一种利用栀子茎尖嫁接的组织培养育苗的方法

摘要

本发明涉及组织培养技术领域，尤其涉及一种利用栀子茎尖嫁接的组织培养育苗的方法。具体包括如下步骤：(1)取栀子茎尖；(2)消毒处理得到栀子嫩芽无菌系；(3)将栀子茎尖与砧木接合；(4)对无菌植物进行培养；(5)炼苗；(6)移栽温室大棚。本发明利用栀子微芽扦插的方式对其进行组织培养培养育苗，既增加了繁殖系数，又保留了扦插繁殖生长势和抗逆性较强的优点，对提高栀子的繁殖速度和苗木质量具有十分重要的意义。

权利要求

1.一种利用栀子茎尖嫁接的组织培养育苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将栀子嫩芽清洗消毒；

(2)取步骤(1)得到的嫩芽的茎尖，将其嫁接在砧木上，得到嫁接苗；

(3)将步骤(2)得到的嫁接苗置于固体培养基中培养、炼苗；

(4)将步骤(3)得到的炼苗后的嫁接苗移植到基质中，施用营养液；

步骤(2)所述嫁接的方法为：切去栀子砧木顶端和部分根端，然后用刀片在离砧上切口

0.2～0.8cm处切出三角形创口，用嫁接刀尖剥取保留生长锥及2～6个叶原基的茎尖将其放到砧木的三角形切口中，用刀背按压使茎尖与砧木的横切口完全接合；

步骤(3)所述固体培养基的组成为：1/2MS+NAA0.2～0.8mg/L+活性炭1.0～2.0g/L+琼脂7.0～7.5g/L+蔗糖25～30g/L，pH5.6～6.2。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述清洗消毒的方法为依次用洗衣粉和蒸馏水清洗1～7次，然后用流水冲洗后吸干嫩芽表面的水，将嫩芽浸入抑菌剂中浸泡2～5h，然后取出用无菌水冲洗干净，先用65～80％酒精消毒25～35s，再用0.05～0.15％升汞消毒5～11min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述培养温度为21～27℃；所述培养的时间为1～5周；所述培养湿度为75～85％。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述培养的光照为12～18h/d，所述培养的光照强度为2000～2500Lx。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述炼苗时间为8～12d；所述炼苗的温度为22～28℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述基质为：营养土、蛭石和珍珠岩；所述营养土、蛭石和珍珠岩的质量比为1～3：0.5～1.5：0.5～1.5。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述营养液包括：钾盐、氯化钙、硫酸镁、磷酸盐。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述营养液中钾盐浓度为1600～

1700mg/L、硫酸镁浓度为350～390mg/L、肌醇浓度为50～150mg/L。

说明书

一种利用栀子茎尖嫁接的组织培养育苗的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物嫁接技术领域，尤其涉及一种利用栀子茎尖嫁接的组织培养育苗的方法。

背景技术

[0002] 栀子是茜草科栀子属的一种常绿的矮化灌木，也是优质的盆栽观赏花卉。栀子的果实是传统中药，属卫生部颁布的第1批药食两用资源，具有护肝、利胆、降压、镇静、止血、消肿等作用，在中医临床常用于治疗黄疸型肝炎、扭挫伤、高血压、糖尿病等症。栀子喜温暖湿润气候，生于海拔10～1500米处的旷野、丘陵、山谷、山坡、溪边的灌丛或林中，适宜生长在疏松、肥沃、排水良好、轻粘性酸性土壤中，抗有害气体能力强，萌芽力强，耐修剪。

[0003] 栀子主要采用种子、扦插和组织培养的方式进行繁殖，但种子实生苗繁殖速度慢，需要大量人力、物力，扦插繁殖又有扦插周期长、生根速度慢，且容易发生“缺绿病”，因此现在一般多采用组织培养的繁殖。通过组织培养技术进行栀子繁殖，能够在短期内取得良好的经济效益，具有很高的实用价值，前人关于栀子组织培养育苗的研究较多。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种利用栀子茎尖嫁接的组织培养育苗的方法，既增加了繁殖系数，又保留了扦插繁殖生长势和抗逆性较强的优点。

[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0006] 本发明提供了一种利用栀子茎尖嫁接的组织培养育苗的方法，包括如下步骤：

[0007] (1)将栀子嫩芽清洗消毒；

[0008] (2)取步骤(1)得到的嫩芽的茎尖，将其嫁接在砧木上，得到嫁接苗；

[0009] (3)将步骤(2)得到的嫁接苗置于固体培养基中培养、炼苗；

[0010] (4)将步骤(3)得到的炼苗后的嫁接苗移植到基质中，施用营养液。

[0011] 优选地，步骤(1)所述清洗消毒的方法为依次用洗衣粉和蒸馏水清洗1～7次，然后用流水冲洗后吸干嫩芽表面的水，将嫩芽浸入抑菌剂中浸泡2～5h，然后取出用无菌水冲洗干净，先用65～80％酒精消毒25～35s，再用0.05～0.15％升汞消毒5～11min。

[0012] 优选地，步骤(2)所述嫁接的方法为：切去栀子砧木顶端和部分根端，然后用刀片在离砧上切口0.2～0.8cm处切出三角形创口，用嫁接刀尖剥取保留生长锥及2～6个叶原基的茎尖将其放到砧木的三角形切口中，用刀背按压使茎尖与砧木的横切口完全接合。

[0013] 优选地，步骤(3)所述固体培养基的组成为：1/2MS+NAA0.2～0.8mg/L+活性炭1.0～2.0g/L+琼脂7.0～7.5g/L+蔗糖25～30g/L，pH5.6～6.2。

[0014] 优选地，步骤(3)所述培养温度为21～27℃；所述培养的时间为1～5周；所述培养湿度为75～85％。

[0015] 优选地，步骤(3)所述培养的光照为12～18h/d，所述培养的光照强度为2000～2500Lx。

[0016] 优选地，步骤(3)所述炼苗时间为8～12d；所述炼苗的温度为22～28℃。

[0017] 优选地，步骤(4)所述基质为：营养土、蛭石和珍珠岩；所述营养土、蛭石和珍珠岩的质量比为1～3：0.5～1.5：0.5～1.5。

[0018] 优选地，步骤(4)所述营养液包括：钾盐、氯化钙、硫酸镁、磷酸盐。

[0019] 优选地，步骤(4)所述营养液中钾盐浓度为1600～1700mg/L、硫酸镁浓度为350～390mg/L、肌醇浓度为50～150mg/L。

[0020] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0021] 本发明利用栀子微芽扦插的方式对其进行组织培养培养育苗，既增加了繁殖系数，又保留了扦插繁殖生长势和抗逆性较强的优点，对提高栀子的繁殖速度和苗木质量具有十分重要的意义。

具体实施方式

[0022] 本发明提供了一种利用栀子茎尖嫁接的组织培养育苗的方法，包括如下步骤：

[0023] (1)于晴朗的上午10点，在健壮无病的栀子植株上，剪取3～5cm的春梢，置于有清水的三角瓶中封口保湿；

[0024] (2)将栀子嫩芽清洗消毒；

[0025] (3)取步骤(2)得到的嫩芽的茎尖，将其嫁接在砧木上，得到嫁接苗；

[0026] (4)将步骤(3)得到的嫁接苗置于固体培养基中培养、炼苗；

[0027] (5)将步骤(4)得到的炼苗后的嫁接苗移植到基质中，施用营养液。

[0028] 在本发明中，步骤(2)所述清洗消毒的方法为依次用洗衣粉和蒸馏水清洗1～7次，然后用流水冲洗后吸干嫩芽表面的水，将嫩芽浸入抑菌剂中浸泡2～5h，然后取出用无菌水冲洗干净，先用65～80％酒精消毒25～35s，再用0.05～0.15％升汞消毒5～11min；优选为用洗衣粉和蒸馏水清洗2～6次，然后用流水冲洗后吸干嫩芽表面的水，将嫩芽浸入抑菌剂中浸泡2.5～4.5h，然后取出用无菌水冲洗干净，先用67～77％酒精消毒27～33s，再用0.07～0.13％升汞消毒6～10min；进一步优选为用洗衣粉和蒸馏水清洗3～5次，然后用流水冲洗后吸干嫩芽表面的水，将嫩芽浸入抑菌剂中浸泡3～4h，然后取出用无菌水冲洗干净，先用70～76％酒精消毒29～31s，再用0.09～0.11％升汞消毒7～9min；更优选为用洗衣粉和蒸馏水清洗4次，然后用流水冲洗后吸干嫩芽表面的水，将嫩芽浸入抑菌剂中浸泡3.5h，然后取出用无菌水冲洗干净，先用75％酒精消毒30s，再用0.1％升汞消毒8min。

[0029] 在本发明中，步骤(3)所述嫁接的方法为：切去栀子砧木顶端和部分根端，然后用刀片在离砧上切口0.2～0.8cm处切出三角形创口，用嫁接刀尖剥取保留生长锥及2～6个叶原基的茎尖将其放到砧木的三角形切口中，用刀背按压使茎尖与砧木的横切口完全接合；优选为切去栀子砧木顶端和部分根端，然后用刀片在离砧上切口0.3～0.7cm处切出三角形创口，用嫁接刀尖剥取保留生长锥及2～5个叶原基的茎尖将其放到砧木的三角形切口中，用刀背按压使茎尖与砧木的横切口完全接合；进一步优选为切去栀子砧木顶端和部分根端，然后用刀片在离砧上切口0.4～0.6cm处切出三角形创口，用嫁接刀尖剥取保留生长锥及3～5个叶原基的茎尖将其放到砧木的三角形切口中，用刀背按压使茎尖与砧木的横切口完全接合；更优选为切去栀子砧木顶端和部分根端，然后用刀片在离砧上切口0.5cm处切出三角形创口，用嫁接刀尖剥取保留生长锥及4个叶原基的茎尖将其放到砧木的三角形切口中，用刀背按压使茎尖与砧木的横切口完全接合。

[0030] 在本发明中，步骤(4)所述固体培养基的组成为：1/2MS+NAA0.2～0.8mg/L+活性炭1.0～2.0g/L+琼脂7.0～7.5g/L+蔗糖25～30g/L，pH5.6～6.2；优选为1/2MS+NAA0.3～
0.7mg/L+活性炭1.2～1.8g/L+琼脂7.1～7.4g/L+蔗糖26～29g/L，pH5.7～6.1；进一步优选为1/2MS+NAA0.4～0.6mg/L+活性炭1.4～1.6g/L+琼脂7.2～7.4g/L+蔗糖27～29g/L，pH5.8～6.0；更优选为1/2MS+NAA0.5mg/L+活性炭1.5g/L+琼脂7.3g/L+蔗糖28g/L，pH5.9。

[0031] 在本发明中，步骤(4)所述培养温度为21～27℃；优选为22～26℃；进一步优选为23～25℃；更优选为24℃。

[0032] 在本发明中，步骤(4)所述培养的时间为1～5周；优选为1～4周；进一步优选为2～4周；更优选为3周。

[0033] 在本发明中，步骤(4)所述培养湿度为75～85％；优选为77～83％；进一步优选为79～81％；更优选为80％。

[0034] 在本发明中，步骤(4)所述培养的光照为12～18h/d，优选为13～17h/d；进一步优选为14～16h/d；更优选为15h/d。

[0035] 在本发明中，步骤(4)所述培养的光照强度为2000～2500Lx；优选为2150～2350Lx；进一步优选为2200～2300Lx；更优选为2500Lx。

[0036] 在本发明中，步骤(4)所述炼苗时间为8～12d；具体为两个阶段，第一阶段为将嫁接苗放置在正常自然光下炼苗6～11d，第二阶段去除封口再炼苗1～4d；优选为第一阶段为将嫁接苗放置在正常自然光下炼苗7～10d，第二阶段去除封口再炼苗1～3d；进一步优选为第一阶段为将嫁接苗放置在正常自然光下炼苗7～9d，第二阶段去除封口再炼苗2～3d；更优选为第一阶段为将嫁接苗放置在正常自然光下炼苗8d，第二阶段去除封口再炼苗2d。

[0037] 在本发明中，步骤(4)所述炼苗的温度为22～28℃；优选为23～27℃；进一步优选为24～26℃；更优选为25℃。

[0038] 在本发明中，步骤(5)所述基质为：营养土、蛭石和珍珠岩；

[0039] 在本发明中，步骤(5)所述营养土、蛭石和珍珠岩的质量比为1～3：0.5～1.5：0.5～1.5；优选为1.5～3：0.7～1.3：0.7～1.3；进一步优选为1.5～2.5：0.9～1.1：0.9～1.1；更优选为2：1：1。

[0040] 在本发明中，步骤(5)所述营养液包括：钾盐、氯化钙、硫酸镁、磷酸盐。

[0041] 在本发明中，步骤(5)所述营养液中钾盐浓度为1600～1700mg/L、硫酸镁浓度为350～390mg/L、肌醇浓度为50～150mg/L；优选为钾盐浓度为1620～1690mg/L、硫酸镁浓度为360～380mg/L、肌醇浓度为60～140mg/L；进一步优选为钾盐浓度为1640～1670mg/L、硫酸镁浓度为365～375mg/L、肌醇浓度为80～120mg/L；更优选为钾盐浓度为1650mg/L、硫酸镁浓度为370mg/L、肌醇浓度为100mg/L。

[0042] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0043] 实施例1

[0044] 一种利用栀子茎尖嫁接的组织培养育苗的方法，步骤如下：

[0045] (1)于晴朗的上午10点，在健壮无病的栀子植株上，剪取3cm的春梢，置于有清水的三角瓶中封口保湿；

[0046] (2)取生长健壮的干净栀子嫩芽，依次用洗衣粉和蒸馏水清洗2次后，进行初步消毒，然后用流水冲洗后吸干嫩芽表面的水，将嫩芽浸入0.3ml/LS206抑菌剂(购自江西万年生物技术有限公司)中浸泡2h，然后取出用无菌水冲洗干净，先用65％酒精消毒25s，再用0.05％升汞消毒5min，得到栀子嫩芽无菌系；

[0047] (3)切去栀子砧木顶端和部分根端，然后用刀片在离砧上切口0.2cm处切出三角形创口，在体视显微镜下用嫁接刀尖剥取保留生长锥及2个叶原基的茎尖，快速将其放到砧木的三角形切口中，用刀背按压使茎尖与砧木的横切口完全接合；

[0048] (4)将栀子茎尖嫁接在其扦插砧木的无菌植株置于固体培养基中培养；所述固体培养基为：1/2MS+NAA0.2 mg/L+活性炭1.0g/L+琼脂7.0g/L+蔗糖25g/L，pH5.6，所述培养条件：温度21℃，湿度75％，光照12h/d，光照强度2000Lx。

[0049] (5)待茎尖嫁接萌动开始后月1周，待接穗长出3片叶子，且扦插苗生根达3cm左右，便可以将嫁接苗放置在正常自然光下炼苗6d，随后去除封口再炼苗1d；

[0050] (6)随后将嫁接苗移植到经过高压灭菌锅灭菌消毒的基质中，所述基质为：营养土：蛭石：珍珠岩＝1：0.5：0.5，然后浇足营养液，移栽至温室大棚，统计栀子微芽嫁接苗的移栽成活率，注意避免阳光暴晒和保湿；

[0051] 所述营养液主要由钾盐、氯化钙、硫酸镁、磷酸盐组成，钾盐浓度为1600mg/L、硫酸镁浓度为350mg/L、肌醇浓度为50～150mg/L。该试剂特点是维生素含量较高，硝酸盐和硫胺素含量较高，经高压灭菌，为无菌溶液。

[0052] 实施例2

[0053] (1)于晴朗的上午10点，在健壮无病的栀子植株上，剪取5cm的春梢，置于有清水的三角瓶中封口保湿；

[0054] (2)取生长健壮的干净栀子嫩芽，依次用洗衣粉和蒸馏水清洗6次后，进行初步消毒，然后用流水冲洗后吸干嫩芽表面的水，将嫩芽浸入0.3ml/LS206抑菌剂中浸泡5h，然后取出用无菌水冲洗干净，先用80％酒精消毒35s，再用0.15％升汞消毒11min，得到栀子嫩芽无菌系；

[0055] (3)切去栀子砧木顶端和部分根端，然后用刀片在离砧上切口0.8cm处切出三角形创口，在体视显微镜下用嫁接刀尖剥取保留生长锥及6个叶原基的茎尖，快速将其放到砧木的三角形切口中，用刀背按压使茎尖与砧木的横切口完全接合；

[0056] (4)将栀子茎尖嫁接在其扦插砧木的无菌植株置于固体培养基中培养；所述固体培养基为：1/2MS+NAA0.8 mg/L+活性炭2.0g/L+琼脂7.5g/L+蔗糖30g/L，pH6.2，所述培养条件：温度27℃，湿度85％，光照18h/d，光照强度2500Lx。

[0057] (5)待茎尖嫁接萌动开始后月5周，待接穗长出7片叶子，且扦插苗生根达7cm左右，便可以将嫁接苗放置在正常自然光下炼苗11d，随后去除封口再炼苗4d；

[0058] (6)随后将嫁接苗移植到经过高压灭菌锅灭菌消毒的基质中，所述基质为：营养土：蛭石：珍珠岩＝3：1.5：1.5，然后浇足营养液，移栽至温室大棚，统计栀子微芽嫁接苗的移栽成活率，注意避免阳光暴晒和保湿；

[0059] 所述营养液主要由钾盐、氯化钙、硫酸镁、磷酸盐组成，钾盐浓度为1700mg/L、硫酸镁浓度为390mg/L、肌醇浓度为50～150mg/L。该试剂特点是维生素含量较高，硝酸盐和硫胺素含量较高，经高压灭菌，为无菌溶液。

[0060] 实施例3

[0061] (1)于晴朗的上午10点，在健壮无病的栀子植株上，剪取4cm的春梢，置于有清水的三角瓶中封口保湿；

[0062] (2)取生长健壮的干净栀子嫩芽，依次用洗衣粉和蒸馏水清洗3次后，进行初步消毒，然后用流水冲洗后吸干嫩芽表面的水，将嫩芽浸入0.3ml/LS206抑菌剂中浸泡3h，然后取出用无菌水冲洗干净，先用75％酒精消毒30s，再用0.1％升汞消毒8min，得到栀子嫩芽无菌系；

[0063] (3)切去栀子砧木顶端和部分根端，然后用刀片在离砧上切口0.5cm处切出三角形创口，在体视显微镜下用嫁接刀尖剥取保留生长锥及4个叶原基的茎尖，快速将其放到砧木的三角形切口中，用刀背按压使茎尖与砧木的横切口完全接合；

[0064] (4)将栀子茎尖嫁接在其扦插砧木的无菌植株置于固体培养基中培养；所述固体培养基为：1/2MS+NAA0.5 mg/L+活性炭1.5g/L+琼脂7.3g/L+蔗糖28g/L，pH5.9，所述培养条件：温度25℃，湿度80％，光照15h/d，光照强度2250Lx。

[0065] (5)待茎尖嫁接萌动开始后月3周，待接穗长出4片叶子，且扦插苗生根达4cm左右，便可以将嫁接苗放置在正常自然光下炼苗8d，随后去除封口再炼苗2d；

[0066] (6)随后将嫁接苗移植到经过高压灭菌锅灭菌消毒的基质中，所述基质为：营养土：蛭石：珍珠岩＝2：1：1，然后浇足营养液，移栽至温室大棚，统计栀子微芽嫁接苗的移栽成活率，注意避免阳光暴晒和保湿；

[0067] 所述营养液主要由钾盐、氯化钙、硫酸镁、磷酸盐组成，钾盐浓度为1650mg/L、硫酸镁浓度为370mg/L、肌醇浓度为50～150mg/L。该试剂特点是维生素含量较高，硝酸盐和硫胺素含量较高，经高压灭菌，为无菌溶液。

[0068] 实施例4

[0069] 其他方法与实施例3相同，区别仅在于，在体视显微镜下用嫁接刀尖剥取保留生长锥及3个叶原基的茎尖。

[0070] 实施例5

[0071] 其他方法与实施例3相同，区别仅在于，在体视显微镜下用嫁接刀尖剥取保留生长锥及5个叶原基的茎尖。

[0072] 实施例6

[0073] 其他方法与实施例3相同，区别仅在于，在体视显微镜下用嫁接刀尖剥取保留生长锥及2个叶原基的茎尖。

[0074] 实施例7

[0075] 其他方法与实施例3相同，区别仅在于，在体视显微镜下用嫁接刀尖剥取保留生长锥及6个叶原基的茎尖。

[0076] 实施例8

[0077] 其他方法与实施例3相同，区别仅在于，在体视显微镜下用嫁接刀尖剥取保留生长锥及1个叶原基的茎尖。

[0078] 实施例9

[0079] 其他方法与实施例3相同，区别仅在于，茎尖来源为田间夏秋梢。

[0080] 实验例1

[0081] 对比试验，测定实施例3～实施例8的成活率及萌发率，不同叶原基个数微芽接成活率及萌发率如下表1所示：

[0082] 表1不同叶原基个数微芽接成活率及萌发率

[0083]原叶基数量/个 成活率/％ 萌发率/％
1 11.3 0
2 16.8 10.8
3 78.5 30.8
4 60.2 58.9
5 40.1 22.6
6 27.8 11.8

[0084] 由表1记载的内容可知，以实施例4的成活率最高，达到了78.5％，显著高于其他实施例，而以实施例3的萌发率最高，达到了58.9％，且经对比可得，本发明实施例3的综合成活率及发芽率显著高于其他实施例。

[0085] 实验例2

[0086] 将实施例3和实施例9制备得到的嫁接苗移栽至温室大棚，统计栀子微芽嫁接苗的移栽成活率，注意避免阳光暴晒和保湿；

[0087] 经本发明实施例3与实施例9的不同来源茎尖成活率相比，如下表2可得：

[0088] 表2不同来源茎尖对嫁接成活率的影响

[0089]

[0090] 由表2记载的内容可知，本发明实验组的茎尖来源与对照组的茎尖来源不同，且本发明利用茎段不定芽达到的嫁接成活率为80.3％，显著高于对照组，说明，本发明利用茎段不定芽可显著提高栀子嫁接的成活率。

[0091] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。