具有四酶活性的荔枝状氧化亚铜/氧化铜纳米微球的制备方法

摘要

本发明公开了一种具有四酶活性的荔枝状氧化亚铜/氧化铜纳米微球（Cu2O/CuO NMSs）的制备方法，属于仿生纳米酶学技术领域。Cu2O/CuO NMSs的制备则是通过一步溶剂热法完成的，制备的Cu2O/CuO NMSs具有与过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶以及漆酶等4种天然酶相同的酶活性。其中，Cu2O/CuO NMSs的过氧化物酶，超氧化物歧化酶以及漆酶活性通过构建经典的比色系统得到了充分证明，而Cu2O/CuO NMSs的过氧化氢酶活性则通过系统的压力变化程度进行了评估。总而言之，本发明制备的Cu2O/CuO NMSs是一种具有广阔应用前景的多酶活性纳米材料。

权利要求

1.具有四酶活性的荔枝状氧化亚铜/氧化铜纳米微球的制备方法，其特征在于：以三水硝酸铜作为铜源，异烟酸作为配体，共溶于N,N‑二甲基乙酰胺、无水乙醇和水的混合溶液中超声分散均匀，在150 180℃条件下反应18 24小时，自然冷却至室温，离心洗涤收集沉淀物~ ~并干燥，制得具有四酶活性的荔枝状氧化亚铜/氧化铜纳米微球；

上述制备过程中，三水硝酸铜与异烟酸的摩尔质量比为1 2︰1，N,N‑二甲基乙酰胺、无~水乙醇和水的体积比为8 10︰4 6︰1。

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2.如权利要求1所述具有四酶活性的荔枝状氧化亚铜/氧化铜纳米微球的制备方法，其特征在于：离心是以8000r/min离心1 3 min。

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3.如权利要求1所述具有四酶活性的荔枝状氧化亚铜/氧化铜纳米微球的制备方法，其特征在于：沉淀物干燥是在40 60℃下干燥8小时。

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4.如权利要求1所述具有四酶活性的荔枝状氧化亚铜/氧化铜纳米微球的制备方法，其特征在于：Cu2O/CuO纳米微球具有如下四种酶活性：过氧化物酶、过氧化氢酶、漆酶以及超氧化物歧化酶。

说明书

具有四酶活性的荔枝状氧化亚铜/氧化铜纳米微球的制备

方法

技术领域

[0001] 本发明属于仿生纳米复合材料技术领域，涉及一种Cu2O/CuO纳米微球的制备方法，尤其涉及Cu2O/CuO NMSs四酶活性的纳米复合材料的制备方法。

背景技术

[0002] 天然酶是一种重要的生物催化剂，在信号传导、代谢和消化等生物过程中介入多种反应。由于其具有较高的底物特异性和催化效率，被广泛应用于工业、医疗和生物等领域。然而，由于天然酶的稳定性差、对环境变化敏感以及纯化和储存困难，往往在实际应用中受到了一定的限制。因此，研究人员一直致力于研究具有类酶活性的纳米材料（纳米酶）来替代天然酶。早在2007年研究人员就报道了一种具有类过氧化物酶活性的纳米材料Fe3O4 NPs。纳米酶作为天然酶的仿制品，具有成本低、制备方便、稳定性好、耐久性好等优点，因此，受到了广泛关注。

[0003] 近年来，国内外研究者报道了许多具有模拟酶活性的纳米材料。纳米材料能够单一的表现出过氧化物酶、氧化酶、过氧化氢酶、漆酶、超氧化物歧化酶以及抗坏血酸氧化酶模拟活性等。不仅如此，有些纳米材料甚至可以同时表现出双重酶活性或者多重酶活性。尽管纳米酶学已经取得了很大的成就，但也仍然存在一些瓶颈，限制了纳米酶的进一步发展和应用。纳米酶的缺陷主要存在以下几点：其一，纳米酶的制备方法没有重大突破。合成路径复杂耗时，合成条件苛刻，难于大规模生产；其二，纳米酶的催化活性仍然远低于相应的天然对应物；其三，纳米酶的类酶活性较单一，生物利用率低且多酶模拟物之间存在相互干扰等问题。因此，着力于研究纳米酶仍具有重要意义。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种具有四酶活性的荔枝状氧化亚铜/氧化铜（Cu2O/CuO）纳米微球的制备方法，以解决纳米酶合成路径复杂，合成条件苛刻，类酶活性单一，难于大规模生产的问题。

[0005] 一、Cu2O/CuO NMSs制备

[0006] Cu2O/CuO NMSs是通过一步溶剂热法制备的，具体是以三水硝酸铜作为铜源，异烟酸作为配体，共溶于N,N‑二甲基乙酰胺、无水乙醇和水的混合溶液中超声分散均匀，在150℃条件下反应18 24小时，自然冷却至室温，得到黑棕色溶液，离心洗涤收集沉淀物，干燥，~制得具有四酶活性的荔枝状Cu2O/CuO纳米微球。

[0007] 所述三水硝酸铜与异烟酸的摩尔质量比为1 2︰1。N,N‑二甲基乙酰胺、无水乙醇和~水的体积比为8 10︰4 6︰1。离心是以8000r/min离心1 3min。沉淀物干燥是在40 60℃下干~ ~ ~ ~
燥8小时。

[0008] 上述Cu2O/CuO NMSs制备过程中，Cu(NO3)2·3H2O提供了Cu源用于与含羧酸类有机配体异烟酸螯合。由于羧基能够与多价态金属离子以多变的配位方式键合来构筑结构新颖的纳米材料，从而为模拟多活性纳米酶提供了更多可能。同时，过渡金属元素Cu和异烟酸的使用满足了纳米材料的成本低廉的要求。

[0009] 二、Cu2O/CuO NMSs的四酶活性探究

[0010] 类过氧化物酶活性的探究：在酸性条件下构建的Cu2O/CuO NMSs‑H2O2‑TMB反应体系中，Cu2O/CuO NMSs表现出了与天然的过氧化物酶活性相同的催化特性。在过氧化氢（H2O2）的存在下，Cu2O/CuO NMSs有效的催化了H2O2的分解产生羟基自由基（•OH），将显色底物3,3',5,5'‑四甲基联苯胺（TMB）氧化为蓝色的产物（氧化态的TMB）。通过分析652nm处的吸光度变化即可获知纳米酶的酶活性。

[0011] 类过氧化氢酶活性的探究：基于H2O2是一种不稳定的化合物，在过氧化氢酶的作用下能够被分解产生O2和H2O。因而，在密闭的弱碱环境下，构建H2O2和Cu2O/CuO NMSs‑H2O2反应体系，测定了两个体系的压力值，作为评价H2O2的分解速率强弱的指标。与H2O2体系相比Cu2O/CuO NMSs‑H2O2反应体系中Cu2O/CuO NMSs有效的分解了H2O2，导致产生了大量气体增加了空间内的气压。

[0012] 类漆酶活性的探究：多巴胺作为一种显色底物，漆酶能将其催化氧化生成红棕色物质。基于漆酶活性的特性，由于盐酸多巴胺在弱碱条件下会脱掉盐酸多巴胺的盐酸基团而形成多巴胺，因此在弱碱条件下构建盐酸多巴胺（HCl‑DA）和Cu2O/CuO NMSs‑HCl‑DA反应体系。作为结果，Cu2O/CuO NMSs催化多巴胺的氧化，会在475 nm处显示出的特征峰。

[0013] 类超氧化物歧化酶的探究：超氧化物歧化酶的探究采用了经典的硝基四氮唑蓝光还原法。首先在弱碱性的条件构建一个氯化硝基四氮唑蓝（NBT）‑核黄素‑蛋氨酸‑乙二胺四2‑
乙酸（EDTA）反应体系，这一体系经过光照时会使得核黄素产生超氧阴离子自由基（O ）进而将氯化硝基四氮唑蓝还原成λmax为560nm的蓝紫色甲臜产物。一旦有超氧化物歧化酶引入于上述构建的体系之中，形成的蓝紫色甲臜产物的量大幅降低，这是由于超氧化物歧化酶消除了产生的超氧阴离子自由基。构建的Cu2O/CuO NMSs‑NBT‑核黄素‑蛋氨酸‑EDTA反应体系，在560 nm处显示出了弱的吸收，因此表明了Cu2O/CuO NMSs具有类超氧化物歧化酶特性。

[0014] 由于荔枝状Cu2O/CuO纳米微球的多酶活性，纳米酶具有潜在的生物应用。基于Cu2O/CuO纳米微球的抗氧化活性的纳米酶（类过氧化氢酶，类超氧化物歧化酶）可以通过级联反应有效去除活性氧物种，治疗氧化应激引起的各种疾病。另一方面，基于Cu2O/CuO纳米微球的促氧化活性的纳米酶（类过氧化物酶），可通过级联反应和协同效应在体内催化大量活性氧物种的产生，广泛应用于生物传感，抗癌和抗菌治疗。然而，单独的抗氧化或促氧化纳米酶在生物医学应用中也受到限制。例如，在抗肿瘤应用中，由于肿瘤微环境缺氧，促氧化纳米酶的作用受到限制。抗氧化酶和促氧化酶协同作用可提供氧气并促进产生活性氧物种杀死肿瘤细胞。在急性肾损伤的治疗中，抗氧化酶和促氧化酶的协同作用可以有效控制疾病引起的活性氧物种产生的增加。因此，荔枝状Cu2O/CuO纳米微球的类抗氧化和类促氧化纳米酶的协同作用可以大大扩展纳米酶的应用范围。

[0015] 综上，本发明公开了一种一步溶剂热法制备多酶活性纳米材料的方法，制备的Cu2O/CuO NMSs具有与过氧化物酶，过氧化氢酶，超氧化物歧化酶以及漆酶等4种天然酶相同的酶活性。其中，Cu2O/CuO NMSs的过氧化物酶，超氧化物歧化酶以及漆酶活性通过构建经典的比色系统得到了充分证明，而Cu2O/CuO NMSs的过氧化氢酶活性则通过系统的压力变化程度进行了评估。总而言之，本发明制备的Cu2O/CuO NMSs是一种具有广阔应用前景的多酶活性纳米材料。

附图说明

[0016] 图1是本发明制备的Cu2O/CuO NMSs的四酶活性示意图；

[0017] 图2A是Cu2O/CuO NMSs放大至1μm的扫描电镜图，图2B是图2A中框选部分放大至200nm的扫描电镜图；

[0018] 图2C是Cu2O/CuO NMSs的能量色散X射线光谱图，

[0019] 图2D是Cu2O/CuO NMSs放大至0.5μm的扫描电镜图，图2E是图2D中框选部分放大至100nm的扫描电镜图；

[0020] 图2F是图2D中框选部分放大至5nm的扫描电镜图，其中的插图是图中选定区域内电子衍射图；

[0021] 图2G、2H、2I、2J和2K是Cu2O/CuO NMSs的元素图谱图像；

[0022] 图3是Cu2O/CuO NMSs的X‑射线粉末衍射光谱图；

[0023] 图4是TMB，TMB‑H2O2，Cu2O/CuO NMSs‑ H2O2，Cu2O/CuO NMSs ‑TMB和Cu2O/CuO NMSs‑TMB‑H2O2四种反应体系的紫外‑可见吸收光谱图；

[0024] 图5是H2O2和Cu2O/CuO NMSs‑H2O2两种反应体系的气压对比图；

[0025] 图6是DA，H2O2以及Cu2O/CuO NMSs‑DA反应体系的紫外‑可见吸收光谱图；

[0026] 图7是NBT‑核黄素‑蛋氨酸‑EDTA和Cu2O/CuO NMSs‑NBT‑核黄素‑蛋氨酸‑EDTA两种反应体系紫外‑可见吸收光谱图。

具体实施方式

[0027] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释说明。

[0028] 实施例1

[0029] Cu2O/CuO NMSs的制备

[0030] 首先，准确称取48.5mg三水硝酸铜和24.6mg的异烟酸，将其按照先后顺序加入到含有18mL N,N‑二甲基乙酰胺、10mL无水乙醇和2mL蒸馏水的混合溶液中。其次，通过超声波分散10min使其完全溶解。接着，将混合溶液装入50mL的聚四氟乙烯的反应釜中，在150℃下反应24h。待冷却至室温后以8000r/min离心收集固体。紧接着分别用N,N‑二甲基乙酰胺，乙醇，去离子水洗涤三次上一步的固体并收集沉淀，沉淀即为Cu2O/CuO NMSs。最后，将Cu2O/CuO NMSs在60℃的真空干燥箱中干燥8h得到Cu2O/CuO NMSs的粉末样品。

[0031] 结构表征：图2A、B、D、E、F是Cu2O/CuO NMSs的扫描电子显微镜照片，透射电子显微镜成像对Cu2O/CuO NMSs的形貌进行了表征，可以看出Cu2O/CuO NMSs具有荔枝状的形态；同时由图2C可以看出Cu2O/CuO NMSs含C、N、O以及Cu元素，并且元素mapping成像（图2G‑K）可以看出C、N、O以及Cu元素都均匀的分布在Cu2O/CuO NMSs中。图3是Cu2O/CuO NMSs的X‑射线粉末衍射光谱图，该光谱图中的Cu2O、CuO特征峰与Cu2O（JCPDS no.48‑0667），CuO（JCPDS no.48‑1548）的特征衍射峰一致，表明Cu2O/CuO NMS的形成由Cu2O和CuO组成。

[0032] Cu2O/CuO NMSs的四酶模拟活性探究

[0033] Cu2O/CuO NMSs的过氧化物酶活性，是通过在H2O2的条件下催化显色底物TMB氧化形成氧化态TMB进行验证的。首先，将Cu2O/CuO NMSs(13 μg/mL，10μL)、H2O2（10M，60μL）和TMB（50mM，100μL）依次加入醋酸‑醋酸钠（pH=4.4, 0.2M）的缓冲溶液中，反应体系的总体积为2mL。然后，在室温下反应2min后，通过紫外可‑见分光光度计记录655 nm处的吸光度。TMB、TMB‑ H2O、Cu2O/CuO NMSs‑H2O2和Cu2O/CuONMSs‑TMB反应体系的构建与Cu2O/CuO NMSs‑TMB‑H2O2基本相同，唯一不同是TMB反应体系缺少了Cu2O/CuO NMSs和H2O2；Cu2O/CuO NMSs‑H2O2反应体系缺少了TMB；Cu2O/CuO NMSs‑TMB反应体系缺少了H2O2。图4中Cu2O/CuO NMSs‑TMB‑H2O2反应体系在655nm处的吸光度明显高于TMB，TMB‑H2O2，Cu2O/CuO NMSs‑H2O2，Cu2O/CuO NMSs‑TMB和Cu2O/CuO NMSs‑TMB‑H2O2，证明了Cu2O/CuO NMS催化氧化了TMB生成蓝色的Ox TMB。

[0034] Cu2O/CuO NMSs的过氧化氢酶活性是基于过氧化氢酶催化H2O2的分解生成气体加以证明的。首先在含有940μL的三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）‑盐酸（HCl）(pH=8，0.05M)的缓冲溶液的1.5mL的进样瓶中加入Cu2O/CuO NMSs（40μL,13μg/mL）和H2O2（10μL，10M）。然后拧好盖子在室温下反应20min后用便携式气压计测定其混合体系的压力值，并与单一H2O2体系的压力值进行对比。图5是测得的H2O2，Cu2O/CuO NMSs‑H2O2反应体系的压力值，由于Cu2O/CuO NMSs催化H2O2的分解造成了密闭空间内压力的升高。

[0035] Cu2O/CuO NMSs的漆酶活性是基于漆酶催化多巴胺的氧化生成红棕色的氨基络合物加以证明的。首先是将Cu2O/CuO NMSs(50μL，13μg/mL)和HCl‑DA(10mM，100μL)依次加入到1.85 mL的三（羟甲基）氨基甲烷‑盐酸(PH=7.7，0.05M) 缓冲溶液中。在室温下反应20 min后，通过紫外‑可见分光光度计记录波长为475nm处的吸光度变化，由于反应体系的颜色会从无色转变为红棕色。图6表明了Cu2O/CuO NMSs有效的催化氧化了多巴胺生成了红棕色物质，在475nm处的吸光度显著增加了。

[0036] Cu2O/CuO NMSs的超氧化物歧化酶是通过利用光反应产生的活性氧将氯化硝基四氮唑蓝还原被证实。首先在三（羟甲基）氨基甲烷‑盐酸(PH=7.5，0.05M)缓冲溶液中，加入氯化硝基四氮唑蓝(10mM, 20 μL)、核黄素(1M，10μL)、蛋氨酸(1M，30μL)和乙二胺四乙酸(10mM，20μL)，反应体系的总体积始终保持为2 mL。先在黑暗的环境下反应5分钟，再在光照(5W)下反应5min后，通过紫外‑可见分光光度计记录560 nm处的吸光度。然后在三（羟甲基）氨基甲烷‑盐酸(PH=7.5，0.05M)缓冲溶液中，加入Cu2O/CuO NMSs (20μL，13μg/mL)，氯化硝基四氮唑蓝(10mM, 20 μL)，核黄素(1M，10μL)，蛋氨酸(1M，30μL)，乙二胺四乙酸(10mM，20μL)通过紫外‑可见分光光度计记录560nm处的吸光度。最后，比较两种体系的在560 nm处的吸光度，图7显示了NBT‑核黄素‑蛋氨酸‑EDTA和Cu2O/CuO NMSs‑NBT‑核黄素‑蛋氨酸‑EDTA反应体系的吸光度变化，Cu2O/CuO NMS消除了在光照下由于核黄素的存在产生的超氧阴离子自由基，使得560nm处的吸光度显著降低。