一种R-丁酸缩水甘油酯中S-缩水甘油的检测方法

摘要

本发明涉及药物分析领域，具体公开了一种R‑丁酸缩水甘油酯中S‑缩水甘油的检测方法。本发明通过特定的色谱条件，可以将R‑丁酸缩水甘油酯与S‑缩水甘油有效分离，并准确定量R‑丁酸缩水甘油酯中的工艺杂质S‑缩水甘油，测定结果稳定可靠，专属性强。

权利要求

1.一种R‑丁酸缩水甘油酯中S‑缩水甘油的检测方法，其特征在于：它是采用气相色谱法检测，具体步骤如下：a、供试品溶液制备：取待测R‑丁酸缩水甘油酯，加甲醇溶解，即得；

b、系统适用性溶液的制备：取S‑缩水甘油对照品，加甲醇溶解，得S‑缩水甘油溶液；取R‑丁酸缩水甘油酯对照品，加S‑缩水甘油溶液溶解，再加甲醇混匀，即得；

c、分别吸取供试品溶液和系统适用性溶液注入色谱仪，色谱条件如下：色谱柱：Agilent HP‑5，规格为30m×0.32mm×0.5μm；色谱柱升温程序：初始温度50℃，保持3min，再

10℃/min升温至250℃，保持5min；载气：氮气；进样口温度：250℃，分流比：20:1；检测器温度：300℃，FID检测器；色谱柱流量：2ml/min，进样量0.5μl。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤a）所述待测R‑丁酸缩水甘油酯与甲醇的质量体积比为25 125mg：1ml。

~

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤b）所述系统适用性溶液每1ml含S‑缩水甘油0.1  0.4 mg，R‑丁酸缩水甘油酯25 125mg。

~ ~

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述供试品溶液的色谱图中呈现与系统适用性溶液色谱图中S‑缩水甘油色谱峰保留时间相对应的色谱峰，即供试品中含有S‑缩水甘油。

5.一种R‑丁酸缩水甘油酯中S‑缩水甘油的含量测定方法，具体操作步骤如下：

1）按权利要求1 4任一项所述方法检测；

~

2）计算S‑缩水甘油含量，计算公式如下：xⅰ%=Aⅰ×F/A×100%；

其中，xⅰ%为供试品中S‑缩水甘油的含量，Aⅰ为供试品溶液中S‑缩水甘油的峰面积，F为供试品溶液中S‑缩水甘油的校正因子，A为供试品溶液中所有峰面积之和。

6.根据权利要求5所述的含量测定方法，其特征在于：所述S‑缩水甘油的校正因子为

1.83。

说明书

一种R‑丁酸缩水甘油酯中S‑缩水甘油的检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及药物检测领域，具体涉及一种R‑丁酸缩水甘油酯中S‑缩水甘油的检测方法。

背景技术

[0002] 磷酸特地唑胺是由Cubist制药公司研发的一种新型噁唑烷酮类抗菌素，临床上主要用于治疗，金黄色葡萄球菌(包括耐甲氧西林菌株、甲氧西林敏感菌株)和各种链球菌属和粪肠球菌等革兰氏阳性细菌引起的急性细菌性皮肤和皮肤结构感染。此手性药物分子的构型为R型有效，在它的合成过程中，需要一个重要的起始物料R‑丁酸缩水甘油酯。根据ICH M7中的相关规定，其中S‑缩水甘油属于致突变杂质，需要在起始物料R‑丁酸缩水甘油酯中严格控制其含量，从而进一步保证将磷酸特地唑胺API中S‑缩水甘油控制在符合要求的限度内。

[0003] R‑丁酸缩水甘油酯的分子式为C7H12O3，结构式如下：

[0004]

[0005] 解析R‑丁酸缩水甘油酯的化学结构和其合成工艺发现：化学名称为S‑缩水甘油的物质是R‑丁酸缩水甘油酯的关键中间体，工艺中很可能会残留该工艺杂质S‑缩水甘油，同时开发该工艺杂质S‑缩水甘油的分析检测方法，并进行定性定量分析，可严格控制R‑丁酸缩水甘油酯的质量品质，从而保证产品磷酸特地唑胺API的质量符合要求。

[0006]

发明内容

[0007] 为了有效控制R‑丁酸缩水甘油酯的质量品质，进而保证磷酸特地唑胺API中S‑缩水甘油控制在符合要求的限度内。本发明提供了一种R‑丁酸缩水甘油酯，其中S‑缩水甘油含量不高于0.3%。

[0008] 进一步地，所述R‑丁酸缩水甘油酯中S‑缩水甘油含量不高于0.15%。

[0009] 本发明还提供了一种R‑丁酸缩水甘油酯中S‑缩水甘油的检测方法，它是采用气相色谱法检测，具体步骤如下：

[0010] a、供试品溶液制备：取待测R‑丁酸缩水甘油酯，加甲醇溶解，即得；

[0011] b、系统适用性溶液的制备：取S‑缩水甘油对照品，加甲醇溶解，得S‑缩水甘油溶液；取R‑丁酸缩水甘油酯对照品，加S‑缩水甘油溶液溶解，再加甲醇混匀，即得；

[0012] c、分别吸取供试品溶液和系统适用性溶液注入色谱仪，色谱条件如下：色谱柱：Agilent HP‑5；色谱柱升温程序：初始温度50℃，保持3min，再10℃/min升温至250℃，保持
5min。

[0013] 进一步地，步骤a）所述待测R‑丁酸缩水甘油酯与甲醇的质量体积比为25 125mg：~
1ml。

[0014] 进一步地，步骤b）所述系统适用性溶液每1ml含S‑缩水甘油0.1  0.4 mg，R‑丁酸~缩水甘油酯25 125mg。
~

[0015] 进一步地，步骤c）所述Agilent HP‑5的规格为30m×0.32mm×0.5μm。

[0016] 进一步地，步骤c）所述色谱条件中载气：氮气；进样口温度：250℃，分流比：20:1；检测器温度：300℃，FID检测器；色谱柱流量：2ml/min，进样量0.5μl。

[0017] 进一步地，所述供试品溶液的色谱图中呈现与系统适用性溶液色谱图中S‑缩水甘油色谱峰保留时间相对应的色谱峰，即供试品中含有S‑缩水甘油。

[0018] 本发明还提供了一种R‑丁酸缩水甘油酯中S‑缩水甘油的含量测定方法，具体操作步骤如下：

[0019] 1）按前述方法检测；

[0020] 2）计算S‑缩水甘油含量，计算公式如图10，图10中xⅰ%为供试品中S‑缩水甘油的含量，Aⅰ为供试品溶液中S‑缩水甘油的峰面积，F为供试品溶液中S‑缩水甘油的校正因子，A为供试品溶液中所有峰面积之和。

[0021] 进一步地，所述S‑缩水甘油的校正因子为1.83。

[0022] 本发明R‑丁酸缩水甘油酯中S‑缩水甘油的检测方法，可以将R‑丁酸缩水甘油酯与工艺杂质S‑缩水甘油有效分离，可以用于检测R‑丁酸缩水甘油酯中的该杂质，准确测量R‑丁酸缩水甘油酯药物中工艺杂质S‑缩水甘油的含量，测定结果稳定可靠，专属性强。

[0023] 经方法学验证表明，本发明符合《中国药典》2020年版对分析方法学的要求。本发明检测方法可有效监控R‑丁酸缩水甘油酯的合成过程，用于R‑丁酸缩水甘油酯的质量检测，保证其质量，应用前景广阔。

[0024] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

[0025] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

[0026] 图1 R‑丁酸缩水甘油酯对照品HNMR图；

[0027] 图2 R‑丁酸缩水甘油酯对照品CNMR图；

[0028] 图3 R‑丁酸缩水甘油酯对照品GC纯度色谱图；

[0029] 图4 实施例1供试品溶液GC图；

[0030] 图5 实施例2供试品溶液GC图；

[0031] 图6 系统适用性溶液的GC图谱；

[0032] 图7 空白溶液GC图；

[0033] 图8 工艺杂质S‑缩水甘油定位溶液GC图；

[0034] 图9 供试品溶液的GC图；

[0035] 图10 S‑缩水甘油含量计算公式的图；

[0036] 图11系统适用性评价结果的图；

[0037] 图12专属性实验结果的图；

[0038] 图13工艺杂质S‑缩水甘油的定量限和检测限测试结果的图；

[0039] 图14工艺杂质S‑缩水甘油的线性与范围测试结果的图；

[0040] 图15 R‑丁酸缩水甘油酯线性与范围测试结果的图；

[0041] 图16有关物质校正因子的图；

[0042] 图17重复性测试结果的图；

[0043] 图18中间精密度的图；

[0044] 图19工艺杂质S‑缩水甘油回收率的图。

具体实施方式

[0045] 本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

[0046] （1）主要材料

[0047] R‑丁酸缩水甘油酯样品：上海科利生物医药有限公司提供，批号KL20210509，KL20211222。

[0048] R‑丁酸缩水甘油酯对照品：上海科利生物医药有限公司提供，批号KL20200922（对照品HNMR图如图1所示，对照品CNMR图如图2所示，对照品GC纯度图如图3所示）。

[0049] 工艺杂质S‑缩水甘油对照品：乐研提供，批号LC0925029。

[0050] (2) 主要仪器

[0051] 气相色谱仪：Agilent 8860；

[0052] 色谱柱：Agilent HP‑5，规格30m×0.32mm×0.5μm。

[0053] 实施例1、R‑丁酸缩水甘油酯工艺杂质S‑缩水甘油的测定

[0054] (1) 供试品溶液的制备：精密称取R‑丁酸缩水甘油酯样品（批号KL20210509）置于容量瓶中，加甲醇溶解，配制成50mg/ml的R‑丁酸缩水甘油酯供试品溶液。

[0055] (2) 系统适用性溶液的制备：精密称取工艺杂质S‑缩水甘油对照品，加甲醇溶解，配制成浓度为2.5mg/ml的溶液，作为工艺杂质S‑缩水甘油储备液。精密称取R‑丁酸缩水甘油酯对照品500mg于10ml容量瓶中，精密加入工艺杂质S‑缩水甘油储备液1.0ml，用甲醇定容，即得系统适用性溶液；

[0056] (3) 分别精密吸取供试品溶液和系统适用性溶液0.5μl注入色谱仪，记录色谱图，以加校正因子的面积归一化法按图10中公式计算供试品溶液中工艺杂质S‑缩水甘油含量；Aⅰ：供试品溶液中工艺杂质S‑缩水甘油峰面积值为7.738，A：供试品溶液中所有峰面积之和值为11494.01，F：工艺杂质S‑缩水甘油的校正因子为1.83。

[0057] xⅰ%=0.12%，即批号KL20210509的R‑丁酸缩水甘油酯样品中，工艺杂质S‑缩水甘油的含量为0.12%。该供试品溶液的GC图如图4所示。

[0058] (4) 色谱条件：

[0059] 色谱柱：Agilent HP‑5，规格 30m×0.32mm×0.5μm；

[0060] 载气：氮气；

[0061] 进样口温度：250℃，分流比：20:1；

[0062] 检测器温度：300℃，FID检测器；

[0063] 色谱柱流量：2ml/min，进样量0.5μl；

[0064] 梯度升温程序：

[0065] 名称 速率（℃/min） 温度（℃） 保持时间（min）起始温度 / 50 3
梯度1 10 250 5

[0066] 实施例2、R‑丁酸缩水甘油酯样品工艺杂质S‑缩水甘油的测定

[0067] (1) 供试品溶液的制备：精密称取R‑丁酸缩水甘油酯样品（批号KL20211222）置于容量瓶中，加甲醇溶解，配制成50mg/ml的R‑丁酸缩水甘油酯供试品溶液。

[0068] (2) 系统适用性溶液的制备：精密称取工艺杂质S‑缩水甘油对照品，加甲醇溶解，配制成浓度为2.5mg/ml的溶液，作为工艺杂质S‑缩水甘油储备液。精密称取R‑丁酸缩水甘油酯对照品500mg于10ml容量瓶中，精密加入工艺杂质S‑缩水甘油储备液1.0ml，用甲醇定容，即得系统适用性溶液。

[0069] (3) 分别精密吸取供试品溶液和系统适用性溶液0.5μl注入色谱仪，记录色谱图，以加校正因子的面积归一化法按图10中公式计算供试品溶液中工艺杂质S‑缩水甘油含量；

[0070] Aⅰ：供试品溶液中工艺杂质S‑缩水甘油峰面积值为5.823，A：供试品溶液中所有峰面积之和值为10790.34，F：工艺杂质S‑缩水甘油的校正因子为1.83。

[0071] xⅰ%=0.10%，即批号KL20211222的R‑丁酸缩水甘油酯样品中，工艺杂质S‑缩水甘油的含量为0.10%。该供试品溶液的GC图如图5所示。

[0072] (4) 色谱条件：

[0073] 色谱柱：Agilent HP‑5，规格 30m×0.32mm×0.5μm；

[0074] 载气：氮气；

[0075] 进样口温度：250℃，分流比：20:1；

[0076] 检测器温度：300℃，FID检测器；

[0077] 色谱柱流量：2ml/min，进样量0.5μl；

[0078] 梯度升温程序：

[0079]名称 速率（℃/min） 温度（℃） 保持时间（min）
起始温度 / 50 3
梯度1 10 250 5

[0080] 以下通过试验例的方式进一步说明本发明的有益效果：

[0081] 试验例1、系统适用性评价

[0082] 仪器及色谱条件：Agilent GC 8860；色谱柱：Agilent HP‑5，规格为30m×0.32mm×0.5μm；进样口温度：250℃，分流比：20:1；检测器温度：300℃，FID检测器；载气：氮气；色谱柱流量：2ml/min，进样量0.5μl；梯度升温程序：

[0083] 名称 速率（℃/min） 温度（℃） 保持时间（min）起始温度 / 50 3
梯度1 10 250 5

[0084] 溶液配制：

[0085] (1) 空白溶液为：甲醇；

[0086] (2) 工艺杂质S‑缩水甘油储备液：精密称取工艺杂质S‑缩水甘油对照品25mg于10ml容量瓶中，加甲醇溶解定容，得工艺杂质S‑缩水甘油储备液，其中工艺杂质S‑缩水甘油对照品的浓度为2.5mg/ml；

[0087] (3) 系统适用性溶液：精密称取R‑丁酸缩水甘油酯对照品500mg于10ml容量瓶中，精密加入工艺杂质S‑缩水甘油储备液1.0ml，再加甲醇稀释定容，得系统适用性溶液（系统适用性溶液中R‑丁酸缩水甘油酯对照品浓度为50mg/ml，工艺杂质S‑缩水甘油对照品浓度为250μg/ml）；

[0088] (4) 工艺杂质S‑缩水甘油定位溶液：精密移取杂质储备液1.0ml于10ml容量瓶，加甲醇溶解定容，即得工艺杂质S‑缩水甘油定位溶液，其中工艺杂质S‑缩水甘油对照品的浓度为250μg/ml；

[0089] (5) 供试品溶液：精密称取R‑丁酸缩水甘油酯样品（批号KL20210509）500mg于10ml容量瓶中，加甲醇定容，即得供试品溶液。

[0090] 检测：

[0091] 按上述色谱条件分别进样空白溶液、系统适用性溶液、工艺杂质S‑缩水甘油定位溶液、供试品溶液，记录色谱过程，色谱图分别为系统适用性溶液的GC图如图6所示，空白溶液的GC图如图7所示，工艺杂质S‑缩水甘油定位溶液的GC图如图8所示，供试品溶液的GC图如图9所示，分离度结果见图11。

[0092] 实验结果说明：空白无干扰，系统适用性溶液分离度为33.6，分离度远大于2.0，符合中国药典2020年版的要求。该方法能够很好的分离R‑丁酸缩水甘油酯和其工艺杂质S‑缩水甘油。

[0093] 试验例2、专属性实验

[0094] 仪器及色谱条件和溶液配制方法均同试验例1。

[0095] 检测：方法专属性考察峰鉴别和选择性，按上述色谱条件分别进样空白溶液，工艺杂质S‑缩水甘油定位溶液，记录色谱图，结果见图12。

[0096] 实验结果说明：该检测方法无其它杂质干扰，可用于本发明工艺杂质S‑缩水甘油峰鉴别。

[0097] 试验例3、检测限和定量限测试

[0098] 1、实验方法

[0099] 仪器及色谱条件和溶液配制方法均同试验例1。

[0100] 检测：检测限（LOD）和定量限（LOQ）根据信噪比来确定。把已知浓度的工艺杂质S‑缩水甘油储备液稀释到低浓度进样，检测信噪比S/N≥10确定为定量限，S/N=2～4确定为检测限。测试结果见图13。

[0101] 实验结果说明：工艺杂质S‑缩水甘油的定量限和检测限远小于0.15%，满足国际药典通用规定的要求，可用于R‑丁酸缩水甘油酯中对该杂质的定性和定量分析。

[0102] 试验例4、线性和范围测试

[0103] 仪器及色谱条件和溶液配制方法均同试验例1。

[0104] 检测：对于工艺杂质S‑缩水甘油，在LOQ浓度至不低于150%指标浓度范围内取6个点进行研究，线性关系以测得的响应信号(峰面积)对被分析物（即工艺杂质S‑缩水甘油对2
照品）浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归，至少报告相关系数R 来证实良好的线
2
性关系，要求该线性回归系数R 应不小于0.990。

[0105] 对于主成分R‑丁酸缩水甘油酯和工艺杂质S‑缩水甘油的线性和范围，结果见图1416。
~

[0106] 实验结果说明：工艺杂质S‑缩水甘油在6.2238μg/ml～148.700μg/ml范围内线性良好，测得工艺杂质S‑缩水甘油校正因子为1.83，在0.2 5.0的范围内（由于校正因子不在~0.9 1.1的范围内，需加校正因子进行校正），因此可用加校正因子的面积归一化法计算工~
艺杂质S‑缩水甘油的含量。

[0107] 试验例5、精密度测试

[0108] 1、实验方法

[0109] 仪器及条件和溶液配制方法均同试验例1。

[0110] 检测：取供试品溶液作为测试溶液，平行配制6份，按照上述条件依次进样，重复性结果见图17。

[0111] 中间精密度采用相同操作方法，由不同人员在不同仪器上进行，结果图18。

[0112] 实验结果说明：工艺杂质S‑缩水甘油重复性和中间精密度RSD值小于2.0%，符合国际药典及中国药典的检测要求。

[0113] 试验例6、准确度测试

[0114] 仪器及条件和溶液配制方法均同试验例1。

[0115] 检测：准确度是通过在R‑丁酸缩水甘油酯供试品中加入工艺杂质S‑缩水甘油限度0.15%的80％，100％，120％三个不同浓度工艺杂质S‑缩水甘油，测定工艺杂质S‑缩水甘油的回收率所得。已知工艺杂质S‑缩水甘油的准确度是加入已知量的工艺杂质S‑缩水甘油，再测定加样样品中已知工艺杂质S‑缩水甘油的含量和理论值之间的比值(回收率)，以百分率％表达。结果见图19。

[0116] 实验结果说明：工艺杂质S‑缩水甘油的回收率在99.26%～101.01%之间，平均回收率为：100.21%，准确度良好，符合国际药典和中国药典的要求。

[0117] 试验例1 6的研究结果表明，本发明一种测定R‑丁酸缩水甘油酯工艺杂质S‑缩水~甘油的方法具有很好的专属性，精密度良好，准确度高和灵敏度高，符合《中国药典》2020年版对分析方法学的要求，适用于R‑丁酸缩水甘油酯合成中对工艺杂质S‑缩水甘油的质量控制。

[0118] 使用本发明检测方法对R‑丁酸缩水甘油酯质量进行研究，数据汇总确定R‑丁酸缩水甘油酯中S‑缩水甘油的含量控制在0.15%以内，以该R‑丁酸缩水甘油酯为原料制备的磷酸特地唑胺API中S‑缩水甘油才能达到符合要求的限度。

[0119] 综上，本发明的检测方法不仅可以用于定性检测R‑丁酸缩水甘油酯中的工艺杂质S‑缩水甘油，还能够定量测定R‑丁酸缩水甘油酯中工艺杂质S‑缩水甘油的含量，用于R‑丁酸缩水甘油酯的质量监测。本发明的方法还可以将R‑丁酸缩水甘油酯与工艺杂质S‑缩水甘油有效分离，进一步提高R‑丁酸缩水甘油酯的纯度和质量。本发明的检测方法具有很好的专属性，该方法精密度良好，准确度和灵敏度高，测定结果稳定可靠，符合《中国药典》2020年版对分析方法学的要求。本发明检测方法可有效监控R‑丁酸缩水甘油酯的合成过程，用于R‑丁酸缩水甘油酯的质量检测，保证其质量，应用前景广阔。