下：

[0042] 实验原理：乙酰胆碱酯酶可以把底物碘化硫代乙酰胆碱(ACTI)水解成硫代胆碱和乙酸，然后硫代胆碱会和显色剂二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)快速反应，生成黄色的5‑硫代‑2‑硝基苯甲酸，该物质在波长412nm有吸收。

[0043] 配置海蒿子多酚水溶液浓度范围为0.005～1mg/mL，阳性药盐酸多奈哌齐水溶液浓度范围为0.005～0.5mg/mL。乙酰胆碱酯酶用磷酸缓冲液配制成0.2U/mL的溶液，ACTI用磷酸缓冲液配制成10mM溶液，DTNB用磷酸缓冲液配制成10mM的溶液。将20μL不同浓度的样品溶液、20μL乙酰胆碱酯酶溶液和50μL显色剂DTNB混合在96孔板中，将96孔板在37℃下预孵育15min，再加入底物ACTI溶液继续孵育25min后，在412nm波长下测定吸光度值。

[0044] 以盐酸多奈哌齐为阳性对照品，同时设定相同体系下的样品背景对照组(不加酶)、空白对照组(不加样品)。测定不同浓度样液对乙酰胆碱酯酶抑制活性的影响，计算抑制率，采用Origin8.0软件以抑制率对浓度作图并进行回归方程拟合，分别求出海蒿子多酚和盐酸多奈哌齐的半数抑制质量浓度(IC50)。

[0045] 抑制率(％)＝(A空白‑A样本)/(A空白‑A背景)*100％

[0046] 式中：A空白为空白对照组吸光度值；A样本为海蒿子多酚或盐酸多奈哌齐组吸光度值；A背景为样品背景对照组吸光度值。

[0047] 实验结果：

[0048] 样品组以及对照组的酶活力抑制结果见表2。与对照组相比，海蒿子多酚也可显著抑制乙酰胆碱酯酶的活性。

[0049] 表2海蒿子多酚和盐酸多奈哌齐对乙酰胆碱酯酶活性的影响

[0050] ‑1样品 半数抑制质量浓度(IC50)/(mg·mL )
海蒿子多酚 0.0653
盐酸多奈哌齐 0.0313

[0051] 实施例4

[0052] 实施例1提取得到的海蒿子多酚对AD模型大鼠的作用实验如下：

[0053] 实验材料：雄性SD大鼠、造模剂Aβ25‑35、海蒿子多酚、盐酸多奈哌齐，等[0054] 实验方法：

[0055] AD模型建立：大鼠适应性饲养1周，腹腔注射戊巴比妥钠(麻醉剂量为50mg/Kg)进行麻醉，于大鼠脑立体定位仪上固定头部，常规消毒皮肤，在颅顶线切开皮肤，暴露头骨及前囟，于前囟后1mm(AP＝‑1mm，AP相当于Y轴)中线旁1.5mm(ML＝1.5mm，ML相当于X轴)处用牙科钻钻开颅骨，微量注射器吸取5μL的Aβ25‑35(1μg/μL)，垂直进针，达蛛网膜下3.5mm(DV＝‑3.5mm，DV相当于Z轴)处，静置2min(使脑组织复位)，缓慢注射，5min内注射完成，留针5min后取出，大鼠大脑对侧进行相同的操作。清洁创面后缝合皮下组织、头皮，强力碘消毒。
为防止大鼠手术伤口感染，造模后给大鼠腹腔注射青霉素80000单位/只/天，连续注射3天。

[0056] 动物分组与给药：

[0057] 大鼠造模后随机分为5组，每组大鼠10只。连续给药30天，分组及给药情况如下：

[0058] 假手术组(未使用造模剂)：灌胃0.5％CMC‑Na溶液，灌胃体积为10mL/Kg；

[0059] 模型组：灌胃0.5％CMC‑Na溶液，灌胃体积为10mL/Kg；

[0060] 盐酸多奈哌齐(阳性药)组：灌胃给药多奈哌齐0.5％CMC‑Na溶液，给药剂量为0.5mg/kg，给药体积为10mL/Kg；

[0061] 海蒿子多酚高剂量给药组：灌胃海蒿子多酚的0.5％CMC‑Na溶液，给药剂量为20mg/Kg，给药体积为10mL/Kg；海蒿子多酚低剂量给药组：灌胃海蒿子多酚的0.5％CMC‑Na溶液，给药剂量为10mg/Kg，给药体积为10mL/Kg。

[0062] 行为学测定：

[0063] Morris水迷宫测试(Morris water maze task)用于研究空间学习和记忆能力。

[0064] 所用水迷宫为一直径180cm、高50cm的圆形水池，水池内壁被漆为黑色，水深30cm，水温控制为24‑26℃，距池壁35cm处放置一高29cm，直径10cm圆台，水加至超过平台高度2cm，向水中加入碳素墨水。该实验分为隐蔽站台实验和空间探索实验两个部分：隐蔽站台实验历时4日(给药第22天至给药第25天)，从给药第22天起，每天连续训练4次，每次训练时将大鼠依次从四个象限之一面向池壁放入水中，让大鼠自由游泳90s，若90s内成功爬上平台(在平台上停留时间≥10s)，则将大鼠从平台取回鼠笼；若90s内未爬上平台，则将大鼠放到平台上停留15s，潜伏期记为90s，该实验阶段统计的参数为大鼠寻找并爬上平台所需时间(即逃避潜伏期)。空间探索实验于给药第27天进行，撤除站台，将大鼠于第II象限面向池壁放入水中，记录大鼠在90s内的游泳路径，该实验阶段统计的参数为第IV象限游泳时间(即站台象限游泳时间)。

[0065] 实验结果如下：

[0066] 表3逃避潜伏期实验结果

[0067]

[0068] 备注：与各模型组比，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001

[0069] 表4站台象限游泳时间实验结果

[0070]

[0071] 备注：与模型组比，#p＜0.05，##p＜0.01

[0072] 由表3和表4可知，模型组在隐蔽站台测试第2～4天的逃避潜伏期显著高于假手术组，表明造模成功；隐蔽站台实验的第3和4天中假手术、盐酸多奈哌齐、海蒿子多酚(低、高)组的逃避潜伏期均比模型组降低(P＜0.05)。空间探索实验结果显示假手术、盐酸多奈哌齐组、海蒿子多酚(低、高)组的站台象限游泳时间均比模型组升高(P＜0.05)。

[0073] 综上所述，本实验中建立的脑室定位注射Aβ25‑35大鼠模型成功显示出了记忆受损的症状。海蒿子多酚低、高剂量组均显示出能够改善该模型大鼠的记忆能力。

[0074] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。