本发明公开了一种玄柏爽声复方提取物及其制备方法和应用。该玄柏爽声复方提取物的制备方法如下：(1)将玄柏复方组合物加水煎煮，合并煎液；以重量份计，玄柏复方组合物包括以下组分：玄参2‑6份、山豆根1‑3份、紫菀1‑3份、黄柏1‑3份、桔梗1‑3份、蝉蜕1‑3份和甘草1‑3份；(2)将煎液沉淀，取上清液；沉淀的条件为：(a)在0‑8℃下沉淀3‑6h，或(b)在15‑29℃下沉淀4‑8h；(3)将上清液浓缩至相对密度为1.02‑1.10。本发明所制备的玄柏爽声复方提取物的毒性物质含量得到有效降低，而其他有效成分仍然保持在有效剂量范围内，且临床疗效和安全性高。
1.一种玄柏爽声复方提取物的制备方法，其特征在于，其包括下述步骤：(1)将玄柏复方组合物加水煎煮，合并煎液；其中，以重量份计，所述玄柏复方组合物包括以下组分：玄参2‑6份、山豆根1‑3份、紫菀1‑3份、黄柏1‑3份、桔梗1‑3份、蝉蜕1‑3份和甘草1‑3份；
(2)将所述煎液沉淀，取上清液；其中，所述沉淀的条件为：(a)在0‑8℃下沉淀3‑6h，或(b)在15‑29℃下沉淀4‑8h；
(3)将所述上清液浓缩至相对密度为1.02‑1.10，即可。
2.如权利要求1所述的玄柏爽声复方提取物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，以重量份计，所述玄柏复方组合物包括以下组分：玄参3份、山豆根1份、紫菀2份、黄柏2份、桔梗2份、蝉蜕2份和甘草2份；
和/或，步骤(1)中，所述煎煮的过程中，第一次煎煮加水量为8‑12倍；
和/或，步骤(1)中，所述煎煮的过程中，第二次煎煮加水量为6‑8倍；
和/或，步骤(1)中，所述煎煮的时间为加热至沸腾，自沸腾时开始计时，每次保持微沸
3.如权利要求2所述的玄柏爽声复方提取物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述煎煮的过程中，第一次煎煮加水量为8倍或10倍；
和/或，步骤(1)中，所述煎煮的过程中，第二次煎煮加水量为6倍或8倍；
和/或，步骤(1)中，所述煎煮的时间为加热至沸腾，自沸腾时开始计时，每次保持微沸1小时或1.5小时。
4.如权利要求1所述的玄柏爽声复方提取物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述沉淀的条件为(a)时，所述沉淀的温度为4℃；
和/或，步骤(2)中，所述沉淀的条件为(a)时，所述沉淀的时间为4h或6h；
和/或，步骤(2)中，所述沉淀的条件为(b)时，所述沉淀的温度为15‑25℃；
和/或，步骤(2)中，所述沉淀的条件为(b)时，所述沉淀的时间为6h。
5.如权利要求4所述的玄柏爽声复方提取物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述沉淀的条件为在4℃下沉淀4h。
6.如权利要求4所述的玄柏爽声复方提取物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述沉淀的条件为(b)时，所述沉淀的温度为25℃。
7.如权利要求4所述的玄柏爽声复方提取物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述沉淀的条件为在25℃下沉淀6h。
8.如权利要求1所述的玄柏爽声复方提取物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述相对密度为1.02‑1.075。
9.如权利要求8所述的玄柏爽声复方提取物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述相对密度为1.03‑1.07。
10.如权利要求9所述的玄柏爽声复方提取物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述相对密度为1.05。
11.一种玄柏爽声复方提取物，其特征在于，其由权利要求1‑10中任一项所述的玄柏爽声复方提取物的制备方法制备得到。
12.一种玄柏爽声复方提取物，其特征在于，每克所述玄柏爽声复方提取物含有如下成分：金雀花碱不超过40μg，氧化苦参碱不超过45μg，苦参碱100‑230μg；药根碱不低于25μg；
哈巴苷不低于4.0mg，哈巴俄苷不低于600μg，黄柏碱不低于1.20mg，小檗碱不低于1.00mg，安格洛苷C不低于1.50mg，桔梗皂苷D不低于500μg，新绿原酸不低于300μg。
13.如权利要求12所述的玄柏爽声复方提取物，其特征在于，所述玄柏爽声复方提取物不检出紫菀酮；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物还含有阿魏酸200‑300μg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物还含有芦丁20‑80μg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物还含有甘草苷1.8‑3.1mg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物还含有麦角甾苷190‑270μg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物还含有肉桂酸170‑225μg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物还含有甘草酸铵2.4‑4.2mg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述金雀花碱的含量为15‑40μg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述氧化苦参碱的含量为15‑45μg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述苦参碱的含量为120‑220μg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述药根碱的含量为25‑55μg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述哈巴苷的含量为4.0‑6.0mg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述哈巴俄苷的含量为600‑1000μg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述黄柏碱的含量为1.2‑2.0mg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述小檗碱的含量为1.0‑2.1mg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述安格洛苷C的含量为1.5‑2.0mg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述桔梗皂苷D的含量为500‑1100μg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述新绿原酸的含量为300‑600μg；
或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱27.92μg；氧化苦参碱
34.87μg；苦参碱156.05μg；哈巴苷5377.62μg；哈巴俄苷973.22μg；黄柏碱1682.39μg；小檗碱1472.55μg；安格洛苷C 1959.71μg；桔梗皂苷D931.66μg；阿魏酸269.76μg；芦丁66.84μg；
甘草苷2951.12μg；麦角甾苷260.50μg；药根碱34.29μg；肉桂酸197.14μg；甘草酸铵3789.94μg；新绿原酸373.05μg；
或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱23.59μg；氧化苦参碱
28.56μg；苦参碱219.71μg；哈巴苷5188.44μg；哈巴俄苷912.43μg；黄柏碱1695.36μg；小檗碱1484.36μg；安格洛苷C1857.67μg；桔梗皂苷D677.77μg；阿魏酸274.50μg；芦丁68.33μg；
甘草苷2756.33μg；麦角甾苷238.24μg；药根碱32.42μg；肉桂酸182.95μg；甘草酸铵3607.68μg；新绿原酸375.11μg；
或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱23.65μg；氧化苦参碱
32.16μg；苦参碱150.99μg；哈巴苷4780.09μg；哈巴俄苷844.74μg；黄柏碱1725.56μg；小檗碱1300.40μg；安格洛苷C1705.04μg；桔梗皂苷D778.51μg；阿魏酸262.29μg；芦丁74.48μg；
甘草苷2765.78μg；麦角甾苷248.78μg；药根碱27.69μg；肉桂酸185.42μg；甘草酸铵3545.43μg；新绿原酸381.75μg；
或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱34.28μg；氧化苦参碱
32.97μg；苦参碱167.05μg；哈巴苷4325.87μg；哈巴俄苷850.05μg；黄柏碱1467.04μg；小檗碱1405.41μg；安格洛苷C1757.68μg；桔梗皂苷D748.22μg；阿魏酸220.87μg；芦丁61.30μg；
甘草苷2907.06μg；麦角甾苷244.58μg；药根碱38.63μg；肉桂酸204.15μg；甘草酸铵3915.31μg；新绿原酸325.33μg；
或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱33.75μg；氧化苦参碱
30.34μg；苦参碱151.18μg；哈巴苷4233.93μg；哈巴俄苷808.7μg；黄柏碱1596.5μg；小檗碱
1575.21μg；安格洛苷C1781.47μg；桔梗皂苷D551.41μg；阿魏酸219.48μg；芦丁66.52μg；甘草苷3099.46μg；麦角甾苷252.86μg；药根碱44.71μg；肉桂酸201.96μg；甘草酸铵4055.19μg；新绿原酸348.01μg；
或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱29.25μg；氧化苦参碱
21.24μg；苦参碱140.92μg；哈巴苷4504.20μg；哈巴俄苷700.00μg；黄柏碱1713.07μg；小檗碱1749.44μg；安格洛苷C1683.16μg；桔梗皂苷D670.86μg；阿魏酸210.56μg；芦丁61.82μg；
甘草苷2980.42μg；麦角甾苷218.29μg；药根碱41.14μg；肉桂酸186.78μg；甘草酸铵4173.03μg；新绿原酸332.78μg；
或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱22.19μg；氧化苦参碱
34.73μg；苦参碱140.18μg；哈巴苷4717.69μg；哈巴俄苷831.96μg；黄柏碱1686.19μg；小檗碱1575.35μg；安格洛苷C1723.70μg；桔梗皂苷D868.39μg；阿魏酸253.26μg；芦丁66.10μg；
甘草苷3013.95μg；麦角甾苷262.55μg；药根碱37.70μg；肉桂酸180.77μg；甘草酸铵3972.06μg；新绿原酸547.38μg；
或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱24.24μg；氧化苦参碱
30.81μg；苦参碱126.16μg；哈巴苷4650.29μg；哈巴俄苷701.03μg；黄柏碱1477.63μg；小檗碱1489.03μg；安格洛苷C1710.62μg；桔梗皂苷D731.58μg；阿魏酸212.48μg；芦丁68.19μg；
甘草苷2822.86μg；麦角甾苷259.21μg；药根碱38.09μg；肉桂酸176.55μg；甘草酸铵3947.33μg；新绿原酸341.90μg；
或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱29.06μg；氧化苦参碱
38.26μg；苦参碱152.05μg；哈巴苷5487.71μg；哈巴俄苷801.42μg；黄柏碱1551.14μg；小檗碱1426.97μg；安格洛苷C1895.76μg；桔梗皂苷D861.55μg；阿魏酸215.41μg；芦丁65.53μg；
甘草苷2861.09μg；麦角甾苷249.71μg；药根碱30.35μg；肉桂酸187.93μg；甘草酸铵4070.99μg；新绿原酸333.42μg；
或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱28.49μg；氧化苦参碱
25.57μg；苦参碱177.65μg；哈巴苷4732.57μg；哈巴俄苷748.17μg；黄柏碱1521.09μg；小檗碱1561.50μg；安格洛苷C1758.79μg；桔梗皂苷D671.17μg；阿魏酸220.79μg；芦丁66.58μg；
甘草苷2733.44μg；麦角甾苷214.73μg；药根碱40.65μg；肉桂酸191.02μg；甘草酸铵3851.00μg；新绿原酸346.20μg；
或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱30.77μg；氧化苦参碱
30.87μg；苦参碱205.20μg；哈巴苷5241.03μg；哈巴俄苷870.72μg；黄柏碱1692.75μg；小檗碱1705.13μg；安格洛苷C1920.67μg；桔梗皂苷D552.33μg；阿魏酸206.18μg；芦丁57.16μg；
甘草苷2126.39μg；麦角甾苷269.19μg；药根碱48.42μg；肉桂酸222.97μg；甘草酸铵3401.46μg；新绿原酸407.93μg；
或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱26.56μg；氧化苦参碱
32.80μg；苦参碱199.51μg；哈巴苷5126.94μg；哈巴俄苷795.86μg；黄柏碱1707.51μg；小檗碱1429.35μg；安格洛苷C1783.40μg；桔梗皂苷D771.12μg；阿魏酸224.34μg；芦丁26.27μg；
甘草苷2092.17μg；麦角甾苷268.96μg；药根碱42.97μg；肉桂酸179.66μg；甘草酸铵3387.61μg；新绿原酸394.89μg；
或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱30.80μg；氧化苦参碱
32.08μg；苦参碱129.56μg；哈巴苷4905.34μg；哈巴俄苷785.86μg；黄柏碱1203.23μg；小檗碱1150.95μg；安格洛苷C1744.78μg；桔梗皂苷D581.39μg；阿魏酸204.36μg；芦丁43.23μg；
甘草苷2048.81μg；麦角甾苷239.85μg；药根碱39.84μg；肉桂酸184.55μg；甘草酸铵2671.26μg；新绿原酸391.11μg；
或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱20.90μg；氧化苦参碱
36.54μg；苦参碱183.93μg；哈巴苷5055.56μg；哈巴俄苷620.78μg；黄柏碱1799.34μg；小檗碱1935.79μg；安格洛苷C1653.60μg；桔梗皂苷D902.85μg；阿魏酸260.95μg；芦丁72.56μg；
甘草苷1941.94μg；麦角甾苷207.09μg；药根碱40.05μg；肉桂酸172.01μg；甘草酸铵2699.21μg；新绿原酸327.71μg；
或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱22.94μg；氧化苦参碱
34.76μg；苦参碱140.21μg；哈巴苷4506.88μg；哈巴俄苷756.44μg；黄柏碱1789.45μg；小檗碱1613.28μg；安格洛苷C1735.15μg；桔梗皂苷D1016.04μg；阿魏酸278.75μg；芦丁61.68μg；
甘草苷1869.63μg；麦角甾苷197.53μg；药根碱31.33μg；肉桂酸177.23μg；甘草酸铵2474.54μg；新绿原酸369.19μg。
14.如权利要求13所述的玄柏爽声复方提取物，其特征在于，每克所述玄柏爽声复方提取物还含有阿魏酸200‑280μg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物还含有芦丁25‑75μg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述金雀花碱的含量为20‑35μg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述氧化苦参碱的含量为21‑39μg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述苦参碱的含量为125‑220μg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述药根碱的含量为27‑49μg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述哈巴苷的含量为4.2‑5.5mg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述哈巴俄苷的含量为615‑975μg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述黄柏碱的含量为1.2‑1.8mg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述小檗碱的含量为1.1‑2.0mg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述安格洛苷C的含量为1.6‑2.0mg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述桔梗皂苷D的含量为550‑1050μg；
和/或，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述新绿原酸的含量为320‑550μg。
15.一种玄柏复方制剂，其特征在于，其包括如权利要求11‑14中任一项所述的玄柏爽声复方提取物。
16.如权利要求15所述的玄柏复方制剂，其特征在于，所述玄柏复方制剂的剂型为散剂、丸剂、胶囊剂、片剂或口服液。
17.一种如权利要求11‑14中任一项所述的玄柏爽声复方提取物或权利要求15或16所述的玄柏复方制剂在制备治疗急慢性咽喉炎的药物中的应用。
一种玄柏爽声复方提取物及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种玄柏爽声复方提取物及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 急慢性咽喉炎，中医称为“喉瘖”多因风热、风寒侵袭、肺失清肃、湿热雍阻、痰气互结、客于声门，或咽喉部手术之后脉络失损，气血瘀滞，是喉粘膜的非特异性炎症，表现为声音嘶哑、甚至失音，伴咽喉灼热疼痛，检查见声带红肿、肥厚或息肉小结形成、白斑等，是耳鼻喉科的常见病和多发病，较难治疗，多见于教师、歌唱家等用嗓过度的职业。
[0003] 该病西医常采用局部雾化吸入抗炎治疗，即庆大霉素加地塞米松，或者口服抗生素左氧氟沙星片或阿莫西林胶囊进行治疗，一般在发病初期有效，且不良反应多。中医药治疗喉瘖独特的优势在于强调整体调节，辨证论治，其特点是毒副作用小，能有效改善病人的症状体征，提高生活质量及减少复发率，尤其在术后调理方面发挥着重要作用。因此，国内常常采用中西医结合的方式，对于严重小结、白斑先进行手术，再配合中成药治疗；而对于发病早期的小结、白斑、急慢性喉炎常采用直接服用中成药的方法。
[0004] 喉瘖在现代医学中的病因尚不明确，致病原因有病毒感染，粉尘、高温、烟酒等理化因素，用声过度、发声不当等不良生活习惯，局部炎症等，病理基础主要是喉粘膜慢性充血和血管扩张、淋巴细胞浸润，间质性水肿及炎性渗出，与变态反应、免疫系统等相关。喉瘖重在预防，改善机内内环境平衡，提高免疫力，防止复发，这也是中医药的优势所在。
[0005] 玄柏爽声颗粒方由玄参、山豆根、紫菀、黄柏、桔梗、蝉蜕、甘草组成，功能清热润燥、消肿止痛、开音利咽。复旦大学附属眼耳鼻喉科医院应用“玄柏爽声颗粒”治疗喉瘖临床应用已有四十余年，疗效明确，临床基础广泛。方剂中君药玄参滋阴降火，解毒利咽，能“消咽喉之肿，泻无根之火”，为喉科之常用妙药，虚实均可用之，实证用之可防热毒伤阴，虚证用之可滋阴降火，对咽喉、声带红肿尤为有效；臣药山豆根清火解毒、消肿止痛，利咽喉，使红肿消而疼痛止；佐者紫菀润肺化痰，辛而不燥，润而不寒，补而不滞；蝉蜕疏风清热，宣肺开音；黄柏泻热利湿，导热从下而行；桔梗宣肺化痰利咽消肿；以甘草甘缓利咽，又调和诸药，为使。因此，具有清热润燥、消肿止痛、化痰散结、开音利咽的功能，是治疗喉瘖的良药。该中成药具有多组分、多靶点、多重作用机制的特点，同时能够兼顾并发症，对患者的治疗是整体的、综合的，可用于咽喉炎的防治。
[0006] 【玄柏复方各味药材药学研究概况】
[0007] 玄参是方中君药，植物基源为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根。味甘、苦、咸，性微寒，归肺、胃、肾经。具有清热凉血、滋阴降火、解毒散结的功效。用于热入营血、温毒发斑、热病伤阴、舌绛烦渴、津伤便秘、骨蒸劳嗽、目赤、咽痛、白喉、瘰疬和痈肿疮毒。化学成分主要有环烯醚萜、倍半萜、三萜、苯丙素、黄酮、甾醇、脂肪酸、糖类等类型，其中环烯醚萜类和简单苯丙素类为其主要活性成分。代表性成分包括哈巴苷、哈巴俄苷、安格洛苷C、毛蕊花糖苷以及肉桂酸，其中哈巴苷和哈巴俄苷为药典含量测定成分。
[0008] 山豆根是方中臣药，植物基源为豆科植物越南槐Sophora tonkinensis Gagnep.的干燥根及根茎。味苦，性寒，有毒，归肺、胃经，具有清热解毒、消肿利咽的功效。用于火毒蕴结、肺热咳嗽、乳蛾喉痹、咽喉肿痛、齿龈肿痛、口舌生疮和湿热黄疸等症，为治疗咽喉疼痛要药。主要含有生物碱、黄酮、三萜类、酚酸类、多糖类等多种化合物。其中生物碱成分为其抗炎主要活性成分，包括苦参碱和氧化苦参碱，二者同时为药典定量成分。有报道其毒性成分亦来源于其生物碱，其中金雀花碱被认为与神经系统、消化系统及呼吸系统的毒性相关，氧化苦参碱和苦参碱既是有效成分又与毒性相关。
[0009] 黄柏(川)是方中佐药，植物基源为芸香料黄檗属植物黄树皮phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮。味苦，性寒，归肾和膀胱经，具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮的功效，适用于带下阴痒、湿热泻痢、热淋涩痛和黄疸尿赤等疾病的治疗。其中生物碱类是其抗炎抗氧化的活性成分，药根碱、盐酸黄柏碱和盐酸小檗碱为其代表活性成分，其中盐酸黄柏碱和盐酸小檗碱为药典规定的含量测定成分。
[0010] 桔梗是方中使药，植物基源为桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.的干燥根，始载于《神农本草经》，味苦、辛，性平，归肺经，具有宣肺、利咽、祛痰和排脓的功效。主治咳嗽痰多、胸闷不畅、咽痛音哑和肺痈吐脓。皂苷类成分为主要活性成分，其中桔梗皂苷D为其代表，也是药典规定含量测定的有效成分。
[0011] 甘草同为方中使药，植物基源为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch，胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根及根茎。味甘，性平，归心、肺、脾、胃经，具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛及调和诸药的作用。现代药理学研究表明具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、调血脂、抗动脉粥样硬化等多种作用，3种品种的甘草化学成分种类多样，主要的化学成分有三萜类、黄酮类、多糖类、香豆素类、生物碱类、挥发油类和微量元素等化合物。药典规定甘草苷和甘草酸为含量测定指标成分。
[0012] 紫菀为方中使药，是菊科多年生草本植物紫菀Aster tataricus L.f.的干燥根及根茎，味辛、苦，性温，具有润肺下气，消痰止咳的作用，常用于新久咳嗽、痰多喘咳、痰中带血等。紫菀化学成分丰富，包括萜类及其苷、肽类、黄酮、蒽醌、香豆素、有机酸、酚类、甾醇、挥发油及苯丙素类等等。紫菀酮为其黄酮类活性成分也是药典规定含量测定成分。新绿原酸是紫菀配方颗粒部颁标准中测定的成分。
[0013] 蝉蜕为方中使药，为蝉科昆虫黑蚱Cryptotympana pustulata Fabricius的若虫羽化时脱落的皮壳，味甘、性寒，具有散风解热、清肺利咽、解表透疹、解毒消炎、清肝明目，安神定志、止咳平喘、息风止痉、明目退翳之功效，临床上常用于治疗风热感冒，咳嗽音哑，咽喉肿痛，小儿惊痫，惊风抽搐，风疹瘙痒，痘疹疔疮，破伤风等病症。对其成分研究较少，2015版药典中以性状鉴别为主。
[0014] 然而，玄柏复方颗粒剂中山豆根临床报道不良反应较多，累及神经系统、消化系统、呼吸系统，同时也可能对心血管系统产生不良影响，且呼吸抑制是其直接致死原因。其毒性主要与金雀花碱、苦参碱及氧化苦参碱相关。因此，降低玄柏复方颗粒剂中毒性物质(金雀花碱、苦参碱、氧化苦参碱)的含量并保留有效成分，提高临床疗效和安全性是当前研究的一大难点。
发明内容
[0015] 本发明所解决的技术问题在于克服现有技术中存在的玄柏复方颗粒剂中山豆根临床报道不良反应较多，累及神经系统、消化系统、呼吸系统，同时也可能对心血管系统产生不良影响的缺陷，而提供了一种玄柏爽声复方提取物及其制备方法和应用。采用本发明的制备方法得到的玄柏爽声复方提取物的毒性物质含量得到有效降低，可有效降低金雀花碱、氧化苦参碱的含量，并使苦参碱保留在一定范围内，而其他有效成分仍然保持在有效剂量范围内，且临床疗效和安全性高。
[0016] 本发明提供了一种玄柏爽声复方提取物的制备方法，其包括下述步骤：
[0017] (1)将玄柏复方组合物加水煎煮，合并煎液；其中，以重量份计，所述玄柏复方组合物包括以下组分：玄参2‑6份、山豆根1‑3份、紫菀1‑3份、黄柏1‑3份、桔梗1‑3份、蝉蜕1‑3份和甘草1‑3份；
[0018] (2)将所述煎液沉淀，取上清液；其中，所述沉淀的条件为：(a)在0‑8℃下沉淀3‑6h，或(b)在15‑29℃下沉淀4‑8h；
[0019] (3)将所述上清液浓缩至相对密度为1.02‑1.10。
[0020] 步骤(1)中，以重量份计，所述玄柏复方组合物较佳地包括以下组分：玄参3份、山豆根1份、紫菀2份、黄柏2份、桔梗2份、蝉蜕2份和甘草2份。
[0021] 步骤(1)中，所述水可为本领域常规，例如蒸馏水。
[0022] 步骤(1)中，所述煎煮的次数可为本领域常规，较佳地为两次。
[0023] 步骤(1)中，所述煎煮的过程中，第一次煎煮加水量可为8‑12倍，例如8倍或10倍。
[0024] 步骤(1)中，所述煎煮的过程中，第二次煎煮加水量可为6‑8倍，例如6倍或8倍。
[0025] 步骤(1)中，所述煎煮的时间可为本领域常规，一般为加热至沸腾，自沸腾时开始计时，每次保持微沸1‑1.5小时，例如1小时或1.5小时。
[0026] 步骤(1)中，所述煎煮之后一般还需过80目筛。
[0027] 步骤(2)中，所述沉淀的条件为(a)时，所述沉淀的温度较佳地为4℃。
[0028] 步骤(2)中，所述沉淀的条件为(a)时，所述沉淀的时间可为4h或6h。
[0029] 在一优选的实施方案中，所述沉淀的条件为在4℃下沉淀4h。
[0030] 步骤(2)中，所述沉淀的条件为(b)时，所述沉淀的温度可为15‑25℃，例如25℃。
[0031] 步骤(2)中，所述沉淀的条件为(b)时，所述沉淀的时间较佳地为6h。
[0032] 在一优选的实施方案中，所述沉淀的条件为在25℃下沉淀6h。
[0033] 步骤(3)中，所述浓缩的压力可为本领域常规，较佳地为常压浓缩。所述常压一般指一个大气压。
[0034] 步骤(3)中，所述相对密度是在70℃下测试。
[0035] 步骤(3)中，所述相对密度可为1.02‑1.075，较佳地为1.03‑1.07，例如1.05。
[0036] 本发明中，较佳地，所述制备方法还包括以下步骤：
[0037] (4)将步骤(3)得到的浓缩液进行干燥。
[0038] 步骤(4)中，所述干燥的操作较佳地包括：将所述浓缩液和辅料的混合物进行喷雾干燥。
[0039] 其中，所述辅料的种类可为本领域常规，较佳地为糊精。
[0040] 其中，所述喷雾干燥的温度可为本领域常规，较佳地为110‑120℃。
[0041] 本发明还提供了一种如上所述的制备方法制备的玄柏爽声复方提取物。
[0042] 本发明还提供了一种玄柏爽声复方提取物，每克所述玄柏爽声复方提取物含有如下成分：金雀花碱不超过40μg，氧化苦参碱不超过45μg，苦参碱100‑230μg；药根碱不低于25μg；哈巴苷不低于4.0mg，哈巴俄苷不低于600μg，黄柏碱不低于1.20mg，小檗碱不低于1.00mg，安格洛苷C不低于1.50mg，桔梗皂苷D不低于500μg，新绿原酸不低于300μg。
[0043] 本发明中，所述玄柏爽声复方提取物较佳地不检出紫菀酮。在所述玄柏爽声复方提取物测定过程中，紫菀酮所对应的峰的峰面积积分无法达到定量限要求，因此确定玄柏爽声复方提取物中不检出紫菀酮。
[0044] 本发明中，每克所述玄柏爽声复方提取物较佳地还含有阿魏酸200‑300μg，较佳地为200‑280μg。
[0045] 本发明中，每克所述玄柏爽声复方提取物较佳地还含有芦丁20‑80μg，较佳地为25‑75μg。
[0046] 本发明中，每克所述玄柏爽声复方提取物较佳地还含有甘草苷1.8‑3.1mg。
[0047] 本发明中，每克所述玄柏爽声复方提取物较佳地还含有麦角甾苷190‑270μg。
[0048] 本发明中，每克所述玄柏爽声复方提取物较佳地还含有肉桂酸170‑225μg。
[0049] 本发明中，每克所述玄柏爽声复方提取物较佳地还含有甘草酸铵2.4‑4.2mg。
[0050] 本发明中，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述金雀花碱的含量可为15‑40μg，较佳地为20‑35μg。
[0051] 本发明中，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述氧化苦参碱的含量可为15‑45μg，较佳地为21‑39μg。
[0052] 本发明中，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述苦参碱的含量可为120‑220μg，较佳地为125‑220μg。
[0053] 本发明中，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述药根碱的含量可为25‑55μg，较佳地为27‑49μg。
[0054] 本发明中，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述哈巴苷的含量可为4.0‑6.0mg，较佳地为4.2‑5.5mg。
[0055] 本发明中，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述哈巴俄苷的含量可为600‑1000μg，较佳地为615‑975μg。
[0056] 本发明中，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述黄柏碱的含量可为1.2‑2.0mg，较佳地为1.2‑1.8mg。
[0057] 本发明中，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述小檗碱的含量可为1.0‑2.1mg，较佳地为1.1‑2.0mg。
[0058] 本发明中，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述安格洛苷C的含量可为1.5‑2.0mg，较佳地为1.6‑2.0mg。
[0059] 本发明中，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述桔梗皂苷D的含量可为500‑1100μg，较佳地为550‑1050μg。
[0060] 本发明中，每克所述玄柏爽声复方提取物中，所述新绿原酸的含量可为300‑600μg，较佳地为320‑550μg。
[0061] 在一优选的实施方案中，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱27.92μg；氧化苦参碱34.87μg；苦参碱156.05μg；哈巴苷5377.62μg；哈巴俄苷973.22μg；黄柏碱1682.39μg；小檗碱1472.55μg；安格洛苷C 1959.71μg；桔梗皂苷D931.66μg；阿魏酸
269.76μg；芦丁66.84μg；甘草苷2951.12μg；麦角甾苷260.50μg；药根碱34.29μg；肉桂酸
197.14μg；甘草酸铵3789.94μg；新绿原酸373.05μg。
[0062] 在一优选的实施方案中，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱23.59μg；氧化苦参碱28.56μg；苦参碱219.71μg；哈巴苷5188.44μg；哈巴俄苷912.43μg；黄柏碱1695.36μg；小檗碱1484.36μg；安格洛苷C1857.67μg；桔梗皂苷D677.77μg；阿魏酸
274.50μg；芦丁68.33μg；甘草苷2756.33μg；麦角甾苷238.24μg；药根碱32.42μg；肉桂酸
182.95μg；甘草酸铵3607.68μg；新绿原酸375.11μg。
[0063] 在一优选的实施方案中，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱23.65μg；氧化苦参碱32.16μg；苦参碱150.99μg；哈巴苷4780.09μg；哈巴俄苷844.74μg；黄柏碱1725.56μg；小檗碱1300.40μg；安格洛苷C1705.04μg；桔梗皂苷D778.51μg；阿魏酸
262.29μg；芦丁74.48μg；甘草苷2765.78μg；麦角甾苷248.78μg；药根碱27.69μg；肉桂酸
185.42μg；甘草酸铵3545.43μg；新绿原酸381.75μg。
[0064] 在一优选的实施方案中，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱34.28μg；氧化苦参碱32.97μg；苦参碱167.05μg；哈巴苷4325.87μg；哈巴俄苷850.05μg；黄柏碱1467.04μg；小檗碱1405.41μg；安格洛苷C1757.68μg；桔梗皂苷D748.22μg；阿魏酸
220.87μg；芦丁61.30μg；甘草苷2907.06μg；麦角甾苷244.58μg；药根碱38.63μg；肉桂酸
204.15μg；甘草酸铵3915.31μg；新绿原酸325.33μg。
[0065] 在一优选的实施方案中，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱33.75μg；氧化苦参碱30.34μg；苦参碱151.18μg；哈巴苷4233.93μg；哈巴俄苷808.7μg；黄柏碱1596.5μg；小檗碱1575.21μg；安格洛苷C1781.47μg；桔梗皂苷D551.41μg；阿魏酸219.48μg；芦丁66.52μg；甘草苷3099.46μg；麦角甾苷252.86μg；药根碱44.71μg；肉桂酸
201.96μg；甘草酸铵4055.19μg；新绿原酸348.01μg。
[0066] 在一优选的实施方案中，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱29.25μg；氧化苦参碱21.24μg；苦参碱140.92μg；哈巴苷4504.20μg；哈巴俄苷700.00μg；黄柏碱1713.07μg；小檗碱1749.44μg；安格洛苷C1683.16μg；桔梗皂苷D670.86μg；阿魏酸
210.56μg；芦丁61.82μg；甘草苷2980.42μg；麦角甾苷218.29μg；药根碱41.14μg；肉桂酸
186.78μg；甘草酸铵4173.03μg；新绿原酸332.78μg。
[0067] 在一优选的实施方案中，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱22.19μg；氧化苦参碱34.73μg；苦参碱140.18μg；哈巴苷4717.69μg；哈巴俄苷831.96μg；黄柏碱1686.19μg；小檗碱1575.35μg；安格洛苷C1723.70μg；桔梗皂苷D868.39μg；阿魏酸
253.26μg；芦丁66.10μg；甘草苷3013.95μg；麦角甾苷262.55μg；药根碱37.70μg；肉桂酸
180.77μg；甘草酸铵3972.06μg；新绿原酸547.38μg。
[0068] 在一优选的实施方案中，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱24.24μg；氧化苦参碱30.81μg；苦参碱126.16μg；哈巴苷4650.29μg；哈巴俄苷701.03μg；黄柏碱1477.63μg；小檗碱1489.03μg；安格洛苷C1710.62μg；桔梗皂苷D731.58μg；阿魏酸
212.48μg；芦丁68.19μg；甘草苷2822.86μg；麦角甾苷259.21μg；药根碱38.09μg；肉桂酸
176.55μg；甘草酸铵3947.33μg；新绿原酸341.90μg。
[0069] 在一优选的实施方案中，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱29.06μg；氧化苦参碱38.26μg；苦参碱152.05μg；哈巴苷5487.71μg；哈巴俄苷801.42μg；黄柏碱1551.14μg；小檗碱1426.97μg；安格洛苷C1895.76μg；桔梗皂苷D861.55μg；阿魏酸
215.41μg；芦丁65.53μg；甘草苷2861.09μg；麦角甾苷249.71μg；药根碱30.35μg；肉桂酸
187.93μg；甘草酸铵4070.99μg；新绿原酸333.42μg。
[0070] 在一优选的实施方案中，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱28.49μg；氧化苦参碱25.57μg；苦参碱177.65μg；哈巴苷4732.57μg；哈巴俄苷748.17μg；黄柏碱1521.09μg；小檗碱1561.50μg；安格洛苷C1758.79μg；桔梗皂苷D671.17μg；阿魏酸
220.79μg；芦丁66.58μg；甘草苷2733.44μg；麦角甾苷214.73μg；药根碱40.65μg；肉桂酸
191.02μg；甘草酸铵3851.00μg；新绿原酸346.20μg。
[0071] 在一优选的实施方案中，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱30.77μg；氧化苦参碱30.87μg；苦参碱205.20μg；哈巴苷5241.03μg；哈巴俄苷870.72μg；黄柏碱1692.75μg；小檗碱1705.13μg；安格洛苷C1920.67μg；桔梗皂苷D552.33μg；阿魏酸
206.18μg；芦丁57.16μg；甘草苷2126.39μg；麦角甾苷269.19μg；药根碱48.42μg；肉桂酸
222.97μg；甘草酸铵3401.46μg；新绿原酸407.93μg。
[0072] 在一优选的实施方案中，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱26.56μg；氧化苦参碱32.80μg；苦参碱199.51μg；哈巴苷5126.94μg；哈巴俄苷795.86μg；黄柏碱1707.51μg；小檗碱1429.35μg；安格洛苷C1783.40μg；桔梗皂苷D771.12μg；阿魏酸
224.34μg；芦丁26.27μg；甘草苷2092.17μg；麦角甾苷268.96μg；药根碱42.97μg；肉桂酸
179.66μg；甘草酸铵3387.61μg；新绿原酸394.89μg。
[0073] 在一优选的实施方案中，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱30.80μg；氧化苦参碱32.08μg；苦参碱129.56μg；哈巴苷4905.34μg；哈巴俄苷785.86μg；黄柏碱1203.23μg；小檗碱1150.95μg；安格洛苷C1744.78μg；桔梗皂苷D581.39μg；阿魏酸
204.36μg；芦丁43.23μg；甘草苷2048.81μg；麦角甾苷239.85μg；药根碱39.84μg；肉桂酸
184.55μg；甘草酸铵2671.26μg；新绿原酸391.11μg。
[0074] 在一优选的实施方案中，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱20.90μg；氧化苦参碱36.54μg；苦参碱183.93μg；哈巴苷5055.56μg；哈巴俄苷620.78μg；黄柏碱1799.34μg；小檗碱1935.79μg；安格洛苷C1653.60μg；桔梗皂苷D902.85μg；阿魏酸
260.95μg；芦丁72.56μg；甘草苷1941.94μg；麦角甾苷207.09μg；药根碱40.05μg；肉桂酸
172.01μg；甘草酸铵2699.21μg；新绿原酸327.71μg。
[0075] 在一优选的实施方案中，每克所述玄柏爽声复方提取物中，含有如下成分：金雀花碱22.94μg；氧化苦参碱34.76μg；苦参碱140.21μg；哈巴苷4506.88μg；哈巴俄苷756.44μg；黄柏碱1789.45μg；小檗碱1613.28μg；安格洛苷C1735.15μg；桔梗皂苷D1016.04μg；阿魏酸
278.75μg；芦丁61.68μg；甘草苷1869.63μg；麦角甾苷197.53μg；药根碱31.33μg；肉桂酸
177.23μg；甘草酸铵2474.54μg；新绿原酸369.19μg。
[0076] 本发明还提供了一种玄柏复方制剂，其包括所述的玄柏爽声复方提取物。
[0077] 本发明中，所述玄柏复方制剂的剂型可为散剂、丸剂、胶囊剂、片剂、乳剂或口服液等任何一种口服形式的常规制剂。所述玄柏复方制剂可按照相应剂型的制备方法得到。例如将所述的玄柏爽声复方提取物的活性成分加入制备不同剂型时所需的各种常规辅料制备成任何常规内服制剂，或将所述的玄柏爽声复方提取物研磨成粉末混合均匀制成散剂、丸剂或胶囊剂、片剂等；或将原料药水煎、浓缩水煎液提取活性成分制成口服液；或将提取液浓缩干燥后粉碎制成散剂、胶囊剂等。
[0078] 本发明还提供了所述的玄柏爽声复方提取物或所述玄柏制剂在制备治疗急慢性咽喉炎的药物中的应用。
[0079] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0080] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0081] 本发明的积极进步效果在于：
[0082] 本发明制备的用于治疗急慢性咽喉炎的玄柏爽声复方提取物中毒性物质含量得到有效降低，可有效降低金雀花碱和氧化苦参碱的含量，并使苦参碱保留在一定范围内，而其他成分仍然保持在有效剂量范围内，且临床疗效和安全性高。
附图说明
[0083] 图1为4℃沉淀12h内有效成分变化。
[0084] 图2为25℃沉淀12h内有效成分变化。
[0085] 图3为30℃沉淀12h内有效成分变化。
[0086] 图4为40℃沉淀12h内有效成分变化。
[0087] 图5A为不同相对密度浓缩液有效成分含量变化；图5B为不同相对密度浓缩液有效部位含量变化。
[0088] 图6为玄柏爽声颗粒对急性咽炎模型大鼠炎症因子IL‑6、TNF‑α、IL‑1β含量及IL‑6mRNA表达、TNF‑αmRNA表达的影响。
具体实施方式
[0089] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0090] 实施例1‑6和对比例1‑14采用的仪器如下：
[0091] 1.1仪器
[0092] Agilent 1260(II)型高效液相色谱仪，包含ChemStation工作站、DAD检测器、四元泵、在线真空脱气机(美国安捷伦科技有限公司)；
[0093] SQP型十万分之一电子分析天平(德国赛多利斯(上海)有限公司)；
[0094] 3‑18R医用离心机(湖南恒诺仪器设备有限公司)；
[0095] CF1524R台式高速冷冻型微型离心机(赛洛捷克(美国)有限公司)；
[0096] TUC‑10H多功能触屏超声波清洗仪(上海泰坦科技股份有限公司)；
[0097] ZKSY型恒温水浴锅(巩义市予华仪器有限责任公司)；
[0098] FE28 pH计(美国梅特勒‑托利多仪器(上海)有限公司)；
[0099] RV3eco型旋转蒸发仪(IKA(德国)有限公司)
[0100] FTA全自动煎药壶(潮州市一壶百饮电器实业有限公司)；
[0101] SHB‑IIIT型循坏水式多用真空泵(上海沪析实业有限公司)；
[0102] Milli‑Q超纯水仪(Millipore(美国)有限公司)；
[0103] DHG系列电热鼓风干燥箱：一恒科学仪器，中国
[0104] 1.2试药
[0105] 药材：玄参、山豆根、紫菀、黄柏、桔梗、蝉蜕、甘草均购于安徽德昌药业股份有限公司。
[0106] 对照品：金雀花碱、苦参碱、哈巴苷、氧化苦参碱、黄柏碱、阿魏酸、甘草苷、芦丁、毛蕊花糖苷、药根碱、安格洛苷C、盐酸小檗碱、槲皮素、肉桂酸、哈巴俄苷、桔梗皂苷D、山奈酚、甘草酸、高丽槐素、新绿原酸、紫菀酮均购于中国食品药品检定研究院，详细信息见表1。
[0107] 试剂：磷酸、乙酸、甲醇、乙腈
[0108] 表1标准品信息表
[0109]
[0110] 实施例1
[0111] 按复方药材比例(玄参：山豆根：蜜紫菀：黄柏：桔梗：蝉蜕：甘草＝3:1:2:2:2:2:2)取药材78.75kg，浸泡30min，加水煎煮二次，每次加水量分别为8倍与6倍量，加热至沸腾，自沸腾时开始计时，每次保持微沸1.5小时，药汁过80目筛，合并煎液，将提取液输入沉淀罐在4℃下静置沉淀6h，取上清液浓缩至相对密度(70℃)为1.05，得到提取物浓缩液。将得到的提取物浓缩液加入3％糊精，在110‑120℃下干燥，得玄柏爽声复方提取物。
[0112] 按照上述制备方法重复制备15个批次。
[0113] 沉淀工艺研究1(实施例2、对比例1‑3)
[0114] 按复方药材比例(玄参：山豆根：蜜紫菀：黄柏：桔梗：蝉蜕：甘草＝3:1:2:2:2:2:2)取药材1.584kg，浸泡30min，加水煎煮二次，每次加水量分别为8倍与6倍量，加热至沸腾，自沸腾时开始计时，每次保持微沸1.5小时，药汁过80目筛，合并煎液，得12.6L提取液，将提取液在4℃下沉淀静置，分别于表2中的时间取适量上清液，待测。
[0115] 表2
[0116] 沉淀时间/h
对比例1 0
实施例2 4
对比例2 8
对比例3 12
[0117] 沉淀工艺研究2(实施例3‑4、对比例4‑5)
[0118] 按复方药材比例(玄参：山豆根：蜜紫菀：黄柏：桔梗：蝉蜕：甘草＝3:1:2:2:2:2:2)取药材1.584kg，浸泡30min，加水煎煮二次，每次加水量分别为10倍与8倍量，加热至沸腾，自沸腾时开始计时，每次保持微沸1小时，药汁过80目筛，合并煎液，得14.2L溶液，将提取液在25℃下沉淀静置，分别于表3中的时间取适量上清液，待测。
[0119] 表3
[0120]
[0121]
[0122] 沉淀工艺研究3(对比例6‑9)
[0123] 按复方药材比例取药材(玄参：山豆根：蜜紫菀：黄柏：桔梗：蝉蜕：甘草＝3:1:2:2:2:2:2)1.584kg，浸泡30min，加水煎煮二次，每次加水量分别为12倍与6倍量，加热至沸腾，自沸腾时开始计时，每次保持微沸1.5小时，药汁过80目筛，合并煎液，得14.2L溶液，将提取液置于30℃下沉淀静置，分别于表4中的时间取适量上清液，待测。
[0124] 表4
[0125] 沉淀时间/h
对比例6 0
对比例7 4
对比例8 8
对比例9 12
[0126] 沉淀工艺研究4(对比例10‑13)
[0127] 按复方药材比例取药材(玄参：山豆根：蜜紫菀：黄柏：桔梗：蝉蜕：甘草＝3:1:2:2:2:2:2)1.584kg，浸泡30min，加水煎煮二次，每次加水量分别为12倍与6倍量，加热至沸腾，自沸腾时开始计时，每次保持微沸1.5小时，药汁过80目筛，合并煎液，得14.3L溶液，将提取液置于40℃下沉淀静置，分别于表5中的时间取适量上清液，待测。
[0128] 表5
[0129] 沉淀时间/h对比例10 0
对比例11 4
对比例12 8
对比例13 12
[0130] 浓缩工艺研究1(实施例5‑6、对比例14)
[0131] 按复方药材比例(玄参：山豆根：蜜紫菀：黄柏：桔梗：蝉蜕：甘草＝3:1:2:2:2:2:2)取药材1.584kg，浸泡30min，加水煎煮二次，每次加水量分别为10倍与8倍量，加热至沸腾，自沸腾时开始计时，每次保持微沸1小时，药汁过80目筛，合并煎液，得12.6L溶液，将提取液在4℃下沉淀静置6h，取上清液分别浓缩至表6中的相对密度(70℃)，待测。
[0132] 表6
[0133] 相对密度
实施例5 1.05
实施例6 1.10
对比例14 1.15
[0134] 效果实施例1：含量测定方法建立
[0135] 1.1色谱条件：
[0136] 色谱柱：Agilent ZORABX SB‑C18(4.6mm×250mm，3.5μm)；以0.1％磷酸水(pH＝2)溶液(A)‑甲醇(B)‑乙腈(C)为流动相梯度洗脱，洗脱梯度如表7所示，流速为1.0mL/min，柱温为30℃；进样量为20μL，分别于215nm(用于检测苦参碱、哈巴苷、氧化苦参碱、盐酸黄柏碱、芦丁、毛蕊花糖苷、盐酸小檗碱、肉桂酸、哈巴俄苷、桔梗皂苷D)、265nm(用于检测甘草苷、药根碱、甘草酸铵)和310nm(用于检测阿魏酸、金雀花碱和安格洛苷C)，记录色谱图80min。
[0137] 表7HPLC含量测定流动相洗脱条件
[0138]
[0139] 上述百分比为流动相A、流动相B或流动相C的体积与“流动相A、流动相B和流动相C”总体积之比。
[0140] 1.2.混合标准品及供试品溶液的制备
[0141] 1.2.1混合对照品溶液的制备
[0142] 精密称取17种不同对照品适量，置于25mL容量瓶中，加入15％甲醇定容，配制成终浓度不同的17种标准品混合溶液，4℃保存，备用。标准品混合溶液信息见表8。
[0143] 表8
[0144]
[0145] 1.2.2供试品溶液的制备
[0146] 若供试品为提取液或浓缩液，按方法一制备供试品溶液；若供试品为固体，按方法二制备供试品溶液。
[0147] 方法一：精密移取提取液或浓缩液100mL至500mL容量瓶中，加入适量比例甲醇和水定容，配制成15％甲醇‑水溶液。移取适量溶液，5000r/min转离心5min，取上清液用0.45μm滤膜过滤，即可。
[0148] 方法二：精密称取1g固体粉末，置于50mL具塞锥形瓶中，精密加入50mL 15％甲醇‑水溶液，密塞，称重，超声提取30min，放冷后再次称重，补足减失重量，摇匀，离心机5000r/min，5min，过0.45μm微孔滤膜即可。
[0149] 1.3专属性验证
[0150] 将供试品溶液、空白溶媒、混合对照品注入高效液相色谱仪测试。测试结果见图1‑3，结果表明不同波长下可检出相应不同有效成分，说明该方法专属性良好。
[0151] 1.4线性范围考察
[0152] 取混合对照品及空白辅料，15％甲醇配制成不同浓度标准品溶液，见表9。分别取上述不同浓度标准品溶液20μL，按1.1项下色谱条件进行测定，以峰面积为Y轴，对照品溶液浓度为X轴，进行线性回归，求得的直线回归方程即为标准曲线，结果如表10。
[0153] 表9标准品浓度(单位：μg/mL)：
[0154]
[0155] 表10线性范围考察(n＝6)
[0156]
[0157]
[0158] 1.5精密度考察
[0159] 取同一份样品含17种标准品的15％甲醇溶液，按照上述色谱条件进行检测，连续进样六次，计算峰面积的RSD(％)，考察精密度。结果表11所示，各成分的峰面积的RSD均小于2.0％，表明方法精密度良好，符合方法学要求，可用于含量测定。
[0160] 表11精密度试验结果(n＝6)
[0161]
[0162]
[0163] 1.6加样回收率考察
[0164] 取已知含量的实施例1制备的提取物粉末，加入一定量的对照品，要求提取物中已知量与加入对照品的量一致。取上述样品溶液和对照品液注入高效液相色谱仪，记录峰面积，计算含量，考察回收率，结果见表12。结果回收率符合方法学要求，可用于含量测定。
[0165] 表12加样回收率结果(n＝6)
[0166]
[0167]
[0168]
[0169]
[0170] 1.7稳定性
[0171] 将实施例1制备的玄柏爽声复方提取物按照1.2.2中的方法二制备供试品溶液，取供试品溶液适量，室温放置，分别于0、2、4、6、8、12、24h按上述色谱条件进样，测定混合对照品溶液中17种有效成分和相对峰面积，计算RSD％，结果见表13。24小时内样品含量未见明显变化，因此样品24小时内稳定。
[0172] 表13稳定性结果考察
[0173]
[0174]
[0175] 紫菀酮含量测定
[0176] 1.供试品制备
[0177] 1.1玄柏爽声复方提取物供试品的制备
[0178] 精密称取3g实施例1制备的玄柏爽声复方提取物，研磨成细粉，置于50mL具塞锥形瓶中，精密加入50mL甲醇溶液，密塞，称重，超声提取30min，放冷后再次称重，补足减失重量，摇匀，离心机5000r/min，5min，过0.45μm微孔滤膜即得。
[0179] 1.2复方水提液供试品
[0180] 复方药材比例(玄参：山豆根：蜜紫菀：黄柏：桔梗：蝉蜕：甘草＝3:1:2:2:2:2:2)取药材66g，浸泡30min，加水煎煮二次，每次加水量分别为8倍与6倍量，加热至沸腾，自沸腾时开始计时，每次保持微沸1.5小时，药汁过80目筛，合并煎液，定容于500mL容量瓶中，取100mL加入水至500mL容量瓶中，取50mL溶液，蒸干溶剂，再用50mL甲醇复溶，在5000r/min转速下离心5min，取上清液过0.45um有机系滤膜，即得。
[0181] 1.3阴性水提液供试品制备
[0182] 根据处方比例及生产工艺，制备缺蜜紫菀的阴性样品，按上述方法制备阴性供试品溶液。
[0183] 1.4单煎水提液供试品制备
[0184] 根据处方比例及生产工艺，制备只含蜜紫菀的单煎样品，按上述方法制备单煎供试品溶液。
[0185] 2对照品制备
[0186] 精密称取紫菀酮标准品1mg，加乙腈配制成浓度为0.1mg/mL对照品溶液。
[0187] 3HPLC分析条件的建立
[0188] 3.1色谱条件
[0189] 色谱柱：Agilent ZORABX SB‑C18(4.6mm×250mm，3.5μm)；以水：乙腈(4:96)为流动相等度洗脱，检测波长为：200nm。流速为1.0mL/min，柱温为40℃；进样量为20μL。
[0190] 3.2专属性考察
[0191] 分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20uL，按本章“3.1”项下色谱条件进行测定。结果显示在紫菀酮色谱峰相应保留时间处，各阴性对照溶液色谱中没有对应的色谱峰，说明各阴性对照与待测组分之间无干扰。在供试品色谱中待测组分与其他组分分离度大于1.5，得到很好的分离，方法专属性良好。
[0192] 3.3线性范围考察
[0193] 取1.2项下对照品储备液适量，逐级稀释为30ug/mL、25ug/mL、20ug/mL、15ug/mL、10ug/mL、5ug/mL、2ug/mL、1ug/mL对照品溶液，取上述对照品溶液20μL按1.3项下色谱条件进行测定，以峰面积为Y轴，对照品溶液浓度为X轴，进行线性回归。结果表明，该分析方法下的紫菀酮在1‑30ug/mL内的线性范围良好，r>0.999，建立的方法可用于玄柏爽声复方颗粒的定量分析。
[0194] 3.4检测限及定量限的测定
[0195] 对紫菀酮的检测限(LOD)及定量限(LOQ)进行考察。采取信噪比法测定并分析该方法的检测限和定量限。得到的最低浓度的对照品进行稀释并按照1.3项下的色谱条件进行检测，记录对照品浓度及色谱数据中的信噪比。当信噪比为4:1时，此时检测的对照品浓度为该成分的检测限；当信噪比为10:1时，此时检测的对照品浓度为该成分的定量限。结果LOD浓度为0.5μg/mL，LOQ浓度为1μg/mL。
[0196] 4玄柏爽声复方颗粒中紫菀酮含量的测定
[0197] 按1.1项下方法制备复方颗粒供试品，按3.1项下方法进行HPLC测定。样品测定过程中峰面积积分无法达到LOQ要求，因此玄柏爽声复方提取物中紫菀酮含量低于定量限。
[0198] 效果实施例2：样品中各成分含量测定
[0199] 将上述实施例1得到的提取物浓缩液、实施例2‑7和对比例1‑13得到的上清液分别按照上述液相色谱条件进样，测定金雀花碱、苦参碱、氧化苦参碱、黄柏碱、药根碱、安格洛苷C、小檗碱、哈巴俄苷、甘草酸铵9种代表性有效成分的含量。
[0200] 1、实施例1测试结果分析
[0201] 15个批次的测定结果见表14，根据表14可知，15个批次的提取物中，金雀花碱含量不超过40μg/g，氧化苦参碱不超过40μg/g；苦参碱含量在120‑220μg/g之间；哈巴苷不低于4.0mg/g，哈巴俄苷不低于600μg/g，黄柏碱不低于1.20mg/g，小檗碱不低于1.00mg/g，安格洛苷C不低于1.50mg/g，桔梗皂苷D不少于550μg/g，新绿原酸不低于300μg/g。
[0202] 表14不同批次提取物有效成分含量
[0203]
[0204]
[0205] 2、对比例1‑3和实施例2测试结果分析
[0206] 由图1可知，4℃条件下，金雀花碱4h内含量下降大于30％，4h后含量不再继续下降；药根碱含量也呈下降趋势，4h下降20％，8h超过30％，8h后不再继续下降；其他成分含量4h内含量下降均小于10％，8h后下降不明显趋势。因此，在4℃条件下，沉淀3‑6小时，既可以除去30％以上的有毒成分金雀花碱同时可以保留大多数有效成分。
[0207] 3、对比例4‑5和实施例3‑4测试结果分析
[0208] 由图2可知，25℃条件下，4h后金雀花碱含量开始明显下降，且下降幅度显著高于其他8种成分及总成分；8h时，金雀花碱含量下降幅度超过35％，8‑12h不再继续下降；药根碱4h含量下降超过10％，8h后含量下降达20％。考虑到金雀花碱为毒性成分，药根碱为有效成分，因此，在25℃条件下沉淀6‑8小时，可确保除去超过30％的金雀花碱的同时保留其他有效成分。
[0209] 4、对比例6‑9测试结果分析
[0210] 由图3可知，30℃条件下金雀花含量基本不变，苦参碱含量增加，其原因可能苦参碱在提取液内处于过饱和状态，随着时间延长逐渐有更多苦参碱溶解从而导致含量升高；药根碱仍然呈下降趋势。考虑到金雀花碱和苦参碱均与毒性相关，而药根碱属于有效成分，因此沉淀温度不易采用30℃。
[0211] 5、对比例10‑13测试结果分析
[0212] 由图4可知，40℃条件下金雀花碱含量变化较小，苦参碱含量增加，其原因可能是苦参碱在提取液内处于过饱和状态，随着时间延长逐渐有更多苦参碱溶解从而导致含量升高；药根碱仍然呈下降趋势。考虑到金雀花碱和苦参碱均与毒性相关，而药根碱属于有效成分，因此沉淀温度不易采用40℃。
[0213] 6、对比例14和实施例5‑6测试结果分析
[0214] 有效成分和有效部位之间关系如下：
[0215] 环烯醚萜苷：哈巴苷、哈巴俄苷；苯丙素类：安格洛苷C、毛蕊花糖苷、肉桂酸；酚酸类：阿魏酸、新绿原酸；生物碱类：金雀花碱、氧化苦参碱、苦参碱、小檗碱、黄柏碱、药根碱；黄酮类：高丽槐素、芦丁、槲皮素、甘草苷、山奈酚；三萜类：甘草酸铵；皂苷类：桔梗皂苷D。
[0216] 由图5A和图5B可知，在常压浓缩条件下，当浓缩密度(70℃)达到1.05时，9种成分除氧化苦参碱外，含量损失率控制在10％之内，氧化苦参碱的含量下降在22％左右；当浓缩密度(70℃)在1.05‑1.10密度范围内氧化苦参碱含量未见明显下降；当热密度达到1.10‑1.15时，氧化苦参碱含量继续下降，环烯醚萜苷类继续下降，皂苷类含量下降不再明显，但损失均已超过20％。因此，浓缩密度在1.05左右既可使部分氧化苦参碱沉淀同时又可以保留环烯醚萜苷和皂苷类成分。当密度超过1.10后，氧化苦参碱含量降低过大且主要有效部位环烯醚萜苷和皂苷类含量降低过多，因此当浓缩密度在1.02‑1.075范围内时，特别是在
1.03‑1.07范围内时，在一定程度上能沉淀掉部分氧化苦参碱并保留环烯醚萜苷和皂苷类有效部位。
[0217] 效果实施例3：药效学评价
[0218] 下述实验中所用到的玄柏爽声颗粒为按照实施例1的制备方法制备所得。
[0219] 总计56只SD大鼠(约200g)，随机分为7组，每组8只，分别为空白对照组、模型组、地塞米松对照组(5mg/kg)、双黄连口服溶液组(2mL/只)、玄柏爽声颗粒低(0.13g/kg)、中(0.5g/kg)、高(0.8g/kg)3个剂量组(混悬液，用蒸馏水配成，根据人与大鼠体表系数折算)。大鼠口服给药总共持续5天，给药2天后，用喉头喷雾器将15％氨水向其咽部喷雾，每天2次，连续3天，记录大鼠状态，咽部粘膜情况。末次给药24小时后，大鼠取血测血常规及Elisa检测炎性因子，比较药物组别之间差异；部分咽部组织研磨后制成匀浆，PCR法检测炎性细胞因子。采用SPSS 20.0统计学软件处理，计量数据采用均数±标准差 表示，组间比较采用方差分析。
[0220] 表15玄柏爽声颗粒对急性咽炎模型大鼠白细胞的影响
[0221]
[0222] 备注：与模型组对比*P<0.05，**P<0.01，#P>0.05
[0223] 对白细胞的影响
[0224] 与对照组相比，模型组白细胞(WBC)计数和淋巴细胞(LYM)百分比明显增加(P<0.01)，说明造模成功，结果见表15。和模型组相比，地塞米松磷酸钠组、双黄连口服溶液组WBC计数和LYM百分比明显降低(P<0.05)，玄柏爽声颗粒低剂量组WBC计数和LYM百分比均无显著差异，玄柏爽声颗粒中剂量组WBC计数显著下降，玄柏爽声颗粒高剂量组WBC计数和LYM百分比明显降低(P<0.05)，说明中、高剂量可降低模型动物白细胞水平，具有明细抗炎作用。
[0225] 对炎症因子IL‑6、TNF‑α、IL‑1β含量及IL‑6mRNA表达、TNF‑αmRNA表达的影响[0226] 结果见图6，与对照组相比，模型组炎症因子IL‑6、TNF‑α、IL‑1β含量及IL‑6mRNA表达、TNF‑αmRNA表达均显著增高(P<0.01)，说明造模成功。阳性药物地塞米松磷酸钠组，与模型组相比，IL‑6、TNF‑α、IL‑1β含量及IL‑6mRNA表达、TNF‑αmRNA表达均显著下降(P<0.01)。双黄连口服溶液组与地塞米松磷酸钠组相比，IL‑6、TNF‑α、IL‑1β含量及IL‑6mRNA表达下降幅度少，但和模型组相比，具有显著差异(P<0.05)。玄柏爽声颗粒低剂量组和模型组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。玄柏爽声颗粒中剂量组和高剂量组IL‑6、TNF‑α含量及IL‑
6mRNA表达、TNF‑αmRNA表达均呈剂量依赖性的下降作用(P<0.05)。玄柏爽声颗粒低剂量组和中剂量组与模型组相比，IL‑1β含量变化无统计学意义(P>0.05)，高剂量组有统计学意义(P<0.05)，尽管如此，玄柏爽声颗粒低剂量组、中剂量组、高剂量组的IL‑1β含量呈剂量依赖性下降趋势。低剂量组和中剂量组有的指标没有统计学意义的原因在于给药剂量偏小所致。
[0227] 因此，玄柏爽声颗粒可抑制体内白细胞总数和淋巴细胞总数，主要通过抑制体内炎症因子IL‑6、TNF‑α、IL‑1β的产生发挥抗炎作用。
