苦参子提取物及有效部位的制备方法及其防治抑郁症的用途

摘要

本发明公开了一种苦参子提取物的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)称取适量的苦参子粉末，加入一定量的溶剂，提取，离心，得第一上清液；(2)滤渣加入一定量的溶剂，重复上述操作，得到第二上清液；(3)合并该第一上清液和该第二上清液，得到苦参子提取液；以及(4)将该苦参子提取液浓缩并干燥，得到苦参子提取物。该制备方法工艺简单、节能环保、重现性好、所获得的苦参子提取物五种单体成分含量高，具有工业大生产的可行性，并且通过脂多糖注射建立小鼠抑郁样动物模型，表明该苦参子提取物对小鼠抑郁样行为具有改善作用。

权利要求

1.一种苦参子提取物的非生物碱部位或者包含所述苦参子提取物的非生物碱部位的药物组合物或制剂在制备用于防治抑郁症或抑郁样行为的药品中的用途，其特征在于，所述苦参子提取物的非生物碱部位通过包括以下步骤的方法进行制备：(1)称取适量的苦参子粉末，加入1～20倍量(L/kg)的水，在150W～400W的功率下以

20KHz～60KHz的频率超声提取30min～60min，在2000rpm～6000rpm转速下离心5～60分钟，得到第一上清液；

(2)滤渣加入1～20倍量(L/kg)的水，重复上述操作，得到第二上清液；

(3)合并所述第一上清液和所述第二上清液，得到苦参子提取液；以及(4)取适量的所述苦参子提取液，添加至大孔树脂柱中，流速为0.05～0.15BV/min，其中上样过程中未吸附的部分为未吸附流分；使用3～7BV的水进行洗脱，流速为0.05～

0.15BV/min，获得水洗脱流分；将所述未吸附流分和所述水洗脱流分合并后，浓缩干燥，得到所述非生物碱部位。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述非生物碱部位包含以下成分中的一种或两种：γ‑L‑谷氨酰‑L‑酪氨酸和番石榴酸。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，在步骤(4)中，取适量的所述苦参子提取液，添加至大孔树脂柱中，流速为0.08～0.12BV/min，其中上样过程中未吸附的部分为未吸附流分；使用4～6BV的水进行洗脱，流速为0.08～0.12BV/min，获得水洗脱流分；将所述未吸附流分和所述水洗脱流分合并后，浓缩干燥，得到所述非生物碱部位。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，在步骤(4)中，取适量的所述苦参子提取液，添加至大孔树脂柱中，流速为约0.10BV/min，其中上样过程中未吸附的部分为未吸附流分；使用约5BV的水进行洗脱，流速为约0.10BV/min，获得水洗脱流分；将所述未吸附流分和所述水洗脱流分合并后，浓缩干燥，得到所述非生物碱部位。

5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述大孔树脂柱为HPD‑400大孔树脂柱、HPD‑100大孔树脂柱或HPD‑600大孔树脂柱。

6.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述大孔树脂柱为HPD‑400大孔树脂柱。

7.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述大孔树脂柱的径高比为1:6～1:

10。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述大孔树脂柱的径高比为约1:8。

9.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述方法的步骤(1)和(2)分别包括如下的[1]～[7]项中的任意一项或者多项：[1]所述水为蒸馏水或去离子水；

[2]所述水的用量为2～10倍量；

[3]所述离心的条件为在3000rpm～5000rpm转速下离心5～30分钟；

[4]所述超声提取的功率为200W～300W；

[5]所述超声提取的频率为30KHz～50KHz；

[6]所述超声提取的时间为35min～45min；

[7]所述苦参子粉末在进行水提取之前，不过筛或者过10目～40目筛。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述水的用量为6～10倍量。

11.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述水的用量为约6倍量。

12.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述离心的条件为在约4000rpm转速下离心约10分钟。

13.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述超声提取的功率为约250W。

14.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述超声提取的频率为约40KHz。

15.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述超声提取的时间为约40min。

16.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述苦参子粉末在进行水提取之前，过40目筛。

17.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述抑郁症或抑郁样行为为脂多糖诱导的抑郁症或抑郁样行为。

18.根据权利要求17所述的用途，其特征在于，所述抑郁症或抑郁样行为为脂多糖腹腔注射诱导的抑郁症或抑郁样行为。

19.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述抑郁症或抑郁样行为为哺乳动物体内P‑GSK‑3β、CyclinD1蛋白表达水平显著上升，β‑catenin、Wnt1蛋白水平表达显著下降的抑郁症或抑郁样行为。

20.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述抑郁症或抑郁样行为为哺乳动物大脑海马内细胞凋亡水平显著上升的抑郁症或抑郁样行为。

21.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述抑郁症或抑郁样行为包括以下的一种或多种：旷场实验的旷场中间区运动距离及运动速度降低、高架十字迷宫实验的开臂停留时间减少以及强迫游泳实验的不动时间增加。

说明书

苦参子提取物及有效部位的制备方法及其防治抑郁症的用途

技术领域

[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种苦参子提取物和有效部位的制备方法及其防治抑郁症的用途。

背景技术

[0002] 苦参子为豆科植物苦参(Sophora flavescens Ait.)的种子。苦参子中含有如氧化苦参碱、氧化槐果碱等具有独特药理活性的生物碱类成分，同时前期研究得到苦参子还含有两个含量较高的非生物碱类成分，γ‑L‑谷氨酰‑L‑酪氨酸和番石榴酸。因此，可考虑将苦参子用于酸性和碱性成分的分离原料。

[0003] 抑郁症又称抑郁障碍(major depressive disorder，MDD)，是最常见的精神障碍之一，其临床特征为显著而持久的心境低落。常病程迁延、反复发作，每次发作大多数可以缓解，部分可有残留症状或转为慢性，可造成严重的社会功能损害。抑郁症发病机制目前尚未阐明，大量研究表明，炎症因子会侵袭中枢神经系统，导致神经系统功能紊乱，神经炎症与抑郁症的发展密切相关。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)可引起海马体神经炎症状态，脑内促炎细胞因子增加，并诱导抑郁样行为，LPS腹腔注射诱导的抑郁样小鼠模型是目前被广泛认可，并能有效探讨抗抑郁作用的动物模型抑郁。

[0004] 现有技术中未见苦参子提取物和有效部位的分离制备方法及其抗抑郁作用的报道。

发明内容

[0005] 本发明的主要目的是提供一种工艺简单、重现性好、具备工业化应用前景的苦参子提取物和有效部位的制备分离方法及其抗抑郁作用，以解决现有技术中缺少相关制备分离方法及缺少相关抗抑郁作用研究的问题。

[0006] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种苦参子提取物的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)称取适量的苦参子粉末，加入一定量的溶剂，提取，离心，得到第一上清液；(2)滤渣加入一定量的溶剂，重复上述操作，得到第二上清液；(3)合并该第一上清液和该第二上清液，得到苦参子提取液；以及(4)将该苦参子提取液浓缩并干燥，得到苦参子提取物。

[0007] 根据本发明的另一个方面，提供了一种苦参子提取物的有效部位的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)称取适量的苦参子粉末，加入一定量的溶剂，提取，离心，得到第一上清液；(2)滤渣加入一定量的溶剂，重复上述操作，得到第二上清液；(3)合并该第一上清液和该第二上清液，得到苦参子提取液；以及(4)通过阳离子交换树脂柱层析法、大孔吸附树脂柱层析法或醇沉法对该苦参子提取液中的有效部位进行纯化。

[0008] 进一步地，该有效部位包含生物碱部位和/或非生物碱部位。

[0009] 进一步地，该生物碱部位包含以下成分中的一种或多种：N‑甲基金雀花碱、氧化槐果碱和氧化苦参碱。

[0010] 进一步地，该非生物碱部位包含以下成分中的一种或多种：γ‑L‑谷氨酰‑L‑酪氨酸和番石榴酸。

[0011] 进一步地，所述有效部位包含以下成分中的一种或多种：N‑甲基金雀花碱、氧化槐果碱、氧化苦参碱、γ‑L‑谷氨酰‑L‑酪氨酸和番石榴酸。

[0012] 进一步地，该阳离子交换树脂柱层析法包括以下步骤：(1)取适量的该苦参子提取液，加酸调pH至2.0～4.0，3000～5000r/min离心5～15min，取上清液，添加至阳离子交换树脂柱中，流速为0.05～0.15柱体积(BV)/min，其中上样过程中未吸附的部分为未吸附流分；(2)使用3～5BV的水进行洗脱，流速为0.05～0.15BV/min，得到水洗脱流分；(3)使用1～3倍量(溶液体积∶树脂质量，mL/g)的3％～10％氨水乙醇溶液将水进行洗脱之后的阳离子交换树脂进行回流提取1～3h，回流1～2次，得到3～10％氨水乙醇洗脱流分；以及(4)将该未吸附流分和该水洗脱流分合并后，浓缩干燥，得到该非生物碱部位；将该3～10％氨水乙醇洗脱流分浓缩干燥，得到该生物碱部位。

[0013] 进一步地，该阳离子交换树脂柱层析法包括以下步骤：(1)取适量的该苦参子提取液，加酸调pH至2.5～3.5，3500～4500r/min离心8～12min，取上清液，添加至阳离子交换树脂柱中，流速为0.08～0.12BV/min，其中上样过程中未吸附的部分为未吸附流分；(2)使用3.5～4.5BV的水进行洗脱，流速为0.08～0.12BV/min，得到水洗脱流分；(3)使用1.5～2.5倍量(溶液体积∶树脂质量，mL/g)的4％～8％氨水乙醇溶液将水进行洗脱之后的阳离子交换树脂进行回流提取1.5～2.5h，回流2次，得到4～8％氨水乙醇洗脱流分；以及(4)将该未吸附流分和该水洗脱流分合并后，浓缩干燥，得到该非生物碱部位；将该4～8％氨水乙醇洗脱流分浓缩干燥，得到该生物碱部位。

[0014] 进一步地，该阳离子交换树脂柱层析法包括以下步骤：(1)取适量的该苦参子提取液，加酸调pH至约3.0，约4000r/min离心约10min，取上清液，添加至阳离子交换树脂柱中，流速为约0.10BV/min，其中上样过程中未吸附的部分为未吸附流分；(2)使用约4BV的水洗脱，流速为约0.10BV/min，得到水洗脱流分；(3)使用约2倍量(溶液体积∶树脂质量，mL/g)的约5％氨水乙醇溶液将水进行洗脱之后的阳离子交换树脂进行回流提取约2h，回流2次，得到约5％氨水乙醇洗脱流分；以及(4)将该未吸附流分和该水洗脱流分合并后，浓缩干燥，得到该非生物碱部位；将约5％氨水乙醇洗脱流分浓缩干燥，得到该生物碱部位。

[0015] 进一步地，该酸为盐酸。

[0016] 进一步地，该阳离子交换树脂柱为732型阳离子交换树脂柱。

[0017] 其中，732型树脂是强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，利用离子树脂作为固定相与目标成分结合，除去多余杂质，实现物质分离，其有洗脱效果好，提取效率高的优点。具体而言，采用732型阳离子树脂对苦参子中的生物碱和非生物碱成分进行分离和纯化，其原理是：以732型阳离子交换树脂作为固定相，加酸后的苦参子提取液流过阳离子交换柱时，生物碱能以阳离子的形式与树脂上的基团发生离子交换，被吸附到阳离子交换柱上，其余非生物碱成分则流出，吸附完成后选择适当的洗脱剂洗脱生物碱，实现分离和纯化。

[0018] 进一步地，该阳离子交换树脂柱的径高比为1:6～1:10，例如约1:8。

[0019] 进一步地，该大孔吸附树脂柱层析法包括以下步骤：(1)取适量的该苦参子提取液，添加至大孔树脂柱中，流速为0.05～0.15BV/min，其中上样过程中未吸附的部分为未吸附流分；(2)依次使用3～7BV的水和3～7BV的20～40％乙醇进行洗脱，流速为0.05～0.15BV/min，分别获得水洗脱流分和20～40％乙醇洗脱流分；以及(3)将该未吸附流分和该水洗脱流分合并后，浓缩干燥，得到该非生物碱部位；将该20～40％乙醇洗脱流分浓缩干燥，得到该生物碱部位。

[0020] 进一步地，该大孔吸附树脂柱层析法包括以下步骤：(1)取适量的该苦参子提取液，添加至大孔树脂柱中，流速为0.08～0.12BV/min，其中上样过程中未吸附的部分为未吸附流分；(2)依次使用4～6BV的水和4～6BV的25～35％乙醇进行洗脱，流速为0.08～0.12BV/min，分别获得水洗脱流分和25～35％乙醇洗脱流分；以及(3)将该未吸附流分和该水洗脱流分合并后，浓缩干燥，得到该非生物碱部位；将该25～35％乙醇洗脱流分浓缩干燥，得到该生物碱部位。

[0021] 进一步地，该大孔吸附树脂柱层析法包括以下步骤：(1)取适量的该苦参子提取液，添加至大孔树脂柱中，流速为约0.10BV/min，其中上样过程中未吸附的部分为未吸附流分；(2)依次使用约5BV的水和约5BV的约30％乙醇进行洗脱，流速为约0.10BV/min，分别获得水洗脱流分和约30％乙醇洗脱流分；以及(3)将该未吸附流分和该水洗脱流分合并后，浓缩干燥，得到该非生物碱部位；将该约30％乙醇洗脱流分浓缩干燥，得到该生物碱部位。

[0022] 进一步地，该大孔树脂柱为HPD‑400大孔树脂柱、HPD‑100大孔树脂柱、HPD‑600大孔树脂柱。

[0023] 进一步地，该大孔树脂柱为HPD‑400大孔树脂柱。

[0024] 进一步地，该大孔树脂柱的径高比为1:6～1:10，例如约1:8。

[0025] 进一步地，该醇沉法包括以下步骤：取适量的该苦参子提取液，以1:5～1:15浓缩，得到浓缩液，加乙醇至醇浓度60～80％，静置过夜，3000～5000r/min离心5～15min，取上清液，蒸干得到该有效部位。

[0026] 进一步地，该醇沉法包括以下步骤：取适量的该苦参子提取液，以1:8～1:12浓缩，得到浓缩液，加乙醇至醇浓度70～80％，静置过夜，3500～4500r/min离心8～12min，取上清液，蒸干得到该有效部位。

[0027] 进一步地，该醇沉法包括以下步骤：取适量的该苦参子提取液，以约1:10浓缩，得到浓缩液，加乙醇至醇浓度约75％，静置过夜，约4000r/min离心约10min，取上清液，蒸干得到该有效部位。

[0028] 进一步地，该方法的步骤(1)和(2)分别包括如下的[1]～[11]项中的任意一项或者多项：

[0029] [1]该溶剂为水、50％甲醇水溶液、50％乙醇水溶液、0.2％盐酸水溶液和/或0.2％醋酸水溶液，进一步地，该溶剂为水、0.2％盐酸水溶液和/或0.2％醋酸水溶液，例如该溶剂为水；

[0030] [2]该水为蒸馏水或去离子水；

[0031] [3]该溶剂的用量为1～20倍量(L/kg)，进一步地为2～10倍量，进一步地为6～10倍量，例如约6倍量；

[0032] [4]该离心的条件为在2000rpm～6000rpm转速下离心5～60分钟，进一步地为在3000rpm～5000rpm转速下离心5～30分钟，例如在约4000rpm转速下离心约10分钟；

[0033] [5]该提取为超声提取、加热提取和/或冷浸提取，进一步地，该提取为超声提取；

[0034] [6]该超声提取的功率为150W～400W，进一步地为200W～300W，例如约250W；

[0035] [7]该超声提取的频率为20KHz～60KHz，进一步地为30KHz～50KHz，例如约40KHz；

[0036] [8]该超声提取的时间为30min～60min，进一步地为35min～45min，例如约40min；

[0037] [9]该加热提取的时间为0.5h～4h，进一步地为1h～2h，例如约1.5h；

[0038] [10]该冷浸提取的时间为4h～12h，进一步地为6h～10h，例如约8h；

[0039] [11]该苦参子粉末在进行溶剂提取之前，不过筛或者过10目～40目筛，例如40目筛。

[0040] 根据本发明的另一个方面，提供了一种通过上述方法制备的苦参子提取物和/或苦参子提取液的有效部位和/或苦参子提取液的非生物碱部位。

[0041] 根据本发明的另一个方面，提供了一种包含上述苦参子提取物和/或苦参子提取液的有效部位和/或苦参子提取液的非生物碱部位的药物组合物和/或制剂。

[0042] 根据本发明的另一个方面，提供了一种根据上述苦参子提取物和/或苦参子提取液的有效部位和/或苦参子提取液的非生物碱部位或上述药物组合物和/或制剂在制备用于防治抑郁症和/或抑郁样行为的药品、食品和/或保健品中的用途。

[0043] 进一步地，该抑郁症和/或抑郁样行为为脂多糖诱导的抑郁症和/或抑郁样行为。

[0044] 进一步地，该抑郁症和/或抑郁样行为为脂多糖腹腔注射诱导的抑郁症和/或抑郁样行为。

[0045] 进一步地，该抑郁症和/或抑郁样行为为哺乳动物体内P‑GSK‑3β、CyclinD1蛋白表达水平显著上升，β‑catenin、Wnt1蛋白水平表达显著下降的抑郁症和/或抑郁样行为。

[0046] 进一步地，该抑郁症和/或抑郁样行为为哺乳动物大脑海马内细胞凋亡水平显著上升抑郁症和/或抑郁样行为。

[0047] 进一步地，该抑郁症和/或抑郁样行为包括以下的一种或多种：旷场实验的旷场中间区运动距离及运动速度降低、高架十字迷宫实验的开臂停留时间减少以及强迫游泳实验的不动时间增加。

[0048] 本发明的有益效果：

[0049] 该制备方法工艺简单、节能环保、重现性好、所获得的苦参子提取物和/或苦参子提取物的有效部位具有工业大生产的可行性，并且通过LPS注射建立小鼠抑郁样动物模型，表明该苦参子提取物和/或苦参子提取物的有效部位对小鼠抑郁样行为具有改善作用。

附图说明

[0050] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本发明要求保护的范围。

[0051] 图1为不同提取溶剂下所获得的苦参子提取液的HPLC图。其中，1代表γ‑L‑谷氨酰‑L‑酪氨酸，2代表番石榴酸，3代表N‑甲基金雀花碱，4代表氧化槐果碱，5代表氧化苦参碱。

[0052] 图2为不同提取溶剂下所获得的苦参子提取物的出膏率、单位药材总生物碱提取量和单位药材五种单体提取量(图1所示五种单体之和)的对比图。

[0053] 图3为不同提取方式下所获得的苦参子提取液的HPLC图。其中，1代表γ‑L‑谷氨酰‑L‑酪氨酸，2代表番石榴酸，3代表N‑甲基金雀花碱，4代表氧化槐果碱，5代表氧化苦参碱。

[0054] 图4为不同提取方式下所获得的苦参子提取物的出膏率、单位药材总生物碱提取量和单位药材五种单体提取量(图3所示五种单体之和)的对比图。

[0055] 图5为不同原料粒度、提取次数和液料比下所获得的苦参子提取物的出膏率、单位药材总生物碱提取量和单位药材五种单体提取量(图3所示五种单体之和)的对比图。

[0056] 图6为苦参子提取物对小鼠海马内细胞凋亡水平的影响结果示意图。

[0057] 图7为苦参子提取物对Wnt1、β‑catenin、Cyclin D1、p‑GSK‑3β蛋白表达的影响结果示意图。

具体实施方式

[0058] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0059] 除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语和缩略语具有本发明领域或该术语应用领域中普通技术人员通常所理解的含义。虽然本发明实施过程中可使用类似于或等价于本文公开的那些的任何方法、条件、物质或材料，但本文描述了优选的方法、条件、物质或材料。

[0060] 本发明有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物，这些可能如权利要求所定义的那样包含在现有发明领域。所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法和物质，这些可以应用于本发明的实践中去。本发明绝非限于方法和物质的描述。

[0061] 本文所述的发明可以包括一个或多个数值范围(例如比例、功率、时间等)。将数值范围理解为包括所述范围内的全部值，包括限定所述范围的值，和临近所述范围且产生与限定所述范围边界的值紧邻的值相同或基本上相同结果的值。

[0062] 在一定程度上，具体实施方式和/或权利要求中使用术语“包含”、“包括(including，includes)”和“具有(having，has，with)”或其变体，这些术语意在包括与术语“包含(comprising)”类似的方式。

[0063] 术语“约”或“大约”是指在本领域技术人员所测定的特定值的可接收的误差范围内，该误差范围部分取决于如何测量或测定所述值，即，测量系统的限制。例如，根据本领域的实践操作，“约”可以是1或高于1的标准偏差范围内。可选地，“约”可指给定值的5％的范围。除非另有说明，在本发明中描述特定值的情况下，可假定术语“约”是指特定值的可接受的误差范围内。例如，“约3”包括3的±5％，或从2.85到3.15；“约4000”包括4000的±5％，或从3800到4200；“约10”包括10的±5％，或从9.5到10.5；“约0.1”包括0.1的±5％，或从0.095到0.105；“约4”包括4的±5％，或从3.8到4.2；“约9”包括9的±5％，或从8.55到9.45；
“约5”包括5的±5％，或从4.75到5.25；“约1:8”包括1:8的±5％，或从1:7.6到1:8.4；“约
30”包括30的±5％，或从28.5到31.5；“约1:10”包括1:10的±5％，或从1:9.5到1:10.5；“约
75”包括75的±5％，或从71.25到78.75；“约250”包括250的±5％，或从237.5到262.5；“约
40”包括40的±5％，或从38到42；“约1.5”包括1.5的±5％，或从1.425到1.575；“约8”包括8的±5％，或从7.6到8.4。

[0064] 制备实施例

[0065] 1实验材料

[0066] 高效液相色谱仪：岛津LC‑20A，SPD‑20A/20AV检测器(Prominence，Shimadzu，Japan)；N‑1100EYELA旋转蒸发仪(上海爱郎仪器有限公司)；塞多利斯BS‑210S万分之一电子天平(Sartorius公司)；塞多利斯BP211D十万分之一天平(Sartorius公司)；粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；Mettler Toledo pH仪(瑞士梅特勒‑托利多集团)；KQ3200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。对照品：γ‑L‑谷氨酰‑L‑酪氨酸(1)、番石榴酸(2)为实验室自制，纯度>98％，N‑甲基金雀花碱(3)(No.MUST‑19102511，纯度98.54％)，氧化苦参碱(5)(No.MUST‑20041315，纯度98.76％)购自成都曼斯特生物科技有限公司，氧化槐果碱(4)(No.111652‑200301)购自中国食品药品检定研究院。大孔树脂HPD100、HPD400和HPD600和732型阳离子交换树脂均购自沧州宝恩公司。

[0067] 苦参的种子(即苦参子)于2018年10月采自山西省长治市五谷山。

[0068] 2 方法与结果

[0069] 2.1 苦参子提取物的制备

[0070] 2.1.1苦参子提取物的制备方法

[0071] 称取苦参子粉末适量，加入适量的提取溶剂，采用适宜的提取方法进行提取，提取完毕后，4000r/min离心10min，得上清液，即为苦参子提取液。将上述苦参子提取液浓缩并干燥，得苦参子提取物。

[0072] 2.1.2出膏率的测定

[0073] 取2.1.1项下的苦参子提取液适量，旋转蒸发浓缩并干燥，称重，得苦参子提取物浸膏质量。出膏率(％)＝浸膏质量/生药量×100

[0074] 2.1.3总生物碱测定

[0075] (1)酸性染料溶液的配制

[0076] 取0.1mol/L磷酸二氢钾溶液300mL和0.1mol/L的氢氧化钠溶液280mL，混匀，得磷酸盐缓冲液(pH为7.0)；称取0.025g溴麝香草酚蓝溶于200mL磷酸盐缓冲液中，得浓度为0.2mmol/L的酸性染料溶液。

[0077] (2)对照品溶液的制备

[0078] 精密称取氧化苦参碱11.35mg，用80％乙醇制备成浓度为0.1135mg/mL的对照品溶液。

[0079] (3)标准曲线的制备

[0080] 精密吸取对照品溶液0.0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、0.8.、1.0mL，置50mL分液漏斗中，分别加入80％乙醇溶液1.0、0.8、0.7、0.6、0.5、0.3、0.2、0.0mL，再分别精密加入酸性染料溶液6mL和氯仿6mL，剧烈振摇1min使充分混匀，静置2h使充分分层。取氯仿层，以相应的试剂作为空白，在418nm波长处测定吸光度。以吸光度(Y)为纵坐标，浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线。氧化苦参碱在0.0227～0.1135mg/mL范围内与吸光度呈良好线性关系，回归方程为Y＝7.6601X+0.0019(r＝0.999)

[0081] (4)测定法

[0082] 精密量取2.1.1项下的苦参子提取液1.0mL，按(3)标准曲线下“精密加入酸性染料溶液6mL和氯仿6mL”后面的操作，测定吸光度，使用标准曲线计算提取液中单位药材总生物碱提取量。

[0083] 单位药材总生物碱提取量(mg/g)＝提取液中总生物碱质量/生药量2.1.4五种单体的含量测定

[0084] 采用HPLC法测定苦参子提取液中N‑甲基金雀花碱、氧化槐果碱、氧化苦参碱、γ‑L‑谷氨酰‑L‑酪氨酸和番石榴酸五种单体的含量，计算单位药材五种单体提取量。

[0085] 单位药材五种单体提取量(mg/g)＝提取液中五种单体质量之和/生药量。

[0086] (1)色谱条件

[0087] 色谱柱Phenomenex Luna C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相以甲醇(A)‑0.2％磷酸二氢钾溶液(磷酸调节pH值至2.6)(B)进行梯度洗脱(0～10min，5％A；10～12min，5％～11％A；12～35min，11％A)；检测波长225nm，柱温30℃，流速1mL/min。

[0088] (2)对照品溶液的制备

[0089] 精密称取N‑甲基金雀花碱、氧化槐果碱、氧化苦参碱、γ‑L‑谷氨酰‑L‑酪氨酸和番石榴酸适量，配置成浓度为0.0446、0.0396、0.164、0.106和0.133mg/mL的混合对照品溶液。

[0090] (3)测定法

[0091] 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液(2.1.1项下的苦参子提取液)各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

[0092] 2.1.5数据处理

[0093] 将各组实验的出膏率、单位药材总生物碱提取量和单位药材五种单体提取量等3个指标按照不同的加权系数，进行综合评分。加权系数即每个指标的平均值与3个指标的平均值总和的比值。

[0094]

[0095] 即出膏率加权系数为A＝0.16，单位药材总生物碱提取量的加权系数为B＝0.42，单位药材五种单体提取量C＝0.42。

[0096] 综合评分＝0.16×出膏率+0.42×单位药材总生物碱提取量+0.42×单位药材五种单体提取量

[0097] 2.1.6苦参子提取物的制备工艺考察

[0098] 2.1.6.1提取溶剂考察

[0099] 按照2.1.1项下方法，称取苦参子粉末(40目筛)约4.00g，冷浸法进行提取，其中提取时间为8h，料液比为1:10(g/mL)，考察不同提取溶剂(水、50％甲醇、50％乙醇、0.2％盐酸水溶液和0.2％醋酸水溶液)对出膏率、单位药材总生物碱提取量和单位药材五种单体提取量(五者之和)的影响。HPLC图谱如图1所示，结果如图2所示。

[0100] 由图2可知，水、0.2％盐酸水溶液和0.2％醋酸水溶液3种提取溶剂的出膏率相当，高于50％甲醇和50％乙醇的出膏率；0.2％醋酸水溶液的单位药材总生物碱提取量最高，其次为0.2％盐酸水溶液和水，而50％甲醇和50％乙醇的单位药材总生物碱提取量最低；对于单位药材五种单体提取量，0.2％醋酸水溶液和水相当，略高于0.2％盐酸水溶液，而50％甲醇和50％乙醇的单位药材五种单体提取量最低。同时，按照2.1.5项下方法进行综合评分，提取溶剂分别为水、0.2％盐酸水溶液、0.2％醋酸水溶液、50％甲醇和50％乙醇时，其综合评分依次为31.04、31.16、33.45、22.59和20.18。综上并考虑到绿色环保和工艺成本等因素，选择水为提取溶剂。

[0101] 2.1.6.2提取方式考察

[0102] 按照2.1.1项下方法，称取苦参子粉末(40目筛)约4.00g，加入10倍量水，分别采用超声(功率250W，频率40KHz)40min、煎煮1.5h和冷浸8h三种方式进行提取，考察不同提取方式对出膏率、单位药材总生物碱提取量和单位药材五种单体提取量的影响。HPLC图谱如图3所示，结果如图4所示。

[0103] 由图4可知，不同提取方式的出膏率为：超声>煎煮>冷浸，且采用超声提取时，单位药材总生物碱提取量和单位药材五种单体提取量最高。同时，按照2.1.5项下方法进行综合评分，超声、煎煮和冷浸的综合评分分别为35.96、33.84和31.04。因此，提取方式选择超声提取。

[0104] 2.1.6.3提取条件考察

[0105] 提取工艺参数选择原料粒度、提取次数和料液比等3个因素进行单因素实验考察。

[0106] (1)原料粒度

[0107] 按照2.1.1项下方法，分别称取粗粉(不过筛)、10目、24目和40目等4种粒度的苦参子粉末约4.00g，加入10倍量水，超声(功率250W，频率40KHz)40min进行提取，考察不同原料粒度对出膏率、单位药材总生物碱提取量和单位药材五种单体提取量的影响。结果见图5的原料粒度柱状图。

[0108] 由图5的原料粒度柱状图可知，随着原料粒度的减小，单位药材总生物碱提取量和单位药材五种单体提取量呈上升趋势；原料粒度为粗粉、10目和24目时，出膏率无明显差别，但三者均小于40目。同时，按照2.1.5项下方法进行综合评分，粗粉、10目、24目和40目的综合评分分别为31.54、33.54、34.48和36.91。因此，原料粒度选择40目。

[0109] (2)提取次数

[0110] 按照2.1.1项下方法，称取苦参子粉末约4.00g，加入10倍量水，超声(功率250W，频率40KHz)40min进行提取，提取次数分别为1次和2次，考察不同提取次数对出膏率、单位药材总生物碱提取量和单位药材五种单体提取量的影响。结果见图5的提取次数柱状图。

[0111] 由图5的提取次数柱状图可知，提取次数为2次时，出膏率、单位药材总生物碱提取量和单位药材五种单体提取量均明显大于提取次数为1次。同时，按照2.1.5项下方法进行综合评分，提取次数为1次和2次的综合评分分别为31.54和41.65。因此，提取次数选择为2次。

[0112] (3)料液比

[0113] 按照2.1.1项下方法，称取苦参子粉末约4.00g，分别加入24、32、40、48mL(料液比分别为1:6、1:8、1:10和1:12)，超声(功率250W，频率40KHz)40min进行提取，考察不同料液比对出膏率、单位药材总生物碱提取量和单位药材五种单体提取量的影响。结果如图5的液料比柱状图所示。

[0114] 由图5的液料比柱状图可知，随着提取溶剂的增加，出膏率呈现上升趋势，但单位药材总生物碱提取量和单位药材五种单体提取量呈现出下降趋势。同时，按照2.1.5项下方法进行综合评分，料液比为1:6、1:8、1:10和1:12的综合评分分别为32.28、31.85、31.54和29.66。综上，选择料液比为1:6最为合适。

[0115] 综上所述，如图5所示，苦参子的提取条件为：料液比为1:6，原料粒度为40目，提取次数为2次。

[0116] 2.1.6.4苦参子提取物最佳制备工艺的确定

[0117] 根据上述研究结果，确定苦参子提取物的最佳制备工艺为：称取苦参子粉末(40目)适量，加入6倍量水，超声(功率250W，频率40KHz)提取40min，4000r/min离心10min，得上清液；滤渣加6倍量水，重复上述操作，合并两次上清液，得苦参子提取液。将上述苦参子提取液浓缩并干燥，得苦参子提取物。

[0118] 2.1.7苦参子提取物制备工艺验证

[0119] 称取苦参子粉末(40目)约170g，按照2.1.6.4项下方法，进行平行3次试验的工艺验证。出膏率、单位药材总生物碱提取量和单位药材五种单体提取量及综合评分结果如表1所示。结果显示，出膏率、单位药材总生物碱提取量、单位药材五种单体提取量及综合评分的RSD均小于5％，表明其工艺稳定。并且，在该工艺条件下，总生物碱转移率为65.1％，五种单体转移率为66.4％，表明该工艺适用于苦参子提取物的制备。

[0120] 总生物碱转移率＝单位药材总生物碱提取量/单位药材总生物碱含量×100％[0121] 五种单体转移率＝单位药材中五种单体提取量/单位药材五种单体含量×100％[0122] 表1苦参子提取物的出膏率、单位药材总生物碱提取量、单位药材五种单体提取量及综合评分结果

[0123]

[0124]

[0125] 2.2苦参子有效部位的制备和纯化

[0126] 在制备苦参子提取液的基础上，进一步通过阳离子交换树脂、大孔树脂和醇沉等三种方法对苦参子的有效部位进行制备和纯化。

[0127] 2.2.1供试品溶液制备

[0128] 分别取苦参子提取液、各流分或部位，浓缩并干燥得浸膏，精密称取浸膏20mg，置于5mL容量瓶中，(1)加0.2％醋酸水溶液定容至刻度，摇匀，12000r/min离心10min，取上清液，用于总生物碱的测定；(2)加甲醇‑0.2％磷酸二氢钾水溶液定容至刻度，摇匀，12000r/min离心10min，取上清液，用于五种单体的含量测定。

[0129] 2.2.2评价指标

[0130] (1)出膏率：出膏率(％)＝浸膏质量/生药量×100

[0131] (2)总生物碱含量：测定条件同2.1.3。总生物碱含量(mg/g)＝浸膏中总生物碱质量/浸膏质量

[0132] (3)五种单体的含量：色谱条件同2.1.4。单体含量(mg/g)＝浸膏中单体的质量/浸膏质量

[0133] 2.2.3阳离子交换树脂法制备生物碱部位和非生物碱部位

[0134] 2.2.3.1上样

[0135] 取2.1.7项下的苦参子提取液，加盐酸调pH至3.0，4000r/min离心10min，取上清液作为上样液，添加至732型阳离子交换树脂柱中(径高比1:8，柱体积100mL)，流速为0.10BV/min，每一个柱体积收集一个流分，其中上样过程中未吸附的部分为未吸附流分。实验结果表明：上样过程中，第1～17个流分中，每个流分均含有γ‑L‑谷氨酰‑L‑酪氨酸和番石榴酸，说明阳离子交换树脂对上述非生物碱成分吸附作用弱，合并上述流分，作为未吸附流分；第1～17个流分中，几乎不含N‑甲基金雀花碱、氧化槐果碱和氧化苦参碱，说明阳离子交换树脂对生物碱成分的吸附作用良好；上样至第18个柱体积时，氧化苦参碱已经开始有明显的泄露，说明阳离子交换树脂对生物碱成分的吸附已经达到近饱和状态。故苦参子提取液调酸后的上清液(相当于0.1g生药/mL)的上样量为17个柱体积。

[0136] 2.2.3.2水洗脱

[0137] 使用4BV的水进行洗脱，流速为0.1BV/min，获得水洗脱流分。结果表明：水洗脱流分中，主要含有γ‑L‑谷氨酰‑L‑酪氨酸和番石榴酸，几乎不含N‑甲基金雀花碱、氧化槐果碱和氧化苦参碱。因此，将水洗脱流分和2.2.3.1项下的未吸附流分合并，浓缩干燥，得到非生物碱部位。

[0138] 2.2.3.3解吸附

[0139] (1)上柱洗脱

[0140] 使用5％氨水乙醇溶液作为洗脱剂进行洗脱，直至流出液无生物碱即可，共用去9BV的洗脱剂。结果如表2所示，总生物碱含量可达到689mg/g，三种生物碱的总含量达到
475mg/g，但出膏率较小，推测可能有死吸附。

[0141] (2)回流洗脱

[0142] 将上样后的阳离子交换树脂取出，抽干，称重，混匀，分为7份，每份15g，使用氨水乙醇溶液回流进行解吸附，分别考察回流时间、氨水含量、氨水乙醇溶液用量和提取次数对解吸附的影响。

[0143] 回流时间考察：加入2倍量5％氨水乙醇溶液，回流时间分别为1h，2h，3h，测定出膏率、总生物碱含量和5种单体含量，结果如表2所示。结果显示，三者的出膏率相差不大，但回流时间为2h和3h时，生物碱含量更高，综合考虑能耗和工作效率，回流时间选择2h。

[0144] 氨水含量考察：分别加入2倍量5％和10％氨水乙醇溶液，回流2h，测定出膏率、总生物碱含量和5种单体含量，结果如表2所示。结果显示，氨水含量为5％和10％时，对结果影响不显著，故选择5％氨水乙醇溶液。

[0145] 氨水乙醇溶液用量考察：分别加入1倍、2倍和3倍量的5％氨水乙醇溶液，回流2h，测定出膏率、总生物碱含量和5种单体含量，结果如表2所示。结果显示，2倍量和3倍量洗脱剂的出膏率和生物碱含量明显大于1倍量，而2倍量与3倍量洗脱剂之间的差别较小，结合实用性和节省成本等方面的考虑，选择使用2倍量的5％氨水乙醇溶液。

[0146] 提取次数考察：加入2倍量5％氨水乙醇，回流2h，提取次数为1次和2次，测定出膏率、总生物碱含量和5种单体含量，结果如表2所示。结果显示，提取2次的出膏率和生物碱含量明显高于提取1次，故提取次数选择2次。

[0147] 综上所述，回流洗脱时选择使用2倍量的5％氨水乙醇溶液回流2h，回流次数为2次。

[0148] 比较上柱洗脱和回流洗脱对解吸附的影响发现，回流洗脱的出膏率可达4.21％，且总生物含量可达779mg/g(77.9％)，而上柱洗脱的出膏率仅为1.61％，总生物碱含量为689mg/g(68.9％)，因此优选回流洗脱。

[0149] 表2阳离子交换树脂解吸附考察结果

[0150]

[0151] 注：“ND”表示未检出。

[0152] 2.2.3.4阳离子交换树脂的最佳工艺参数

[0153] 根据上述考察结果，采用阳离子交换树脂制备苦参子提取物的有效部位的最佳工艺参数为：732型阳离子交换树脂(径高比1:8)为吸附介质；上样量为17BV的苦参子提取液调酸后的上清液(相当于0.1g生药/mL)，流速为0.10BV/min；使用4BV的水进行洗脱，流速为0.1BV/min；解吸附采用回流洗脱，洗脱条件为：使用2倍量的5％氨水乙醇溶液回流2h，回流次数为2次。

[0154] 2.2.3.5苦参子有效部位制备工艺验证

[0155] 称取苦参子粉末(40目)约170g，按照2.1.6.4项下方法制备苦参子提取液，按照2.2.3.4项下的最佳工艺参数制备苦参子提取物的有效部位，进行平行3次试验的工艺验证。分别得到苦参子提取液浸膏、上样液浸膏、未吸附部位浸膏、水洗部位浸膏、洗脱液浸膏，考察结果如表3所示。

[0156] 结果显示，未吸附部位浸膏的平均质量为22.5g，水洗部位浸膏的平均质量为0.99g，二者均不含生物碱，含有γ‑L‑谷氨酰‑L‑酪氨酸和番石榴酸等非生物碱成分，即为非生物碱部位。上样液浸膏质量为34.6g，总生物碱质量为5.40g；洗脱液浸膏的平均质量为
6.46g，总生物碱的平均含量为755mg/g(75.5％)，故总生物碱质量为4.88g，则总生物碱转移率＝洗脱液浸膏中总生物碱质量/上样液浸膏中总生物碱质量×100％＝4.88g/5.40g×
100％＝90.4％。因此，洗脱液浸膏即为生物碱部位。上述结果表明，该工艺适用于苦参子提取物的非生物碱部位和生物碱部位的制备和纯化。

[0157] 表3阳离子交换树脂法的工艺验证考察结果

[0158]

[0159] 注：“ND”表示未检出。

[0160] 2.2.4大孔吸附树脂法制备生物碱部位和非生物碱部位

[0161] 2.2.4.1不同型号的大孔吸附树脂的考察

[0162] 称取经预处理的不同型号的大孔吸附树脂(、、)各10g(湿质量)置于100mL锥形瓶中，各加入2.1.7项下的苦参子提取液50mL(相当于0.1g生药/mL)，持续振摇30min，静置24h后，4000r/min离心10min，上清液定容至50mL，得未吸附溶液；将吸附后的各型号大孔吸附树脂分别置于100mL锥形瓶中，加入95％乙醇50mL，静置24h后，4000r/min离心10min，上清液定容至50mL，得解吸附溶液。测定未吸附溶液和解吸附溶液中总生物碱含量，计算吸附率和解吸率。其中：吸附率＝(苦参子提取液中总生物碱质量‑未吸附溶液中总生物碱质量)/苦参子提取液中总生物碱质量×100％；解吸率＝解吸附溶液中总生物碱质量/(苦参子提取液中总生物碱质量‑未吸附溶液中总生物碱质量)×100％。

[0163] 、和大孔吸附树脂的总生物碱吸附率分别为65.5％、67.1％和50.5％，解吸率分别为71.6％、70.1％和71.0％，表明上述3种大孔吸附树脂的解吸率相当，但和的吸附率明显高于。本实验选择大孔吸附树脂进行考察。

[0164] 2.2.4.2上样量考察

[0165] 取2.1.7项下的苦参子提取液(相当于0.1g生药/mL)，添加至大孔树脂柱(柱体积100mL，径高比1:8)中，流速为0.10BV/min，每一个柱体积收集一个流分，依次上样8个流分。
测定每个流分的出膏率和5种单体的含量，结果如表4所示。

[0166] 结果显示，上样的每个流分中，均含有γ‑L‑谷氨酰‑L‑酪氨酸和番石榴酸等非生物碱成分，说明大孔吸附树脂对上述非生物碱成分的吸附作用弱，合并上述流分，作为未吸附流分；上样至第6个柱体积时，N‑甲基金雀花碱开始有明显的泄露，上样至第7个柱体积时，氧化苦参碱也开始有明显的泄露。故苦参子提取液(相当于0.1g生药/mL)的上样量为5个柱体积。

[0167] 表4大孔吸附树脂法各上样流分的出膏率及5种单体的含量

[0168]

[0169]

[0170] 注：“ND”表示未检出。

[0171] 2.2.4.3生物碱部位和非生物碱部位的制备

[0172] 取2.1.7项下的苦参子提取液(相当于0.1g生药/mL)，添加至大孔吸附树脂柱(柱体积100mL，径高比1:8)中，流速为0.10BV/min，上样量为5BV，上样过程中的流分为未吸附流分；上样完成后静置12h，依次使用5BV的水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇进行洗脱，速度均为0.10BV/min，分别获得水洗脱流分、30％乙醇洗脱流分、50％乙醇洗脱流分、70％乙醇洗脱流分和95％乙醇洗脱流分。测定苦参子提取液、未吸附流分以及各洗脱流分的出膏率、总生物碱含量和五种单体含量，结果如表5所示。

[0173] 结果显示，γ‑L‑谷氨酰‑L‑酪氨酸和番石榴酸等非生物碱成分主要集中在未吸附部位流分和水洗脱流分，二者合并，即为非生物碱部位。30％乙醇洗脱流分的出膏率为4.90％，总生物碱含量可达631mg/g(63.1％)，三种生物碱含量之和可达到422mg/g(42.2％)，不含γ‑L‑谷氨酰‑L‑酪氨酸，即为生物碱部位。此外，50％乙醇洗脱流分、70％乙醇洗脱流分和95％乙醇洗脱流分的总生物碱含量很低，其它杂质多，弃去。

[0174] 表5大孔吸附树脂法各流分的考察结果

[0175]

[0176]

[0177] 注：“ND”表示未检出。

[0178] 2.2.5醇沉法制备总有效部位

[0179] 醇沉法可使苦参子提取液中的蛋白和多糖等在醇溶液中溶解度降低而析出沉淀，固液分离后使水提液得以精制，简单可行。出于成本和应用方向考虑，可采用醇沉法制备苦参子提取液的总有效部位。

[0180] 取2.1.7项下的苦参子提取液200mL，浓缩至20mL(相当于1.0g生药/mL)，加95％乙醇至乙醇浓度为75％，静置过夜，4000r/min离心10min，得沉淀和上清液。取上清液，减压浓缩并干燥，得上清液浸膏。测定苦参子提取液浸膏、上清液浸膏和沉淀的出膏率、总生物碱含量和五种单体含量，结果如表6所示。

[0181] 结果显示，上清液浸膏中总生物碱含量为350mg/g(35％)，五种单体含量之和为341mg/g(34.1％)，与提取液浸膏中总生物碱含量及五种单体含量比较，均得到了纯化，即为总有效部位。而沉淀中总生物碱含量及五种单体含量很低，含有大量的蛋白和多糖等杂质，弃去。因此醇沉法可用于苦参子提取物的总有效部位的制备和纯化。

[0182] 表6醇沉法各部位的出膏率、总生物碱含量和五种单体含量

[0183]

[0184] 由上述结果可知，采用阳离子交换树脂法制备的生物碱部位，总生物碱含量可达75.5％，故阳离子交换树脂法是制备生物碱部位的最佳制备方法；采用大孔吸附树脂法制备的非生物碱部位，其中γ‑L‑谷氨酰‑L‑酪氨酸和番石榴酸的含量之和可达10.5％，故大孔吸附树脂法是制备非生物碱部位的最佳制备方法；而采用醇沉法制备苦参子提取液的总有效部位，5种单体(N‑甲基金雀花碱、氧化槐果碱、氧化苦参碱、γ‑L‑谷氨酰‑L‑酪氨酸和番石榴酸)的含量之和可达34.1％，使苦参子水提液得以精制，且方法简单可行。

[0185] 药效实施例

[0186] 1材料与方法

[0187] 1.1动物

[0188] SPF级雄性C57BL/6小鼠72只，体重18‑20g，购于维通利华有限公司。饲养于SPF级动物房，室温20℃～24℃，相对湿度为50～60％，光照节律12L/12D(7：00～19：00)，提供充足饲料和水，保持安静，定期清洁和消毒。购进后适应性饲养一周，自由摄食饮水。

[0189] 1.2药品与试剂

[0190] 苦参子提取物(参照上述2.1.6.4的方法进行制备)、总有效部位(参照上述2.2.5的方法进行制备)、非生物碱部位(参照上述2.2.4.3的方法进行制备)和生物碱部位样品(参照上述2.2.3.5的方法进行制备)为实验室自制；盐酸氟西汀分散片(百忧解，礼来苏州有限公司)；LPS(Sigma公司，货号L2880)；Wnt1抗体(Affinity公司，批号AF5315‑50μl)；β‑catenin抗体(Affinity公司，批号AF6266)；磷酸化GSK‑3β(Ser9)抗体(Affinity公司，批号AF2016)；Cyclin D1抗体(Affinity公司，批号AF0931)；PBS缓冲液(Servicebio，批号G0002)；蛋白酶K(Servicebio，批号G1205)；破膜液(Servicebio，批号G1204)；DAPI(Servicebio，批号G1012)；抗荧光淬灭封片剂(Servicebio，批号G1401)；Tunel试剂盒(Servicebio，批号G1501)；(武汉博士德，批号EK0417)；(武汉博士德，批号EK0393)；(武汉博士德，批号EK0527)；(武汉博士德，批号EK041)。二甲苯、无水乙醇、磷酸和磷酸二氢钾等均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

[0191] 1.3动物分组

[0192] 72只雄性小鼠分为9组，分别为对照组、模型组、氟西汀组(2.5mg/kg)、苦参子提取物低剂量组(200mg/kg)、苦参子提取物中剂量组(400mg/kg)、苦参子提取物高剂量组(800mg/kg)、苦参子总有效部位组(600mg/kg)、苦参子非生物碱部位组(600mg/kg)和苦参子生物碱部位组(600mg/kg)。

[0193] 1.4造模和给药

[0194] 对小鼠分别进行7天的苦参子提取物以及各有效部位灌胃预处理，氟西汀组灌胃2.5mg/kg盐酸氟西汀，对照组和模型组灌胃相应剂量的生理盐水。第7天，模型组、氟西汀组、苦参子提取物各剂量组以及各有效部位组进行LPS腹腔注射(1.5mg/kg)后给药。

[0195] 1.5行为学检测

[0196] 1.5.1旷场实验

[0197] 给药后24h进行行为学测试。旷场实验设备尺寸为60cm×60cm，将旷场中心30×30cm的区域定义为中心区，其他区域为周围区。试验开始时将小鼠置于旷场周围区，用摄像头记录其在旷场中5min自由活动的轨迹，并记录其在旷场中心区的运动时间和距离。

[0198] 1.5.2高架十字迷宫实验

[0199] 试验开始前将小鼠笼置于高架十字迷宫房间中适应30min，试验开始时将小鼠面向开臂置于迷宫中心位置，用摄像头记录其在迷宫中5min自由活动的轨迹，记录其分别在闭臂和开臂中的停留时间。

[0200] 1.5.3强迫游泳试验

[0201] 强迫游泳装置是一圆柱形塑料桶，直径为20cm，高度为50cm。桶中水深30cm左右，水温保持在24℃左右。每只小鼠游泳时间均为6min，未进行预先筛选，后4min记录小鼠不动时间，以小鼠漂浮在水面无挣扎为不动标准。

[0202] 1.6取材

[0203] 小鼠行为学实验结束后处死，迅速于冰上取大脑全脑并用生理盐水冲洗掉血液，存于‑80℃冰箱中备用。

[0204] 1.7末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞[0205] 小鼠取脑，分离海马，石蜡包埋，4μm切片后，置于二甲苯中脱蜡，梯度酒精中水化，‑120μg·mL 蛋白酶K 37℃下消化30min，加入含末端脱氧核苷酸转移酶和荧光素标记的dUTP混合反应液，37℃孵育2h；再滴加连接碱性磷酸酶的抗荧光素抗体，于37℃下孵育30min；苏木素轻衬染，常规脱水、透明、封片，光镜下观察。

[0206] 1.8炎症因子含量测定

[0207] 分离小鼠脑组织，碾磨后融解RIPA裂解液，混匀，高速离心(12000r·min‑1)5min，取上清液，按说明书操作，酶联免疫吸附法(ELISA)检测脑组织中IL‑1β、IL‑6、TNF‑α和IL‑10含量。

[0208] 1.9蛋白免疫印迹法(Western‑Blot)

[0209] 称取小鼠全脑，加入10倍体积的匀浆介质提取蛋白，12000r·min‑1离心5min，并按‑1照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书测定组织匀浆上清液中蛋白浓度为0.5μg·μL ，配分离胶，将蛋白样品与缓冲液混合后于100℃处理5min，每孔上样40μg总蛋白。以每块胶15mA恒流电源进行电泳；根据预染Marker和目的蛋白的分子量大小的相对位置判断目的蛋白位置，当目的蛋白处于分离胶面的下1/3的最佳分辩位置时停止电泳分离。转膜过程在4℃进‑1
行，转膜条件为100V·100mA 。用含5％脱脂奶粉的TBST(封闭液)浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2h。用封闭液稀释相应的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育过夜。TBST充分洗涤PVDF膜3～4次，15min/次。用封闭液稀释HRP标记二抗‑‑1:1000稀释，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37℃摇床孵育2h，TBST充分洗涤PVDF膜3‑4次，15min/次，ECL发光并进行相应的图像采集处理。

[0210] 1.10统计学分析

[0211] 采用SPSS16.0统计软件进行数据分析，实验数据均以均数±标准误差 表示，组间均数比较采用t检验(t‑test)，以P<0.05为差异有统计学意义。

[0212] 2结果

[0213] 2.1苦参子提取物和有效部位对小鼠抑郁样行为的影响

[0214] 2.1.1苦参子提取物和有效部位对小鼠旷场实验的影响

[0215] 与对照组比较，模型组小鼠的旷场中间区运动距离和运动速度非常显著下降(P<0.01)。与模型组比较，氟西汀组小鼠的旷场中间区运动距离和运动速度显著上升(P<
0.05)；苦参子提取物中剂量组和高剂量组、总有效部位组、非生物碱部位组以及生物碱部位组小鼠的旷场中间区运动速度显著上升(P<0.05)，苦参子提取物高剂量组和非生物碱部位组小鼠的旷场中间区运动距离亦显著上升(P<0.05)。结果如表7所示。

[0216] 表7苦参子提取物和有效部位对小鼠旷场实验旷场中间区运动距离及运动速度的影响

[0217]

[0218] 注：与对照组比较1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较3)P<0.05，4)P<0.01[0219] 2.1.2苦参子提取物和有效部位对小鼠高架十字迷宫实验的影响与对照组比较，模型组小鼠高架十字迷宫开臂停留时间非常显著下降(P<0.01)。与模型组比较，氟西汀组小鼠的高架十字迷宫开臂停留时间非常显著上升(P<0.01)；苦参子提取物低剂量组和中剂量组、总有效部位组以及生物碱部位组小鼠的高架十字迷宫开臂停留时间显著上升(P<0.05)，苦参子提取物高剂量组和非生物碱部位小鼠的高架十字迷宫开臂停留时间非常显著上升(P<0.01)。此外，与非生物碱部位组比较，总有效部位组和生物碱部位组小鼠的高架十字迷宫开臂停留时间具有显著性差异(P<0.05)，非生物碱部位组的开臂停留时间显著上升。结果如表8所示。

[0220] 表8苦参子提取物和有效部位对小鼠高架十字迷宫开臂停留时间的影响[0221]

[0222]组别 高架十字迷宫开臂停留时间(s)
对照组 41.14±20.12
2)
模型组 8.95±5.55
4)
氟西汀组 22.98±17.19
3)
提取物低剂量组 10.75±3.21
3)
提取物中剂量组 15.08±5.86
4)
提取物高剂量组 22.51±10.88
3),5)
总有效部位组 15.61±4.37
4)
非生物碱部位组 24.40±8.15
3),5)
生物碱部位组 15.15±5.71

[0223] 注：与对照组比较1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较3)P<0.05，4)P<0.01；与非生物5) 6)
碱部位组比较 P<0.05，P<0.01

[0224] 2.1.3苦参子提取物和有效部位对小鼠强迫游泳实验不动时间的影响与对照组比较，模型组小鼠的强迫游泳不动时间显著上升(P<0.05)。与模型组比较，氟西汀组小鼠的强迫游泳不动时间显著下降(P<0.05)；苦参子提取物中剂量组和高剂量组、总有效部位组、非生物碱部位组以及生物碱部位组小鼠的强迫游泳不动时间亦显著下降(P<0.05)。结果如表9所示。

[0225] 表9苦参子提取物和有效部位对小鼠强迫游泳不动时间的影响

[0226]

[0227]

[0228]

[0229] 注：与对照组比较1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较3)P<0.05，4)P<0.01[0230] 2.2TUNEL染色法检测各组小鼠海马细胞凋亡水平

[0231] 如图6所示，与对照组比较，模型组小鼠的TUNEL阳性细胞明显增加。与模型组比较，氟西汀组、苦参子中剂量组和高剂量组小鼠的TUNEL阳性细胞明显减少。

[0232] 与对照组比较，模型组小鼠的TUNEL阳性细胞比例显著上升(P<0.01)。与模型组比较，氟西汀组小鼠的TUNEL阳性细胞比例非常显著降低(P<0.01)；苦参子中剂量组和高剂量组小鼠的TUNEL阳性细胞比例亦非常显著降低(P<0.01)。结果如表10所示。

[0233] 表10苦参子提取物对小鼠TUNEL阳性细胞比例的影响

[0234] 组别 TUNEL阳性细胞比例(％)对照组 0.37±0.32
2)
模型组 17.20±1.91
4)
氟西汀组 1.69±0.47
提取物低剂量组 15.03±1.87
4)
提取物中剂量组 9.60±1.58
4)
提取物高剂量组 3.09±0.79

[0235] 注：与对照组比较1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较3)P<0.05，4)P<0.01[0236] 2.3炎症因子含量测定

[0237] 与对照组比较，模型组小鼠炎性因子TNF‑α、IL‑6和IL‑1β的含量非常显著上升(P<0.01)，抗炎性因子IL‑10的含量非常显著下降(P<0.01)。与模型组比较，氟西汀组、苦参子中剂量组和高剂量组炎性因子TNF‑α、IL‑6和IL‑1β的含量显著下降(分别为P<0.01，P<0.05和P<0.01)；氟西汀组、苦参子中剂量组和高剂量组的抗炎性因子IL‑10的含量均有显著上升(P<0.05)。结果如表11所示。

[0238] 表11苦参子提取物对小鼠炎症因子含量的影响

[0239]

[0240] 注：与对照组比较1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较3)P<0.05，4)P<0.01[0241] 2.4苦参子提取物对Wnt/β‑catenin信号转导通路中关键蛋白表达水平的改变[0242] 与对照组比较，模型组小鼠Wnt1和β‑catenin蛋白表达非常显著下降(P<0.01)；Cyclin D1、p‑GSK‑3β蛋白表达非常显著上升(P<0.01)。与模型组相比，氟西汀组小鼠的Wnt1蛋白和β‑catenin蛋白表达非常显著上升(P<0.01)，Cyclin D1蛋白和p‑GSK‑3β蛋白表达非常显著下降(P<0.01)；苦参子提取物中剂量组和高剂量组给药后，均能非常显著上调LPS导致的低水平Wnt1和β‑catenin蛋白表达(P<0.01)，非常显著降低小鼠异常增高的Cyclin D1和p‑GSK‑3β蛋白表达水平(P<0.01)。结果如表12和图7所示。

[0243] 表12苦参子提取物对Wnt1、Cyclin D1、β‑catenin、p‑GSK‑3β蛋白表达的影响[0244]

[0245]

[0246] 注：与对照组比较1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较3)P<0.05，4)P<0.01[0247] 3讨论

[0248] 抑郁症是一种常见的精神疾病，具有情绪低落，快感缺失以及在严重情况下具有自杀倾向等特征。本实验小鼠腹腔注射LPS诱导抑郁动物模型，测定其抑郁相关行为变化。旷场实验显示，与正常组相比，模型组小鼠旷场中间区运动距离、旷场运动速度明显降低，旷场总运动距离有所降低；强迫游泳实验显示小鼠不动时间增加；高架十字迷宫的开臂停留时间明显减少。上述结果表明，LPS腹腔注射小鼠表现出明显的抑郁样行为，表明成功制备了小鼠的抑郁模型。氟西汀对LPS注射小鼠进行灌胃给药后，小鼠各项行为学指标得到改善。

[0249] 抑郁模型小鼠给予苦参子提取物和有效部位干预后，动物的抑郁样行为得到明显改善。旷场实验显示，与模型组相比，苦参子提取物和有效部位干预后能提高小鼠旷场中间区运动距离和运动速度。强迫游泳实验显示，苦参子提取物和有效部位组小鼠不动时间明显降低；高架十字迷宫实验显示，苦参子提取物和有效部位小鼠开臂停留时间明显增加。结果提示，苦参子提取物和有效部位具有良好的抗抑郁作用。

[0250] Wnt/β‑catenin信号通路激活核内靶基因的表达。Wnt家族分泌蛋白、Frizzled家族跨膜受体蛋白Dishevelled(Dsh)、糖原合成激酶3(GSK3)、APC、Axin、β‑连环蛋白及TCF/LEF家族转录调节因子等构成了经典通路。抑郁症的发生发展过程中伴随着Wnt/β‑catenin信号通路的异常表达。小鼠腹腔注射LPS后，模型组小鼠P‑GSK‑3β、CyclinD1蛋白表达水平显著上升，β‑catenin、Wnt1蛋白水平表达显著下降，表明LPS注射导致Wnt/β‑catenin信号通路异常，苦参子提取物组能显著降低抑郁模型组CyclinD1、P‑GSK‑3β蛋白含量，同时提高β‑catenin、Wnt1蛋白表达水平，小鼠抑郁样行为明显改善，结合蛋白表达水平趋于正常，提示苦参子提取物抗抑郁作用是通过激活Wnt/β‑catenin信号通路抑制神经炎症所实现。

[0251] 通过LPS快速启动免疫系统的激活和炎性细胞因子的释放，诱导产生一系列抑郁样的行为反应，并借助原位末端标记法检测小鼠海马神经元细胞凋亡情况，以确定苦参子提取物对LPS诱导的小鼠海马细胞损伤的保护能力。相比对照组，模型组小鼠中TNF‑α、IL‑6和IL‑1β等炎性因子的含量明显增多，同时小鼠海马细胞凋亡率显著上升，提示LPS注射诱导的免疫炎症反应导致了海马神经细胞损伤。此外，相比模型组，苦参子提取物组和氟西汀组小鼠的海马细胞凋亡率均得到显著改善。以上结果表明，苦参子提取物通过对抗LPS所致的神经细胞炎症损伤，抑制海马神经元细胞凋亡从而发挥抗抑郁作用。

[0252] 以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本发明的思想，基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本发明保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。