1,2,4三唑并4,3-B哒嗪衍生物在制备抗衰老药物中的应用

摘要

本发明公开了1,2,4三唑并4,3‑B哒嗪衍生物在制备抗衰老药物中的应用。本发明提供了式（I）所示[1,2,4]三唑并[4,3‑B]哒嗪衍生物（C1632）、其药学上可接受的盐在制备抗衰老药物中的应用。本发明发现，C1632可以显著抑制细胞衰老、延长小鼠寿命以及抑制肺衰老，还可以解除衰老时的免疫抑制微环境、促进衰老细胞的免疫清除、治疗衰老所引起的相关疾病；而且C1632具有较好的药物安全性，可以作为抗衰老及衰老相关性疾病防治的候选药物。

权利要求

1.[1,2,4]三唑并[4,3‑B]哒嗪衍生物在制备抗衰老药物中的应用，所述[1,2,4]三唑并[4,3‑B]哒嗪衍生物为式（I）所示化合物或其药学上可接受的盐；

（I）。

2.[1,2,4]三唑并[4,3‑B]哒嗪衍生物在制备治疗肺衰老的药物中的应用，所述[1,2,

4]三唑并[4,3‑B]哒嗪衍生物为式（I）所示化合物或其药学上可接受的盐；

（I）。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述[1,2,4]三唑并[4,3‑B]哒嗪衍生物解除衰老细胞的免疫抑制微环境和/或促进衰老细胞免疫清除。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

5.根据权利要求1或2所述的应用，所述药物的剂型包括混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、乳剂、滴丸剂、注射剂、栓剂、灌肠剂、气雾剂、贴剂或滴剂中的至少一种。

说明书

1,2,4三唑并4,3‑B哒嗪衍生物在制备抗衰老药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及1,2,4三唑并4,3‑B哒嗪衍生物在制备抗衰老药物中的应用。

背景技术

[0002] 细胞衰老（cell aging）是一种与时序相关的细胞功能障碍。衰老细胞发生细胞结构的退行性改变，如：细胞变大，核膜凹陷或崩解，染色体数目异常，细胞膜脆性增加且选择性通透能力下降。功能上，衰老细胞表现为功能衰退与代谢低下，如：细胞周期不可逆的停滞，具有很强的抗凋亡能力往往在低表达凋亡因子的同时还高表达凋亡抑制因子Bcl‑2等；细胞内酶活性降低，蛋白质合成下降；细胞内脂褐素堆积，DNA损伤及损伤信号增强以及伴有衰老相关的分泌特性等。虽然生理性衰老是一个缓慢过程，然而病毒感染、辐射、各种疾病等因素可以导致病理性衰老促使机体加速老化。

[0003] 生理学上，衰老是一种肿瘤抑制机制，可避免细胞癌变，并在伤口愈合反应中发挥有益作用。病理学上，衰老细胞的异常聚集导致机体在应激和损伤状态下，保持和恢复体内稳态的能力下降，此外衰老产生的炎症微环境，导致慢性组织损伤，并加速诸如动脉粥样硬化、血管钙化、糖尿病、恶性肿瘤、自身免疫疾病、骨关节炎和老年性痴呆等衰老相关性疾病。因此，消除小鼠受损组织中的衰老细胞可以改善这些疾病的症状，甚至可以延长寿命。

[0004] 由于衰老细胞自身具有很强的抗凋亡特性，无法通过凋亡途径清除。生理条件下衰老的细胞主要被机体的免疫系统清除，例如T细胞和NK细胞都能识别并且杀伤衰老细胞。同时新生的细胞也不断从相应的组织器官生成，以弥补衰老死亡的细胞。虽然免疫系统有识别并且清除衰老细胞的能力，然而随着衰老的进展，免疫系统对衰老细胞的清除逐渐减弱，同时衰老细胞产生了免疫抑制的微环境极大地阻碍了免疫细胞对衰老细胞的识别和杀伤功能。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供了小分子化合物C1632在制备延缓衰老及防治衰老相关性疾病的药物中的应用。

[0006] 本发明所采取的技术方案是：

[0007] 本发明的第一方面，提供[1,2,4]三唑并[4,3‑B]哒嗪衍生物在制备抗衰老药物中的应用，所述[1,2,4]三唑并[4,3‑B]哒嗪衍生物包括式（I）所示化合物或其药学上可接受的盐；

[0008]

[0009] （I）。

[0010] 本发明的第二方面，提供[1,2,4]三唑并[4,3‑B]哒嗪衍生物在制备抑制细胞衰老的药物中的应用，所述[1,2,4]三唑并[4,3‑B]哒嗪衍生物包括式（I）所示化合物或其药学上可接受的盐；

[0011]

[0012] （I）。

[0013] 本发明的第三方面，提供[1,2,4]三唑并[4,3‑B]哒嗪衍生物在制备延长寿命的药物中的应用，所述[1,2,4]三唑并[4,3‑B]哒嗪衍生物包括式（I）所示化合物或其药学上可接受的盐；

[0014]

[0015] （I）。

[0016] 本发明的第四方面，提供[1,2,4]三唑并[4,3‑B]哒嗪衍生物在制备预防和/或治疗肺衰老的药物中的应用，所述[1,2,4]三唑并[4,3‑B]哒嗪衍生物包括式（I）所示化合物或其药学上可接受的盐；

[0017]

[0018] （I）。

[0019] 本发明的第五方面，提供[1,2,4]三唑并[4,3‑B]哒嗪衍生物在制备解除衰老细胞的免疫抑制微环境的药物中的应用，所述[1,2,4]三唑并[4,3‑B]哒嗪衍生物包括式（I）所示化合物或其药学上可接受的盐；

[0020]

[0021] （I）。

[0022] 本发明的第六方面，提供[1,2,4]三唑并[4,3‑B]哒嗪衍生物在制备促进衰老细胞免疫清除的药物中的应用，所述[1,2,4]三唑并[4,3‑B]哒嗪衍生物包括式（I）所示化合物或其药学上可接受的盐；

[0023]

[0024] （I）。

[0025] 本发明的第七方面，提供[1,2,4]三唑并[4,3‑B]哒嗪衍生物在制备预防和/或治疗衰老相关疾病的药物中的应用，所述[1,2,4]三唑并[4,3‑B]哒嗪衍生物包括式（I）所示化合物或其药学上可接受的盐；

[0026]

[0027] （I）。

[0028] 在本发明的一些实施方式中，所述衰老相关疾病包括但不限于：动脉粥样硬化、血管钙化、糖尿病、自身免疫疾病、骨关节炎和老年性痴呆。

[0029] 在本发明的一些实施方式中，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

[0030] 在本发明的一些实施方式中，所述药学上可接受的辅料包括：稀释剂、黏合剂、润湿剂、润滑剂、崩解剂、溶剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、防腐剂、pH调节剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的至少一种。

[0031] 在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型包括混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、乳剂、溶液剂、滴丸剂、注射剂、口服剂、栓剂、灌肠剂、气雾剂、贴剂或滴剂中的至少一种。

[0032] 在本发明的一些实施方式中，所述药物的给药途径包括静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服给药、舌下给药、鼻腔给药、雾化给药或经皮给药中的至少一种。C1632为已知的小分子药物，能溶于水、乙醇或者DMSO，热稳定性良好，细胞毒性低，药物安全性好，具有良好的药代动力学特性，可以通过多种方式灵活给药。

[0033] 本发明的有益效果是：

[0034] 本发明提供了式（I）所示[1,2,4]三唑并[4,3‑B]哒嗪衍生物（C1632）、其药学上可接受的盐在制备抗衰老药物中的应用。本发明发现，C1632可以显著抑制细胞衰老、延长小鼠寿命以及抑制肺衰老，还可以解除衰老时的免疫抑制微环境、促进衰老细胞的免疫清除、治疗衰老所引起的相关疾病；而且C1632具有较好的药物安全性，可以作为抗衰老及衰老相关性疾病防治的候选药物。

附图说明

[0035] 图1为C1632显著抑制细胞衰老。图1的A为β‑gal染色证明C1632处理能抑制VP16诱导BJ细胞和MRC5细胞衰老。图1的B‑图1的C为统计不同处理组BJ细胞(B)和MRC5细胞(C)的β‑gal阳性细胞率。**表示p<0.01。

[0036] 图2为C1632显著延长小鼠寿命及衰老小鼠的肺衰老。图2的A为生存曲线分析表明‑/‑ ‑/‑C1632显著延长早衰小鼠TERC G4的寿命。图2的B为免疫组化检测C1632显著抑制TERC G4小鼠肺衰老标志物P16和P21的表达。

[0037] 图3为免疫组化检测免疫抑制T细胞标志物FOXP3的表达变化。

[0038] 图4为C1632能促进T细胞杀伤衰老细胞。图4的A为SA‑β‑gal检测博来霉素诱导TC‑1细胞衰老；图4的B为LDH活性释放分析检测正常小鼠、生理盐水和C1632处理的IPF小鼠中+ +
PBMC、CD3T细胞和CD8T细胞对衰老TC‑1的杀伤效应。

具体实施方式

[0039] 以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

[0040] 材料和方法

[0041] 1、C57BL/6小鼠购自集广东药康生物科技有限公司。TERC‑/‑鼠由暨南大学鞠振宇教授实验室提供。人原代细胞MRC5和BJ以及小鼠TC1细胞均购自ATCC。

[0042] 2、IHC检测：石蜡切片65℃融蜡1h；二甲苯10min‑二甲苯10min‑无水乙醇3min‑95%乙醇3min‑85%乙醇3min‑70%乙醇3min入水，使用PBS清洗两遍，每遍5min；3%过氧化氢(甲醇配置)封闭10min，PBS清洗两遍，每遍5min；pH 6.0 抗原修复液微波加热10min进行抗原修复，室温缓慢降温1h，PBS清洗两遍，每遍5min；10%山羊血清封闭1h；一抗4℃避光孵育过夜，PBS清洗两遍，每遍5min；室温避光孵育二抗30min，PBS清洗两遍，每遍5min；DAB显色，苏木精染色，并于自来水中冲洗8min返蓝。梯度酒精脱水，烘干，并用中性树胶封片。

[0043] 3、C1632的化学合成：[1,2,4]三唑并[4,3‑B]哒嗪衍生物C1632由本实验室合成，其结构式如式（I）所示：

[0044]

[0045] （I）。

[0046] 合成路径如下所示：

[0047]

[0048] C1632为已知的小分子药物，能溶于水或者DMSO，热稳定性良好，细胞毒性低，药物安全性好，具有良好的药代动力学特性，通过口服、肌肉注射和静脉注射等多种方式灵活给药。

[0049] 实施例1

[0050] MRC5、BJ细胞用含10%FBS的DMEM低糖培养基培养。细胞按1:3比例传代或铺板，0.55
×10细胞铺于12孔板后次日使用40μM终浓度的VP16处理4‑7天诱导细胞衰老，构建细胞衰老模型。诱导细胞衰老的同时加入终浓度120μM的C1632进行处理，通过SA‑β‑gal染色检测C1632对BJ和MRC5细胞衰老的影响，研究C1632对细胞衰老的影响。

[0051] 结果见图1，其中图1的A为β‑gal染色证明C1632处理能抑制VP16诱导BJ细胞和MRC5细胞衰老。图1的B‑图1的C为统计不同处理组BJ细胞(B)和MRC5细胞(C)的β‑gal阳性细胞率。**表示p<0.01。结果表明C1632可以有效延缓VP16诱导的细胞衰老。

[0052] 实施例2

[0053] 1、TERC‑/‑G4衰老小鼠模型：小鼠端粒长度很长，端粒酶敲除后需要繁殖3‑6代才会+/‑ +/‑ ‑/‑出现早衰表型。TERC 小鼠配种筛选子代中的TERC 作为保种用，第一代TERC 小鼠即为G1小鼠，G1小鼠彼此交配产下G2小鼠，一直繁衍到G4，此时小鼠端粒很短，可以在3‑4月龄出现衰老表型。

[0054] 2、TERC敲除鼠基因型鉴定：待鉴定小鼠剪取少量尾巴，将鼠尾在含0.4mg/ml蛋白酶K的10mM Tris‑HCl 0.5% SDS 1mMEDTA pH8.0的缓冲液中置于65℃消化2h，接着取0.5μl作为模板进行PCR扩增。PCR产物大小250bp表示野生型，产物大小180 bp表示TERC敲除。

[0055] 3、将1月龄的G4小鼠给予每周1次68mg/kg剂量的C1632，每组各10只，对照组小鼠‑/‑在实验后3个半月全部死亡，而给药组小鼠仍然有80%存活，这表明C1632极大延长了TERCG4小鼠的寿命，降低了全因死亡风险（图2的A）。进一步对小鼠的肺部进行免疫组化检测衰老标志物p16和p21的表达，表明C1632显著抑制了肺组织衰老（图2的B）。

[0056] 4、由于衰老细胞在体内主要是被免疫细胞所清除，因此除了抑制衰老细胞产生外，申请人还检测了C1632对衰老肺组织免疫微环境的影响。通过免疫组化分析衰老小鼠肺组织，结果表明C1632处理能降低衰老组织中免疫抑制T细胞标志物FOXP3（图3）；说明C1632能解除衰老所处的免疫抑制微环境。

[0057] 实施例3

[0058] 1、申请人用博来霉素诱导TC‑1细胞衰老，并且用SA‑β‑Gal染色检（图4的A）来反映TC‑1细胞的衰老情况。

[0059] 2、T细胞杀伤实验：博来霉素诱导衰老的TC1细胞按1万/孔铺于96孔板中，次日弃去细胞培养上清，接着按1:50比例加入从正常小鼠、生理盐水处理的特发性肺纤维化(Idiopathic PulmonaryFibrosis, IPF)小鼠和C1632处理的IPF小鼠中分离的PBMC、CD3+ T细胞和CD8+ T细胞。37℃孵育4h后，离心取上清，杀伤的衰老细胞会释放LDH酶，用LDH试剂盒检测免疫细胞对衰老细胞的杀伤效应。其中2mg/kg剂量的博来霉素喷入小鼠肺部构建IPF小鼠模型；上述实验每组小鼠至少6只。

[0060] 其中CD8+T细胞分离培养：无菌条件下取小鼠脾脏研磨后过200目筛子，将滤过的细胞用CD8+ T细胞分离试剂盒（biolegend）进行分选，分选后的T细胞用含10%FBS、抗小鼠5μg/ml CD28抗体（biolegend）和10 ng/ml IL‑2的PRMI1640培养基在用5μg/ml CD3抗体（biolegend）包被过夜的培养皿中进行培养至使用。

[0061] 结果表明相比于生理盐水处理的IPF小鼠，C1632处理的IPF小鼠PBMC和CD3+ T细胞对衰老TC‑1细胞的杀伤显著增强，尤其是CD8+T细胞对衰老细胞的杀伤能力显著高于正常小鼠和生理盐水处理的IPF小鼠（图4的B），这表明C1632可以显著改善免疫系统对衰老细胞的靶向杀伤能力，促进衰老细胞的免疫清除。

[0062] 上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。