一组特异识别人绒毛促性腺激素的核酸适配体及应用

摘要

本发明属于生物医药领域，具体涉及一组特异识别人绒毛促性腺激素的核酸适配体及应用。具体地，本发明提供了一种核酸适配体，所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.1‑6任一所示。所述核酸适配体是DNA序列，不仅可以直接用于诊断，还可以作为分子探针构建生物检测传感器等。

权利要求

1.一种核酸适配体，所述核酸适配体的序列如SEQ ID NO.3所示。

2.一种核酸适配体的衍生物，所述核酸适配体的衍生物包括权利要求1所述的核酸适配体和标记所述核酸适配体的可检测标记物。

3.如权利要求2所述的核酸适配体的衍生物，所述可检测标记物包括酶、放射性核素、荧光染料、吖啶酯类化合物、磁珠、胶体金、有色玻璃、塑料珠、亲和素或生物素。

4.一种靶向hcg的探针的制备方法，所述方法包括获得权利要求1所述的核酸适配体，并使用可检测标记物标记所述核酸适配体。

5.如权利要求4所述的方法，所述获得权利要求1所述的核酸适配体的方法包括化学合成方法或生物扩增方法。

6.如权利要求5所述的方法，所述生物扩增方法包括变温扩增和恒温扩增；所述变温扩增包括聚合酶链式反应和连接酶链式反应，所述恒温扩增包括链置换扩增、滚环扩增、环介导扩增、依赖解旋酶恒温扩增、依赖核酸序列的扩增或转录依赖的扩增系统。

7.一种非诊断目的的检测hcg的方法，所述方法包括将待测物与权利要求1所述的核酸适配体接触，或者，将待测物与权利要求2所述核酸适配体的衍生物接触。

8.如权利要求7所述的方法，所述待测物包括采集自人体的样品。

9.如权利要求8所述的方法，所述样品包括血液、血清、血浆、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、淋巴、胞液、腹水、胸膜积液、羊水、膀胱冲洗液和支气管肺泡灌洗液。

10.如权利要求9所述的方法，所述样品包括尿液和血液。

11.权利要求1所述的核酸适配体或权利要求2所述核酸适配体的衍生物在制备特异性结合hcg或检测hcg的产品中的应用。

12.权利要求1所述的核酸适配体或权利要求2所述核酸适配体的衍生物在制备诊断hcg相关症状的产品中的应用。

13.如权利要求12所述应用，所述hcg相关症状包括受孕、绒毛膜癌、葡萄胎、多胎妊娠、先兆/早期流产、异位妊娠、妊娠中毒、胎儿宫内死亡、21三体综合征、妊娠期高血压疾病、生殖细胞肿瘤、卵巢肿瘤、膀胱肿瘤、胰腺肿瘤、胃肿瘤、肺肿瘤和肝脏肿瘤。

说明书

一组特异识别人绒毛促性腺激素的核酸适配体及应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及一组特异识别人绒毛促性腺激素的核酸适配体及应用。

背景技术

[0002] 人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hcg)是一种由胎盘绒毛膜囊泡的滋养层细胞分泌的糖蛋白激素，由α亚基和β亚基两条不同的亚基和244种氨基酸组成，分子量约为36.7kda。在结构上，α亚基与很多激素如促甲状腺激素、卵泡刺激素等相似，而β亚基是hcg特有的，故临床上hcg检测主要是利用β亚基的特异性。胎盘可产生hcg，滋养层细胞瘤、含滋养层组织的生殖细胞瘤以及一些非滋养层细胞瘤也可产生hcg。妊娠妇女血清中主要含有完整分子的hcg，其浓度会在怀孕早期呈指数型增长，并与时间有关，这对维持妊娠起着重要作用。

[0003] 若hcg数值的变化不规律，特定时间过高或者过低，说明妊娠异常。检测结果的异常偏高提示绒毛膜癌、葡萄胎或多胎妊娠可能，检测结果偏低则提示先兆/早期流产、异位妊娠、妊娠中毒或胎儿宫内死亡。结合甲胎蛋白检测和准确的孕龄、孕妇体重等其他参数，检测hcg+β有助于在孕中期评价21三体综合征的风险，21三体孕妇的血清甲胎蛋白浓度降低，而母体血清hcg+β浓度可达到正常中位值的两倍。监测人绒毛膜促性腺激素水平可以预测妊高征的发生，对妊娠期高血压疾病的病程诊断有着重要的指导意义。hcg也是一种重要的血清和尿液肿瘤标志物，与妊娠无关的hcg浓度升高还可见于生殖细胞、卵巢、膀胱、胰腺、胃、肺和肝脏肿瘤病人。目前常用的检测方法有：胶乳集抑制试验和血凝抑制试验、放射免疫试验(RIA)、吸附试验(ELISA)、单克隆抗体胶体金试验。

[0004] 指数富集的配基系统进化技术，简称SELEX(Systematic volution of Ligands by EXponential Enrichment)技术，是近十几年兴起并迅速得到发展的高通量生物文库筛选技术。应用大容量的随机寡核苷酸文库(ssDNA文库和RNA文库)，结合PCR体外扩增技术，以指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过反复的体外筛选、扩增，最终获得的核酸适配体(aptamer)基于空间结构与靶分子呈高特异性和高亲和力的结合。

[0005] 核酸适配体具有精确识别、无免疫原性、易体外合成与修饰等优点，又称为“人工替代抗体”，在基础医学、临床诊断与新药研发等方面具有广阔的应用前景。

发明内容

[0006] 本发明通过SELEX技术以人绒毛膜促性腺激素作为靶标，筛选获得了一组特异识别人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hcg)的核酸适配体HCG‑1、HCG‑3、HCG‑4、HCG‑5、HCG‑7、HCG‑15及其在识别人绒毛膜促性腺激素中的应用。所述核酸适配体是DNA序列，不仅可以直接用于诊断，还可以作为分子探针构建生物检测传感器等。经鉴定该核酸适配体及其截短序列均能够特异识别人绒毛膜促性腺激素，而不结合其它无关蛋白(BSA蛋白)，对照核酸序列与人绒毛膜促性腺激素均无结合。

[0007] 具体技术方案如下：

[0008] 一方面，本发明提供了一种核酸适配体，所述核酸适配体的序列如SEQ IDNO.1‑6任一所示。

[0009] 优选地，所述核酸适配体还可以是相对于SEQ ID NO.1‑6任一所示序列增加或删减1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸得到的特异性结合hcg的核酸分子；

[0010] 优选地，所述核酸适配体还可以是与SEQ ID NO.1‑6任一所示序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性的核酸分子；

[0011] 优选地，所述核酸适配体的序列还可以与SEQ ID NO.1‑6任一所示序列反向互补。

[0012] 优选地，所述核酸包括DNA、RNA或二者的杂合体。

[0013] 优选地，所述核酸适配体是DNA。

[0014] 所述“同源性”指序列相似性，同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。

[0015] 如本发明所述，术语“核酸适配体”是指一种能和靶分子特异性结合的单链寡核苷酸。核酸适配体识别靶分子的原理：单链寡核苷酸通过核苷酸碱基互补配对、氢键、π‑π堆积、静电作用力等多种相互作用力发生自身适应性折叠后形成特定的三维结构，这种三维结构通过分子间作用力与靶分子特异性结合。其结合解离常数能达到纳摩尔和皮摩尔水平，与单克隆抗体相当。本发明所感兴趣的靶分子是hcg。

[0016] 本发明中，术语“hcg”、“HCG”、“hCG”、“human chorionic gonadotropin”、“人绒毛膜促性腺激素”表示相同含义，可互换使用。

[0017] 如本文中使用的，术语“特异性结合”是指本发明提供的核酸适配体与hcg之间的结合反应是非随机的。本发明提供的核酸适配体不与其他蛋白结合。

[0018] 另一方面，本方面提供了一种核酸适配体的衍生物，所述核酸适配体的衍生物包括核酸适配体和标记所述核酸适配体的可检测标记物。

[0019] 优选地，所述可检测标记物包括酶(如过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶等)、放3 125 35 14 32
射性核素(如 H、 I、S、C、P等)、荧光染料(如FITC、TRITC、PE、Texas Red、Cy7、Alexa 
750、VIC、JOE、TET、CY3等)、吖啶酯类化合物、磁珠、胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)、生物素。

[0020] 如本文中所使用的，术语“可检测的标记物”是指，可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。

[0021] 如本发明具体实施例所使用的可检测标记物是生物素，其标记核酸适配体的方法是本领域常规的。

[0022] 优选地，所述核酸适配体或其衍生物在日常储存中可固定于合适的固相载体上，以便于更方便、可视化的检测、鉴定hcg；或者所述核酸适配体、可检测标记物标记的核酸适配体也可以存储与合适的液体中以保持其稳定性，例如水、缓冲液。

[0023] 另一方面，本发明提供了一种靶向hcg的探针的制备方法，所述方法包括获得本发明所述核酸适配体，并使用可检测标记物标记所述核酸适配体。

[0024] 优选地，所述获得本发明所述核酸适配体可以通过化学合成、生物扩增方法获得。

[0025] 优选地，所述生物扩增方法包括本领域任意一种常规的核酸扩增技术，具体地，所述生物扩增方法包括：变温扩增和恒温扩增。所述变温扩增主要包括经典的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)和连接酶链式反应(Ligase Chain Reaction，简称LCR)，而恒温扩增包括链置换扩增(Strand displacement amplification，简称SDA)、滚环扩增(Rolling Circle amplification，简称RCA)、环介导扩增(Loop Mediated Amplification，简称LAMP)、依赖解旋酶恒温扩增(Helicase‑dependent Isothermal DNA Amplification，简称HDA)、依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence based amplification，简称NASBA)、转录依赖的扩增系统(Transcription‑based Amplification System，简称TAS)等。

[0026] 优选地，所述将可检测标记物标记所述核酸适配体的步骤可以使用本领域任何可选的方法。

[0027] 另一方面，本发明提供给了一种检测hcg的方法，所述方法包括将待测物与本发明所述核酸适配体或其衍生物接触。

[0028] 优选地，所述待测物包括采集自人体的样品。

[0029] 优选地，所述样品包括外周血、组织、血液、血清、血浆、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、痰、粘液、淋巴、胞液、腹水、胸膜积液、羊水、膀胱冲洗液和支气管肺泡灌洗液。

[0030] 优选地，所述样品包括尿液和血液。

[0031] 优选地，所述方法是非诊断目的的。

[0032] 优选地，所述核酸适配体或其衍生物是经过变性处理的。

[0033] 更优选地，所述变性处理的具体步骤是：将核酸适配体溶解在缓冲液中，100℃变性后冷却；

[0034] 优选地，所述缓冲液的成分是50mM HEPES，100mM NaCl，2mM MgCl2，5mM KCl，1mM CaCl2。

[0035] 优选地，所述接触保持至少5、10、15、20、30、40分钟或更长时间。

[0036] 优选地，所述方法还包括使用报告集团使检测结果可视化的步骤。具体地例如，当使用生物素为可检测标记物时，使用报告基团HRP酶。

[0037] 另一方面，本发明还提供了本发明核酸适配体及其衍生物在特异性结合hcg中的应用。

[0038] 优选地，所述特异性结合是在体外发生的、非诊断目的的。

[0039] 优选地，所述检测包括定量检测或定性检测，所述定性检测的结果包括待测物中“存在”或“不存在”hcg。

[0040] 另一方面，本发明还提供了本发明核酸适配体及其衍生物在制备诊断hcg相关症状的产品中的应用。

[0041] 优选地，所述hcg相关症状包括受孕、绒毛膜癌、葡萄胎、多胎妊娠、先兆/早期流产、异位妊娠、妊娠中毒、胎儿宫内死亡、21三体综合征、妊娠期高血压疾病、生殖细胞肿瘤、卵巢肿瘤、膀胱肿瘤、胰腺肿瘤、胃肿瘤、肺肿瘤和肝脏肿瘤。

[0042] 优选地，所述产品包括试剂盒、试纸或生物传感器。

附图说明

[0043] 图1是HCG‑1特异结合人绒毛促性腺激素hCG的EMSA实验结果图。

[0044] 图2是HCG‑3特异结合人绒毛促性腺激素hCG的EMSA实验结果图。

[0045] 图3是HCG‑4特异结合人绒毛促性腺激素hCG的EMSA实验结果图。

[0046] 图4是HCG‑5特异结合人绒毛促性腺激素hCG的EMSA实验结果图。

[0047] 图5是HCG‑7特异结合人绒毛促性腺激素hCG的EMSA实验结果图。

[0048] 图6是HCG‑15特异结合人绒毛促性腺激素hCG的EMSA实验结果图。

[0049] 图7是酶联法检测的结果统计图。

具体实施方式

[0050] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

[0051] 实施例1、EMSA实验验证核酸适配体的特异性

[0052] 1、实验材料

[0053] (1)人绒毛膜促性腺激素：华阳正龙货号：201215

[0054] (2)牛血清白蛋白(BSA)：北京中生奥邦生物公司货号：01.10001D

[0055] (3)生物素标记的核酸适配体：生工合成，具体序列如表1所示

[0056] (4)HRP酶：Solarbio货号898800

[0057] 表1、核酸适配体的序列

[0058]

[0059] 2、实验方法

[0060] 2.1分别将一定浓度的生物素标记的核酸适配体HCG‑1、HCG‑3、HCG‑4、HCG‑5、HCG‑7、HCG‑15和生物素标记的无关对照序列AAAA溶解于合适体积的缓冲液中(50mM HEPES,
100mM NaCl，2mM MgCl2，5mM KCl，1mM CaCl2)，于100℃变性5min后立即置于冰上充分冷却；

[0061] 2.2将经过变性处理后的生物素标记核酸适配体与人绒毛促性腺激素hCG蛋白(或者无关蛋白BSA)在37℃共孵育40min；

[0062] 2.3适配体与人绒毛促性腺激素hCG的共同孵育体系加入10×DNA上样缓冲液，6％天然PAGE胶电泳分离；

[0063] 2.4卸胶后转模，紫外交联2min后封闭液封闭30min；

[0064] 2.5将膜放入按照1:1000稀释好的HRP酶中，室温孵育40min，将膜取出并洗膜2次，每次10min；

[0065] 2.6加TMB底物显色并留图。

[0066] 3、实验结果

[0067] HCG‑1、HCG‑3、HCG‑4、HCG‑5、HCG‑7、HCG‑15特异结合人绒毛促性腺激素hCG的EMSA实验结果图依次如图1‑6所示。

[0068] 实施例2、酶联法验证核酸适配体的特异性

[0069] 1、实验材料

[0070] 同实施例1。

[0071] 2、实验方法

[0072] 2.1将一定量的人绒毛促性腺激素hCG融于pH 9.7的碳酸盐缓冲液中，按照100μl/孔加入到酶联条中，4℃包被过夜；

[0073] 2.2弃包被液，每孔加入100μl含2％ BSA封闭液，室温封闭60min；

[0074] 2.3分别将一定浓度的生物素标记的核酸适配体HCG‑1、HCG‑3、HCG‑4、HCG‑5、HCG‑7、HCG‑15和生物素标记的无关对照序列AAAA溶解于合适体积的缓冲液中(50mM HEPES,
100mM NaCl，2mM MgCl2，5mM KCl，1mM CaCl2)，于100℃变性5min后立即置于冰上充分冷却；

[0075] 2.4将经过变性处理后的生物素标记的HCG核酸适配体和无关对照序列Bio‑AAAA加入酶联条中，使核酸适配体与包被的人绒毛促性腺激素hCG蛋白共同孵育37℃30min；

[0076] 2.5弃去孔内液体，每孔用200μl的洗涤液洗涤，重复洗涤3次，最后一次洗涤后要把孔内液体完全甩干；

[0077] 2.6每孔加入100μl按照1:100稀释好的HRP酶，室温孵育40min，弃去孔内液体，洗板5次，方法同上；

[0078] 2.7每孔加入100μl TMB显色底物，37℃避光显色，当有明显颜色变化时，加10μl终止液，酶联仪读数。

[0079] 3、实验结果

[0080] 酶联仪读数结果统计如图7所示，如图证明与无关序列和对照序列相比HCG‑1、HCG‑3、HCG‑4、HCG‑5、HCG‑7、HCG‑15适配体均可以特异结合人绒毛膜促性腺激素。