一种治疗急性脊髓损伤急性期的中药组合物及其使用方法

摘要

本发明公开了一种治疗急性脊髓损伤急性期的中药组合物及其使用方法，涉及中药制剂技术领域，由如下成分组成：丹参、虎杖、熊胆、牛黄。本发明综合考虑各味中药的药性，严格控制各味中药的处理方式，使用方式独特，将本发明的清热活血中药组合物(由丹参、虎杖、熊胆、牛黄组成)结合独特的使用的方式用于治疗脊髓损伤，干预治疗脊髓损伤后具有改善运动功能，促进伤口愈合，减小胶质瘢痕面积，保护损伤区的神经元，从而加速脊髓损伤后的修复，为临床治疗脊髓损伤提供基础依据。

权利要求

1.一种治疗急性脊髓损伤急性期的中药组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）原料称取：

称取相应重量的丹参10 20g、虎杖10 20g、熊胆0.3 0.7g、牛黄0.1 0.2g备用；

~ ~ ~ ~

（2）冷等离子体处理：

将步骤（1）中称取的丹参、虎杖、熊胆、牛黄分别置于冷等离子体设备中进行冷等离子体处理，冷等离子体处理时控制处理功率为80 100W，处理时间均为30 40s；

~ ~

（3）深冷粉碎处理：

将步骤（2）中冷等离子体处理后的熊胆、牛黄分别置于深冷粉碎机内进行粉碎处理，完成后得熊胆粉、牛黄粉备用，深冷粉碎处理时控制粉碎机内的温度为‑30 ‑20℃，粉碎处理~时粉碎机的转速为1000 1200rpm，粉碎处理的时间为6 10min；

~ ~

（4）浸泡处理：

取步骤（2）中冷等离子体处理后的丹参、虎杖，加入纯净水至液面高于药物1 3cm，浸泡~

1.5 2.5h，在浸泡的同时进行间歇式超声波处理；

~

（5）煎煮处理；

浸泡之后先用武火煎药至汤水沸腾，然后转为小火继续煎煮0.5 1.5h，完成后将汤药~倒至烧杯中，药渣备用；

（6）真空冷冻干燥处理：

将步骤（5）中所得药渣置于真空干燥箱内进行低温真空干燥处理，完成后取出备用；

（7）二次煎煮处理：

往干燥后的药渣中重新加入纯净水液面没过药渣1.5 2.5cm，武火再次沸腾后转小火~煎煮30 50min，导出汤药；

~

（8）过滤：

将两次煎煮的汤药充分混匀，用洁净的纱布覆盖杯口进行过滤，得药液备用；

（9）离心处理：

将所得的药液置于离心管内进行离心处理；

（10）浓缩处理：

离心后弃掉底部残留的沉渣，将离心得到的药液倒至干净的煎锅中，武火煮沸后转为小火持续沸腾浓缩；

（11）成品制备：

浓缩完成后室温静置，待温度降至65 75℃时，加入步骤（3）中所得的熊胆粉、牛黄粉，~搅拌至溶解即可。

2.根据权利要求1所述的治疗急性脊髓损伤急性期的中药组合物的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述的间歇式超声波处理具体为：在浸泡的过程中每隔4 6min进行一次超~声波处理，每次超声波处理的时间为10 12min，超声波处理的频率均为20 30kHz。

~ ~

3.根据权利要求1所述的治疗急性脊髓损伤急性期的中药组合物的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述的煎煮过程中需盖好锅盖。

4.根据权利要求1所述的治疗急性脊髓损伤急性期的中药组合物的制备方法，其特征在于，步骤（6）中所述的低温真空干燥处理时控制干燥温度为27 33℃，真空度为1 2Pa，干~ ~燥至含水率为2 5%。

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5.根据权利要求1所述的治疗急性脊髓损伤急性期的中药组合物的制备方法，其特征在于，步骤（9）中所述的离心时离心机的转速为1300 1700rpm，离心时间为4 6min。

~ ~

6.根据权利要求1所述的治疗急性脊髓损伤急性期的中药组合物的制备方法，其特征在于，步骤（10）中所述的小火处理时揭开锅盖，并且反复测量药液的体积，直至120 124mL。

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说明书

一种治疗急性脊髓损伤急性期的中药组合物及其使用方法

技术领域

[0001] 本发明属于中药制剂技术领域，具体涉及一种治疗急性脊髓损伤急性期的中药组合物及其使用方法。

背景技术

[0002] 急性脊髓损伤（acute spinal cord injury, ASCI）系脊髓遭受外力打击后导致完全或不完全性脊髓运动、感觉、括约肌功能障碍等。全球范围内，每年急性脊髓损伤的发病率约为14 40/1000000，其是人类最严重的灾难性损伤之一。ASCI不仅影响患者的工作和~生活，还对患者家庭乃至整个社会造成很大负担。因此，急性脊髓损伤的有效治疗对社会的发展非常重要。

[0003] ASCI早期处理的关键是尽可能减轻脊髓的继发性损伤，包括快速准确地诊断、早期手术减压和固定，以及维持平均动脉压85 90mmHg、改善脊髓的血液灌注和保证有效呼吸~等。此外临床还使用甲基强的松龙、神经节甙酯及神经营养因子等进行神经保护。以往的观点认为，大剂量甲基强的松龙冲击疗法对ASCI后受损脊髓功能的恢复具有促进作用。但近年来临床研究发现，该治疗方法不仅无明显的益处，反而增加了深静脉血栓、肺炎、胃肠道疾病及高血糖等并发症的发生。因此建议临床慎重应用，特别是对于老年ASCI患者。

[0004] 中医认为，对于急性脊髓损伤，外力可损伤气血经脉导致经络离断，血脉破损。血脉破损则血溢脉外、血不巡经，瘀血由此形成；血瘀和断脉可引发督脉气机运行不畅，气为血帅，血为气母，气滞则血瘀更甚，二者互为因果，在脊髓损伤后形成恶性循环，最终导致经络壅塞，气血不通，功能障碍。脊髓损伤早期属于瘀血阻滞，经络不通，治宜行气消瘀、泻下泄热、疏通督脉，中期属气虚血瘀，后期属脊髓亏虚，治当补肾益精，按照分期辩证治疗后，可取得较好的疗效。因此，急性脊髓损伤早期的治疗非常关键，早期治疗得当，可有效防治继发性脊髓损伤的扩大，加速脊髓损伤的修复。

[0005] 目前已有复方组成：黄芪、巴戟天、仙茅、丹参、赤芍、当归、鸡血藤、川芎、熟附子，通过活血、化瘀、补肾等手段治疗脊髓损伤后期的损伤，但对于急性脊髓损伤来说，损伤急性期是治疗的关键时期，目前鲜有研究。因此，亟需开发研究一种治疗急性脊髓损伤急性期的中药组合物。

发明内容

[0006] 本发明的目的是针对现有的问题，提供了一种治疗急性脊髓损伤急性期的中药组合物及其使用方法。

[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0008] 一种治疗急性脊髓损伤急性期的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：

[0009] （1）原料称取：

[0010] 称取相应重量的丹参10 20g、虎杖10 20g、熊胆0.3 0.7g、牛黄0.1 0.2g备用；~ ~ ~ ~

[0011] （2）冷等离子体处理：

[0012] 将步骤（1）中称取的丹参、虎杖、熊胆、牛黄分别置于冷等离子体设备中进行冷等离子体处理，冷等离子体处理时控制处理功率为80 100W，处理时间均为30 40s；~ ~

[0013] 通过采用上述技术方案，对中药原料进行冷等离子体处理，冷等离子体使中药材表面产生大量的自由基并且能够以活化中药材表面，提高表面火星。同时冷等离子体还会破坏部分射线细胞，扩大了水分的传递途径，从而能够促进煎煮时活性成分的溶出，进而提高中药原材料的生物利用度，提升成品的效果。

[0014] （3）深冷粉碎处理：

[0015] 将步骤（2）中冷等离子体处理后的熊胆、牛黄分别置于深冷粉碎机内进行粉碎处理，完成后得熊胆粉、牛黄粉备用，深冷粉碎处理时控制粉碎机内的温度为‑30 ‑20℃，粉碎~处理时粉碎机的转速为1000 1200rpm，粉碎处理的时间为6 10min；
~ ~

[0016] 通过采用上述技术方案，将冷等离子体处理后的熊胆、牛黄在深冷条件下进行粉碎处理，不仅不会破坏原料的活性，还能细化原料，为后续的均质溶解奠定很好的基础，能有效提高其生物利用度。

[0017] （4）浸泡处理：

[0018] 取步骤（2）中冷等离子体处理后的丹参、虎杖，加入纯净水至液面高于药物1 3cm，~浸泡1.5 2.5h，在浸泡的同时进行间歇式超声波处理；
~

[0019] 通过采用上述技术方案，在浸泡的同时进行间歇式超声波处理，主要是利用超声波的空化效应、声流效应以及热效应，提高浸泡的效果。

[0020] （5）煎煮处理；

[0021] 浸泡之后先用武火煎药至汤水沸腾，然后转为小火继续煎煮0.5 1.5h，完成后将~汤药倒至烧杯中，药渣备用；

[0022] （6）真空冷冻干燥处理：

[0023] 将步骤（5）中所得药渣置于真空干燥箱内进行低温真空干燥处理，完成后取出备用；

[0024] 通过采用上述技术方案，将煎煮之后所得的药渣投入真空干燥器内，在低温真空条件下进行干燥，药渣从外到内缓慢升温，产生一定的蒸气压，在这些蒸气压力的作用下，药渣的渗透性得到很好的提高，从而有助于煎煮过程中药渣中活性成分的浸出，进而进一步提高原料的生物利用度。

[0025] （7）二次煎煮处理：

[0026] 往干燥后的药渣中重新加入纯净水液面没过药渣1.5 2.5cm，武火再次沸腾后转~小火煎煮30 50min，导出汤药；
~

[0027] （8）过滤：

[0028] 将两次煎煮的汤药充分混匀，用洁净的纱布覆盖杯口进行过滤，得药液备用；

[0029] （9）离心处理：

[0030] 将所得的药液置于离心管内进行离心处理；

[0031] （10）浓缩处理：

[0032] 离心后弃掉底部残留的沉渣，将离心得到的药液倒至干净的煎锅中，武火煮沸后转为小火持续沸腾浓缩；

[0033] （11）成品制备：

[0034] 浓缩完成后室温静置，待温度降至65 75℃时，加入步骤（3）中所得的熊胆粉、牛黄~粉，搅拌至溶解即可。

[0035] 进一步地，步骤（4）中所述的间歇式超声波处理具体为：在浸泡的过程中每隔4~6min进行一次超声波处理，每次超声波处理的时间为10 12min，超声波处理的频率均为20~ ~
30kHz。

[0036] 进一步地，步骤（5）中所述的煎煮过程中需盖好锅盖。

[0037] 进一步地，步骤（6）中所述的低温真空干燥处理时控制干燥温度为27 33℃，真空~度为1 2Pa，干燥至含水率为2 5%。
~ ~

[0038] 进一步地，步骤（9）中所述的离心时离心机的转速为1300 1700rpm，离心时间为4~ ~6min。

[0039] 进一步地，步骤（10）中所述的小火处理时揭开锅盖，并且反复测量药液的体积，直至120 124mL。~

[0040] 本发明相比现有技术具有以下优点：

[0041] 1、本发明的中药组合物中丹参为血分之要药，入心肝肾经，与虎杖合用，能破瘀通经，活血行血，内可化脏腑之瘀滞，外可通经脉而利关节，使瘀血通而痛自除。牛黄、熊胆均味苦性寒凉，调和他药辛热之性，且起开窍解痉、通脑髓之功。

[0042] 2、本发明综合考虑各味中药的药性，严格控制各味中药的处理方式，使用方式独特，将本发明的清热活血中药组合物（由丹参、虎杖、熊胆、牛黄组成）结合独特的使用的方式用于治疗脊髓损伤，干预治疗脊髓损伤后具有改善运动功能，促进伤口愈合，减小胶质瘢痕面积，保护损伤区的神经元，从而加速脊髓损伤后的修复，为临床治疗脊髓损伤提供基础依据。

[0043] 3、本发明针对目前脊髓损伤后脊髓难以修复问题，以中医理论为指导，对急性脊髓损伤急性期采用行血活血、开窍解痉、通脑髓的治疗手段，对小鼠急性脊髓损伤后的脊髓有明显的修复作用。

附图说明

[0044] 图1为不同组的足迹分布图、BBB运动得分图、损伤后14天纵切面H&E染色图以及存活神经元尼氏染色结果图；

[0045] 图2为脊髓组织石蜡切片免疫荧光染色结果分析图。实施方式
实施例

[0046] 一种治疗急性脊髓损伤急性期的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：

[0047] （1）原料称取：

[0048] 称取相应重量的丹参10g、虎杖10g、熊胆0.3g、牛黄0.1g备用；

[0049] （2）冷等离子体处理：

[0050] 将步骤（1）中称取的丹参、虎杖、熊胆、牛黄分别置于冷等离子体设备中进行冷等离子体处理，控制处理功率为80W，处理时间均为30s；

[0051] （3）深冷粉碎处理：

[0052] 将步骤（2）中冷等离子体处理后的熊胆、牛黄分别置于深冷粉碎机内进行粉碎处理，控制粉碎机内的温度为‑30℃，粉碎处理时粉碎机的转速为1000rpm，粉碎处理6min后得熊胆粉、牛黄粉备用；

[0053] （4）浸泡处理：

[0054] 取步骤（2）中冷等离子体处理后的丹参、虎杖，加入纯净水至液面高于药物1cm，浸泡1.5h，在浸泡的同时进行间歇式超声波处理，具体为：在浸泡的过程中每隔4min进行一次超声波处理，每次超声波处理的时间为10min，超声波处理的频率均为20kHz；

[0055] （5）煎煮处理；

[0056] 浸泡之后先用武火煎药至汤水沸腾，然后转为小火继续煎煮0.5h，完成后将汤药倒至烧杯中，药渣备用；

[0057] （6）真空冷冻干燥处理：

[0058] 将步骤（5）中所得药渣置于真空干燥箱内进行低温真空干燥处理，控制干燥温度为27℃，真空度为1Pa，干燥至含水率为2%后取出备用；

[0059] （7）二次煎煮处理：

[0060] 往干燥后的药渣中重新加入纯净水液面没过药渣1.5cm，武火再次沸腾后转小火煎煮30min，导出汤药；

[0061] （8）过滤：

[0062] 将两次煎煮的汤药充分混匀，用洁净的纱布覆盖杯口进行过滤，得药液备用；

[0063] （9）离心处理：

[0064] 将所得的药液置于离心管内进行离心处理，离心机的转速为1300rpm，离心时间为4min；

[0065] （10）浓缩处理：

[0066] 离心后弃掉底部残留的沉渣，将离心得到的药液倒至干净的煎锅中，武火煮沸后转为小火持续沸腾浓缩，小火处理时揭开锅盖，并且反复测量药液的体积，直至120mL；

[0067] （11）成品制备：

[0068] 浓缩完成后室温静置，待温度降至65℃时，加入步骤（3）中所得的熊胆粉、牛黄粉，搅拌至溶解即可。实施例

[0069] 一种治疗急性脊髓损伤急性期的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：

[0070] （1）原料称取：

[0071] 称取相应重量的丹参15g、虎杖15g、熊胆0.5g、牛黄0.15g备用；

[0072] （2）冷等离子体处理：

[0073] 将步骤（1）中称取的丹参、虎杖、熊胆、牛黄分别置于冷等离子体设备中进行冷等离子体处理，控制处理功率为90W，处理时间均为35s；

[0074] （3）深冷粉碎处理：

[0075] 将步骤（2）中冷等离子体处理后的熊胆、牛黄分别置于深冷粉碎机内进行粉碎处理，控制粉碎机内的温度为‑25℃，粉碎处理时粉碎机的转速为1100rpm，粉碎处理8min后得熊胆粉、牛黄粉备用；

[0076] （4）浸泡处理：

[0077] 取步骤（2）中冷等离子体处理后的丹参、虎杖，加入纯净水至液面高于药物2cm，浸泡2h，在浸泡的同时进行间歇式超声波处理，具体为：在浸泡的过程中每隔5min进行一次超声波处理，每次超声波处理的时间为11min，超声波处理的频率均为25kHz；

[0078] （5）煎煮处理；

[0079] 浸泡之后先用武火煎药至汤水沸腾，然后转为小火继续煎煮1h，完成后将汤药倒至烧杯中，药渣备用；

[0080] （6）真空冷冻干燥处理：

[0081] 将步骤（5）中所得药渣置于真空干燥箱内进行低温真空干燥处理，控制干燥温度为30℃，真空度为1.5Pa，干燥至含水率为3.5%后取出备用；

[0082] （7）二次煎煮处理：

[0083] 往干燥后的药渣中重新加入纯净水液面没过药渣2cm，武火再次沸腾后转小火煎煮40min，导出汤药；

[0084] （8）过滤：

[0085] 将两次煎煮的汤药充分混匀，用洁净的纱布覆盖杯口进行过滤，得药液备用；

[0086] （9）离心处理：

[0087] 将所得的药液置于离心管内进行离心处理，离心机的转速为1500rpm，离心时间为5min；

[0088] （10）浓缩处理：

[0089] 离心后弃掉底部残留的沉渣，将离心得到的药液倒至干净的煎锅中，武火煮沸后转为小火持续沸腾浓缩，小火处理时揭开锅盖，并且反复测量药液的体积，直至122mL；

[0090] （11）成品制备：

[0091] 浓缩完成后室温静置，待温度降至70℃时，加入步骤（3）中所得的熊胆粉、牛黄粉，搅拌至溶解即可。实施例

[0092] 一种治疗急性脊髓损伤急性期的中药组合物的制备方法，包括如下步骤：

[0093] （1）原料称取：

[0094] 称取相应重量的丹参20g、虎杖20g、熊胆0.7g、牛黄0.2g备用；

[0095] （2）冷等离子体处理：

[0096] 将步骤（1）中称取的丹参、虎杖、熊胆、牛黄分别置于冷等离子体设备中进行冷等离子体处理，控制处理功率为100W，处理时间均为40s；

[0097] （3）深冷粉碎处理：

[0098] 将步骤（2）中冷等离子体处理后的熊胆、牛黄分别置于深冷粉碎机内进行粉碎处理，控制粉碎机内的温度为‑20℃，粉碎处理时粉碎机的转速为1200rpm，粉碎处理10min后得熊胆粉、牛黄粉备用；

[0099] （4）浸泡处理：

[0100] 取步骤（2）中冷等离子体处理后的丹参、虎杖，加入纯净水至液面高于药物3cm，浸泡2.5h，在浸泡的同时进行间歇式超声波处理，具体为：在浸泡的过程中每隔6min进行一次超声波处理，每次超声波处理的时间为12min，超声波处理的频率均为30kHz；

[0101] （5）煎煮处理；

[0102] 浸泡之后先用武火煎药至汤水沸腾，然后转为小火继续煎煮1.5h，完成后将汤药倒至烧杯中，药渣备用；

[0103] （6）真空冷冻干燥处理：

[0104] 将步骤（5）中所得药渣置于真空干燥箱内进行低温真空干燥处理，控制干燥温度为33℃，真空度为2Pa，干燥至含水率为5%后取出备用；

[0105] （7）二次煎煮处理：

[0106] 往干燥后的药渣中重新加入纯净水液面没过药渣2.5cm，武火再次沸腾后转小火煎煮50min，导出汤药；

[0107] （8）过滤：

[0108] 将两次煎煮的汤药充分混匀，用洁净的纱布覆盖杯口进行过滤，得药液备用；

[0109] （9）离心处理：

[0110] 将所得的药液置于离心管内进行离心处理，离心机的转速为1700rpm，离心时间为6min；

[0111] （10）浓缩处理：

[0112] 离心后弃掉底部残留的沉渣，将离心得到的药液倒至干净的煎锅中，武火煮沸后转为小火持续沸腾浓缩，小火处理时揭开锅盖，并且反复测量药液的体积，直至124mL；

[0113] （11）成品制备：

[0114] 浓缩完成后室温静置，待温度降至75℃时，加入步骤（3）中所得的熊胆粉、牛黄粉，搅拌至溶解即可。

[0115] 为了验证本申请的技术效果，对实施例2的中药组合物进行实验验证。具体为：

[0116] 1. Allen’s损伤模型的建立

[0117] 选择8周龄雄性C57BL/6小鼠60只，实验室饲养一周后，测其体重。将实验小鼠随机分为3组，每组20只，分别为sham组（假手术对照组）、SCI组（无干预组）、中药组（中药组合物干预组）。将小鼠称重后按照50mg/kg的标准，腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉；待小鼠肌肉松弛、角膜反应迟纯、皮肤捏夹反应消失后，将小鼠俯卧置于手术台上，分别固定头和四肢，剔除手术区周围毛发，以棘突高点及肋骨为标志定位T10棘突并作标记，碘伏消毒手术区域，上铺无菌手术单；以T10为中心，沿后正中线纵向切开小鼠背部皮肤及皮下组织，切口大小约1.5cm。紧贴骨面钝性分离竖棘肌并向两侧牵开，纱布止血，暴露T9‑T11椎板；使用椎板钳仔细咬除T9‑T11的棘突及椎板，充分显露T10段脊髓，操作过程注意避免挤压脊髓及破坏硬脊膜；使用PinPoint™精密脊髓损伤撞击器（型号：PCI3000‑2），设置相关参数后打击T10段脊髓。

[0118] 其中，SCI组建立成功的标志为小鼠身体发生一过性颤抖，双下肢迅速回缩并挥动，尾巴来回摆动。脊髓表面覆盖一层自体脂肪以减少粘连，检查无出血后逐层缝合肌肉、皮下组织及皮肤，75%乙醇消毒皮肤；sham组在暴露脊髓后不进行打击，其余步骤同上。SCI组术后常规抗感染治疗，以防术区、泌尿系感染等；术后排便困难则行膀胱按摩以助排便。小鼠分组及给药方法见表1所示。

[0119] 表1

[0120] 组别 数量（只） 用法用量Sham 10 仅暴露脊髓，不打击。每只每天灌胃0.4mL生理盐水
SCI 15 暴露脊髓后打击仪打击。每只每天灌胃0.4mL生理盐水
中药组方（实施例2）15 暴露脊髓后打击仪打击。每只每天灌胃0.4mL中药的汤剂[0121] 3．评估方法：

[0122] A．H&E染色

[0123] 用4%多聚甲醛溶液固定。标本经脱水、石蜡包埋后以损伤区为中心连续切片厚5um做H&E染色。H&E染色步骤：二甲苯脱蜡10min×2次，无水乙醇5min×2次，95%乙醇5min，95%乙醇5min，80%乙醇5min，70%乙醇5min，苏木素5 10min，盐酸酒精2 5s，流水冲洗30min，70%~ ~乙酸5min，80%乙酸5min，伊红复染5 10min，95%乙酸5min×2次，二甲苯透明5min×3次。H&E~
染色后观察损伤区及其临近部位的切片，光镜下观察并拍照。

[0124] B．BBB评分

[0125] 小鼠SCI后1天、3天、1周及之后的每周分别进行一次BBB评分，直至第4周，以评价小鼠后肢运动功能恢复情况。评估方法：将小鼠放置于一宽敞的场地中，自由活动4 min。两名观察者按照BBB评分标准评分，各自观察小鼠的髋、膝、踝关节，以及四肢、躯干运动及其协调情况并进行评分，取平均值。统计学分析：每周每组的BBB分值，行均值T检验，p<0.05。

[0126] C．足迹测试

[0127] 术后14天，对小鼠进行足迹印记实验。将普通墨水涂抹在小鼠后爪上，使其通过一个长1m、宽10cm的足迹实验通道，在通道白纸上留下其足迹。

[0128] D．尼氏染色

[0129] （1）将已烘干的石蜡切片，常规脱蜡至水（二甲苯I、二甲苯II各15min，然后梯度酒精脱水：100%I、100%II、95%、90%、80%、70%、50%各5min），蒸馏水冲洗2min；

[0130] （2）织切片入0.5%甲苯胺蓝染液中2 5min，水洗，0.1%的冰醋酸稍分化，自来水洗~终止反应，显微镜下控制分化程度，自来水洗后，将切片置于烤箱烤干。

[0131] （3）透明封片：切片入干净的二甲苯透明10min，中性树胶封片；

[0132] （4）显微镜观察损伤区及临近部位，光镜下观察并拍照。

[0133] 图1中A图为不同组的足迹分析图，B图为不同组的BBB运动得分图，中药组合物干预可以促进小鼠后肢功能的恢复，C图为损伤后14天纵切面H&E染色图，模型组与假手术组比较，脊髓损伤后第14天损伤部位出现明显的畸形和空洞，而在给药组中病变面积明显减少且组织损伤较小，D图为对各组中存活神经元进行尼氏染色，给药组的损伤区神经元数量明显增加，说明本发明所述中药组合物干预可以减轻组织损伤，保护损伤区神经元，促进小鼠运动功能恢复。

[0134] E. 脊髓组织石蜡切片免疫荧光染色

[0135] （1）在49℃的烤箱中加热玻片20min（确保玻片干燥后再进行下一步）；

[0136] （2）常规脱蜡至水，二甲苯脱蜡5min×3次，用乙醇逐渐水合物（100%、95%、80%、70%、自来水）（确保二甲苯中无液滴）；

[0137] （3）PBS洗片5min×3次；

[0138] （4）用沸水柠檬酸缓冲液（pH6.0）在微波炉中进行抗原修复20min（3.82g柠檬酸+2.412g柠檬酸钠+1L水，10N NaOH调节pH至6.0）；

[0139] （5）慢慢冷却到室温；

[0140] （6）用PBSx3洗涤，每次5min；

[0141] （7）用pap笔圈出组织部分；

[0142] （8）含有10%血清1% triton X‑100封闭液室温下封闭1h（20 30℃）；~

[0143] （9）用封闭液稀释两种不同种属来源的一抗，4℃孵育过夜；

[0144] （10）PBS洗片5min×3次；

[0145] （11）Alexa Fluo 555（1:300）、Alexa Fluo 488（1:100）连接的二抗在常温下（20~30℃）孵育1h；

[0146] （12）PBS 5min x3次；

[0147] （13）采用含有DAPI的封片液进行封片。封片液:PBS和甘油（4:1）（包含1.5μg/ml DAPI）；

[0148] （14）荧光显微镜下观察。

[0149] 采用免疫荧光检测法研究了损伤脊髓的胶质瘢痕面积，GFAP是星形胶质细胞的标志，从图2中的A图可以看出，模型组14天后，由星形胶质细胞构成的胶质瘢痕和胶质瘢痕包围的纤维瘢痕较大，而给药组由星形胶质包围的纤维部分瘢痕面积明显缩小。