一种预防鸭疫里默氏杆菌的功能性益生菌的筛选方法及应用

摘要

本发明提供了一种预防鸭疫里默氏杆菌的功能性益生菌的筛选方法及应用，可广泛应用于微生物技术领域，其解决了现有的鸭传染性浆膜炎疫苗存在副反应大和安全性低的技术问题。本发明的筛选方法为基于琼脂扩散试验的高通量筛选鸭疫里默氏杆菌免疫类似物，具体包括，在琼脂板中，分别加入不同血清型鸭疫里默氏杆菌标准阳性血清、候选益生菌测试液、阴性标准抗原、阳性标准抗原，35～37℃温度下扩散，当阴性标准抗原与阳性标准抗原对照成立时，与不同血清型鸭疫里默氏杆菌标准阳性血清形成白色沉淀线的候选益生菌测试液对应的益生菌即为筛选的功能性益生菌。

权利要求

1.一种预防鸭疫里默氏杆菌的功能性益生菌的筛选方法，其特征在于：所述筛选方法为基于琼脂扩散试验高通量筛选鸭疫里默氏杆菌免疫类似物，具体包括，在琼脂板的多组琼脂孔中，每组的中央孔加入不同血清型鸭疫里默氏杆菌标准阳性血清，每组的周围孔分别依次加入各稀释度候选益生菌测试液和阴性、阳性标准抗原，35～37℃温度下扩散，当阴性标准抗原与阳性标准抗原对照成立时，与不同血清型鸭疫里默氏杆菌标准阳性血清形成白色沉淀线的候选益生菌测试液对应的益生菌即为筛选的功能性益生菌；

所述候选益生菌测试液中的候选益生菌为枯草芽孢杆菌或嗜酸乳杆菌。

2.根据权利要求1所述的预防鸭疫里默氏杆菌的功能性益生菌的筛选方法，其特征在于：候选益生菌测试液的制备方法为：将候选益生菌接入液体培养基中，恒温培养进行活化，得到候选益生菌培养液，离心，收集发酵上清，得到候选益生菌测试液。

3.根据权利要求2所述的预防鸭疫里默氏杆菌的功能性益生菌的筛选方法，其特征在于：所述液体培养基为营养肉汤培养基或MRS液体培养基。

4.根据权利要求2所述的预防鸭疫里默氏杆菌的功能性益生菌的筛选方法，其特征在于：候选益生菌的培养温度为37℃，培养时间为18h，候选益生菌培养液的离心转速为

8000r/min，离心时间为10min。

5.根据权利要求1所述的预防鸭疫里默氏杆菌的功能性益生菌的筛选方法，其特征在于：琼脂板的制备方法为：在氯化钠溶液中加入优质琼脂糖，加热融化后，浇制，打孔，制得琼脂板。

6.根据权利要求1所述的预防鸭疫里默氏杆菌的功能性益生菌的筛选方法，其特征在于：所述筛选方法还包括雏鸭免疫攻毒试验。

说明书

一种预防鸭疫里默氏杆菌的功能性益生菌的筛选方法及应用

技术领域

[0001] 本申请属于微生物技术领域，更具体地说，是涉及一种预防鸭疫里默氏杆菌的功能性益生菌的筛选方法及应用。

背景技术

[0002] 鸭传染性浆膜炎（Duck infectious serositis），又称为鸭疫里默氏杆菌（Riemerellaanatipestifer，RA）感染，是家鸭、鹅、火鸡及其他家禽和野禽的一种接触传染性疾病，呈急性或慢性败血症过程，以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎、神经症状等为特征。该病的病原为鸭疫里默氏杆菌，一种革兰氏阴性菌，主要通过污染的饲料、饮水、飞沫、尘埃等传播，1～5周龄鸭高度敏感，恶劣环境条件或并发感染可促发该病，死亡率高达 75％，且对动物常用多种抗生素具有耐药性，给全球养鸭业造成巨大经济损失。

[0003] 疫苗免疫是动物疾病防治的重要手段。鸭疫里默氏杆菌血清型众多，有21个血清型，同时还有大量的未定型菌株，因此开发该病的疫苗需要加入多种血清型的菌株作为免疫原（目前最多加到3个不同血清型的菌株作为免疫原，也就是3价疫苗）。目前已经上市的鸭疫里默氏杆菌疫苗都是全菌株灭活疫苗，由于鸭疫里默氏杆菌为革兰氏阴性菌，本身携带大量的细菌内毒素，疫苗注射后会出现雏鸭发热、精神萎靡等症状，严重者引起死亡，较大的副反应造成疫苗应用受限。虽然鸭疫里默氏杆菌荚膜多糖疫苗具有优于全菌株灭活疫苗的使用效果，但因为在制备荚膜多糖时无法有效去除细菌内毒素，也存在灭活疫苗的安全性问题，限制了其产业化开发。

[0004] 益生菌在发酵过程中常分泌多种胞外多糖、脂肽等，具有多种免疫学功能。因此筛选功能性益生菌无疑在疫病的药物开发具有重要意义。目前的筛选方法，一是体内试验筛选法，即通过益生菌有效成份喂服靶动物或者替代动物，然后攻毒试验来验证效果，工作量巨大且成本高昂。二是体外试验，即通过双层琼脂法、琼脂扩散实验、牛津杯法、ELISA法等筛选出可以直接杀灭病原微生物的功能性益生菌或其代谢产物。上述方法简单，且取得一定效果，但均是用于筛选益生菌代谢物中对病原菌（毒）直接杀灭作用的物质的正向筛选方法，例如专利CN 113308397A是通过双层琼脂法筛选出抑制产气荚膜梭菌的功能性益生菌，该筛选方法制备的功能性益生菌产品由于是直接杀灭病原菌（毒），对于动物的保护期短，需要多次用药才能达到持续有效的效果。

发明内容

[0005] 本发明就是为了解决上述背景技术的问题，提供了一种高效、操作简单且成功率高的预防鸭疫里默氏杆菌的功能性益生菌的筛选方法及应用。

[0006] 为此，本发明提供了一种预防鸭疫里默氏杆菌的功能性益生菌的筛选方法，筛选方法为基于琼脂扩散试验高通量筛选鸭疫里默氏杆菌免疫类似物，具体包括，在琼脂板中，分别加入不同血清型鸭疫里默氏杆菌标准阳性血清、候选益生菌测试液、阴性标准抗原、阳性标准抗原，35～37℃温度下扩散，当阴性标准抗原与阳性标准抗原对照成立时，与不同血清型鸭疫里默氏杆菌标准阳性血清形成白色沉淀线的候选益生菌测试液相对应的益生菌即为筛选的功能性益生菌。

[0007] 优选的，候选益生菌测试液的制备方法为：将候选益生菌接入液体培养基中，恒温培养进行活化，得到候选益生菌培养液，离心，收集发酵上清，得到候选益生菌测试液。

[0008] 优选的，候选益生菌为枯草芽孢杆菌或嗜酸乳杆菌。

[0009] 优选的，液体培养基为营养肉汤培养基或MRS液体培养基。

[0010] 优选的，候选益生菌的培养温度为37℃，培养时间为18h，候选益生菌培养液的离心转速为8000r/min，离心时间为10min。

[0011] 优选的，琼脂板的制备方法为：在氯化钠溶液中加入优质琼脂糖，加热融化后，浇制，打孔，制得琼脂板。

[0012] 优选的，筛选方法还包括雏鸭免疫攻毒试验。

[0013] 同时，本发明还提供了一种预防鸭疫里默氏杆菌的功能性益生菌的应用，利用基于琼脂扩散试验高通量筛选方法筛选出可分泌鸭疫里默氏杆菌免疫类似物的功能性益生菌，用于制备防控鸭传染性浆膜炎的功能性益生菌产品。

[0014] 本发明的有益效果为：

[0015] （1）本发明中基于琼脂扩散试验的高通量筛选方法，为一种预防鸭疫里默氏杆菌的功能性益生菌高通量反向筛选方法，可快速、高效地筛选出可分泌鸭疫里默氏杆菌免疫类似物的功能性益生菌。与现有的鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗相比，本发明筛选得到的功能性益生菌混合应用不仅能够预防多种血清型鸭疫里默氏杆菌感染，而且无副反应发生，极大地提高了筛选效率和降低筛选成本，具有重要的临床应用价值。

[0016] （2）利用本发明的预防鸭疫里默氏杆菌的功能性益生菌筛选方法，得到可分泌鸭疫里默氏杆菌免疫类似物的功能性益生菌，混合应用后，安全无毒且免疫持续期长。

[0017] （3）本发明筛选得到的功能性益生菌可以制备成功能性益生菌疫苗或口服产品，有效预防临床养殖中鸭传染性浆膜炎，显著降低肉鸭死亡率，提高经济效益。

具体实施方式

[0018] 为了使本申请所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

[0019] 实施例1 候选益生菌的活化和培养

[0020] 本实施例中使用的益生菌候选菌株均来自潍坊华卓生物科技有限公司菌株资源库，本次实验随机选择候选益生菌80株（编号为A1～A80），活化和培养步骤如下：

[0021] 1.MRS液体培养基配制：称取蛋白胨10g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、乙酸钠2g、酵母粉5g、柠檬酸氢二铵2g、K2PO4• 3H2O 2.6 g、MgSO4• 7H2O 0.1g、MnSO40.05g和半胱氨酸盐酸盐
0.5g，使用去离子水溶解，再加入1mL吐温80，定容至1L，121℃高压灭菌15min，待冷至常温，备用。

[0022] 营养肉汤培养基配制：称取营养肉汤培养基18.0g，加入去离子水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，121℃高压灭菌15min，待冷至常温，备用。

[0023] 2.菌株活化：分别将冻存于‑80℃冰箱的候选益生菌接入液体培养基中，其中，枯草芽孢杆菌接入营养肉汤培养基、嗜酸乳杆菌接入MRS液体培养基中，37℃恒温培养18h进行活化，活化后用于后续试验。

[0024] 3.候选益生菌测试液制备：将步骤2得到的候选益生菌培养液8000r/min离心10min，收集发酵上清，得到候选益生菌测试液。

[0025] 实施例2 预防鸭疫里默氏杆菌的功能性益生菌琼脂扩散试验高通量筛选[0026] 本实施例中使用的不同血清型鸭疫里默氏杆菌标准阳性血清均来自潍坊华卓生物科技有限公司标准血清库，功能性益生菌筛选方法如下：

[0027] 1.琼脂板的配制：在质量分数为8%氯化钠溶液100mL中加入0.5g优质琼脂糖，加热融化后，浇制成琼脂板（约3mm厚）。琼脂板上打多组琼脂孔，每组设有一个中央孔，以中央孔为中心周围均匀分布六个周围孔，孔径均为5mm、孔距均为3mm。

[0028] 2.功能性益生菌琼脂扩散试验高通量筛选：将候选益生菌测试液用灭菌生理盐水进行2倍梯度稀释。每组的中央孔加入不同血清型鸭疫里默氏杆菌标准阳性血清，每组的周围孔分别依次加入各稀释度候选益生菌测试液和阴性、阳性标准抗原，加量以孔满为度（约25～30μL）。加样后置湿盒中于35～37℃恒温箱中扩散，24、48小时各观察一次，并作出结果判定。

[0029] 3.结果判定：当阴性、阳性标准抗原对照成立时，与标准阳性血清形成白色沉淀线的益生菌测试液相对应的益生菌即为该血清型鸭疫里默氏杆菌的候选功能菌。其中，候选益生菌测试液与标准阳性血清的稀释倍数为琼扩效价，效价越高，两者免疫反应能力越强。同一候选益生菌测试液的中间孔加入不同血清型鸭疫里默氏杆菌标准阳性血清，可筛选出对多种血清型鸭疫里默氏杆菌均有效的功能性益生菌。

[0030] 根据琼脂扩散试验筛选方法，共筛选出5株候选益生菌，其中除A17为枯草芽孢杆菌外，其余4株为嗜酸乳杆菌，均具有较高琼扩效价以及对多个血清型鸭疫里默氏杆菌有效，结果见表1。

[0031] 表1 候选功能性益生菌筛选结果

[0032]

[0033] 实施例3功能性益生菌预防不同血清型鸭疫里默氏杆菌的功能验证

[0034] 本实施例选取实施例2筛选得到的5株功能性益生菌A4、A17、A34、A56和A66，研究这5株菌制备的样品对预防不同血清型鸭疫里默氏杆菌攻毒的功能。同时选取实施例2中与鸭疫里默氏杆菌标准阳性血清无任何琼扩效价的1株枯草芽孢杆菌A1与4株嗜酸乳杆菌A10、A20、A40、A50作为对照菌。验证步骤如下：

[0035] 1.样品制备：将筛选获得的枯草芽孢杆菌按照5%的比例接种营养肉汤培养基、嗜8.0
酸乳杆菌按照5％的接种量接种到MRS液体培养基中，于37℃下培养，当菌数达10 CFU/mL以上时，停止发酵，8000r/min离心10min，收集发酵上清。用上述方法分别制备A1、A4、A10、A17、A20、A34、A40、A50、A56和A66发酵上清，其中A4、A17、A34、A56和A66发酵上清按1:1:1:
1:1比例混合，0.22μm滤膜无菌过滤，即为功能性益生菌样品；A1、A10、A20、A40和A50发酵上清按1:1:1:1:1比例混合，0.22μm滤膜无菌过滤，即为对照菌样品。

[0036] 2.样品检验：各样品与不同血清型鸭疫里默氏杆菌标准阳性血清进行琼扩试验，2
其中功能性益生菌样品与血清型1、2、6、7、10、11的标准阳性血清琼扩效价应均不低于2 ，对照菌样品与血清型1、2、6、7、10、11的标准阳性血清应无琼扩效价。

[0037] 3.雏鸭免疫攻毒试验：

[0038] （1）试验分组：260只樱桃谷雏鸭随机分为13组，20只/组，其中6组为试验组，6组为攻毒组，1组为空白组，按照表2中的设计数据进行攻毒试验。攻毒后观察各组雏鸭的精神、饮水、采食等临床变化，并记录死亡鸭只数，计算保护率。

[0039] 表2 雏鸭免疫攻毒试验设计

[0040]

[0041] （2）试验结果：试验组1～6的雏鸭攻毒后第3天均基本恢复正常采食、精神状态良好，而攻毒组1～6的雏鸭攻毒后临床反应明显，精神萎靡且部分伴有神经症状，至攻毒后第6天仍有部分鸭未恢复。攻毒后死亡情况见表3，功能性益生菌样品对不同血清型的鸭疫里默氏杆菌保护率达到70%～100%，而对照菌样品的保护率仅为0～40%。

[0042] 表3 各组死亡情况统计表

[0043]

[0044] 以上结果充分证明，本发明筛选得到的功能性益生菌A4、A17、A34、A56和A66混合应用具有显著地预防不同血清型鸭疫里默氏杆菌的功效，同时说明本发明基于琼脂扩散试验的预防鸭疫里默氏杆菌的功能性益生菌筛选方法具有高效、操作简单且成功率高的特点。

[0045] 实施例4功能性益生菌与鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗预防鸭疫里默氏杆菌的效果比较

[0046] 按实施例3方法制备功能性益生菌样品，将其与白油佐剂按1:2比例混合乳化，制备功能性益生菌疫苗，作为菌液组。按上述方法制备对照菌疫苗，作为对照菌组，同时选用商业化的鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗（批号：CD2208012）作为疫苗组，进行动物效果比较试验，试验步骤如下：

[0047] 1.试验分组：200只樱桃谷雏鸭随机分为10组，20只/组，其中3组为菌液组，3组为疫苗组，3组为对照菌组，1组为空白组，按照表4的设计数据进行攻毒试验。攻毒后观察各组雏鸭的精神、饮水、采食等临床变化，并记录死亡鸭只数，计算保护率。

[0048] 表4 雏鸭免疫攻毒试验设计

[0049]

[0050] （3）试验结果：菌液组雏鸭免疫后未见异常，19日龄攻毒后正常采食、精神状态良好。疫苗组雏鸭疫苗免疫后普遍出现精神沉郁、呆立不动、不喜采食等临床，免疫48小时后才逐渐恢复。攻毒后疫苗组1、疫苗组2雏鸭正常采食、精神状态良好，但疫苗组3雏鸭临床反应明显，精神萎靡且部分伴有神经症状，至攻毒后第6天仍有部分鸭未恢复。攻毒后死亡情况见表5，功能性益生菌样品对血清1、2、10型的鸭疫里默氏杆菌保护率达到85%～100%，而商业化的鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗对血清1、2型的鸭疫里默氏杆菌保护率为80%～100%，但对血清10型的鸭疫里默氏杆菌保护率仅为30%。

[0051] 表5 各组死亡情况统计表

[0052]

[0053] 以上结果充分证明，本发明筛选得到的功能性益生菌A4、A17、A34、A56和A66混合应用具有显著地预防血清1、2、10型鸭疫里默氏杆菌的功效，而商业化的鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗则仅能预防血清1、2型鸭疫里默氏杆菌的强毒攻击，而对血清10型鸭疫里默氏杆菌的预防效果很差。而且，商业化的鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗免疫时对雏鸭造成较大副反应，引起雏鸭精神萎靡、不喜采食等，而功能性益生菌样品则无此弊端。本实施例结果表明本发明基于琼脂扩散试验的预防鸭疫里默氏杆菌的功能性益生菌筛选方法除具有高效、操作简单且成功率高的特点，对鸭疫里默氏杆菌的预防也具有独特的应用优势。

[0054] 实施例5功能性益生菌预防鸭疫里默氏杆菌的免疫持续期

[0055] 按实施例3方法制备功能性益生菌样品，将其与白油佐剂按1:2比例混合乳化，制备功能性益生菌疫苗，作为菌液组。按上述方法制备对照菌疫苗，作为对照菌组，进行免疫持续期试验，试验步骤如下：

[0056] 1.试验分组：140只樱桃谷雏鸭随机分为7组，20只/组，具体分组如表6。攻毒后观察各组雏鸭的精神、饮水、采食等临床变化，并记录死亡鸭只数，计算保护率。

[0057] 表6 雏鸭免疫攻毒试验设计

[0058]

[0059] （4）试验结果：菌液组雏鸭免疫后未见雏鸭异常，19、26、33日龄攻毒后均正常采食、精神状态良好。对照菌组雏鸭临床反应明显，精神萎靡且部分伴有神经症状，至攻毒后第6天仍有部分鸭未恢复。攻毒后死亡情况见表7，19、26、33日龄攻毒后功能性益生菌样品对血清2型的鸭疫里默氏杆菌保护率为90%～100%，而对照菌样品为0～20%。

[0060] 表7 各组死亡情况统计表

[0061]

[0062] 益生菌发酵液中直接杀灭病原菌的物质一般为抗菌肽等，在体内2～3天即全部代谢，本发明筛选得到的功能性益生菌A4、A17、A34、A56和A66混合应用于预防鸭疫里默氏杆菌的免疫持续期达到至少28日，说明该免疫保护作用是功能性益生菌发酵菌液中的免疫类似物起的作用，而不是直接杀灭病原菌物质。本实施例结果充分证明本发明基于琼脂扩散试验的预防鸭疫里默氏杆菌的功能性益生菌筛选方法除具有高效、操作简单、免疫应用无副反应的特点外，免疫持续期长，在临床应用开发中具有重要价值。

[0063] 实施例6功能性益生菌制备成功能性益生菌疫苗，预防鸭疫里默氏杆菌感染的试验

[0064] 按实施例3方法制备功能性益生菌样品，将其与白油佐剂按1:2比例混合乳化，制备功能性益生菌疫苗，作为菌液组。按上述方法制备对照菌疫苗，作为对照菌组，进行临床试验。

[0065] 1.试验设计：山东东营某肉鸭养殖场，4个肉鸭养殖棚，每棚约5000只，共20000只樱桃谷鸭，分别编号为1、2、3、4棚。其中棚1、棚3作为菌液组，棚2、棚4作为对照菌组。菌液组：在5日龄皮下肌肉注射功能性益生菌疫苗，0.2mL/只。对照菌组：在5日龄皮下肌肉注射对照菌疫苗，0.2mL/只。其他按正常药物预防程序。

[0066] 2.试验结果：

[0067] （1）对照菌组（对照菌疫苗组）： 28日龄时，鸭群出现神经症状，鸭呆立不吃食，死亡率上升，每天死亡数约200多只。经第三方机构检测，确诊为鸭疫里默氏杆菌感染。常规抗生素治疗，死亡有所缓解，至38日龄出栏，整个养殖周期死淘率为13.15%。

[0068] （2）菌液组（功能性益生菌疫苗组）：整个养殖期鸭群未发生鸭疫里默氏杆菌感染，至38日龄正常出栏，整体死淘率为4.27%。

[0069] 上述试验数据表明，本发明筛选得到的功能性益生菌A4、A17、A34、A56和A66制备成功能性益生菌疫苗，在临床上注射应用可有效预防临床养殖中鸭传染性浆膜炎病，显著降低肉鸭死亡率，提高经济效益。

[0070] 实施例7功能性益生菌作为口服产品，预防鸭疫里默氏杆菌感染的试验[0071] 1.试验设计：潍坊昌邑某肉鸭养殖场，2个肉鸭养殖棚，共15000只樱桃谷鸭。按棚分为试验组和对照组，每棚7500只。试验组：在3、4、17、18日龄饮水应用实施例3制备的功能性益生菌样品，0.5mL/只。对照组：在3、4、17、18日龄饮水应用实施例3制备的对照菌样品，0.5mL/只。其他按正常药物预防程序。

[0072] 2.试验结果：

[0073] （1）对照组（对照菌样品组）：22日龄时，鸭群开始出现有精神萎靡、缩颈、绿色粪便、站立不稳雏鸭。24日龄，出现大批量死亡，死亡率约4.3%，死亡鸭剖检有典型纤维性心包炎。经实验室检测，病原为鸭疫里默氏杆菌，药敏试验显示无特别敏感抗生素。常规抗生素治疗，死亡有所缓解，每天死亡数约20～40只。32日龄，鸭子大群死亡又开始增加，每天约120余只。至40日龄出栏，整个养殖期鸭群死亡率为8.5%。

[0074] （2）试验组（功能性益生菌样品组）：26日龄时鸭群零星出现鸭浆膜炎症状，每日死亡约20只。经常规抗生素治疗，大群稳定，未出现肉鸭大批死亡。至40日龄正常出栏，整个养殖期鸭群死亡率为3.1%。

[0075] 上述试验数据表明，本发明筛选得到的功能性益生菌A4、A17、A34、A56和A66制备成产品，在临床上3、4、17、18日龄饮水应用，可有效预防临床养殖中鸭传染性浆膜炎病，显著降低肉鸭死亡率，提高经济效益。同时说明本发明基于琼脂扩散试验的预防鸭疫里默氏杆菌的功能性益生菌筛选方法具有高效、操作简单且成功率高的特点，筛选的功能性益生菌菌株临床应用效果突出。

[0076] 综上所述，本发明中基于琼脂扩散试验的高通量筛选方法，为一种预防鸭疫里默氏杆菌的功能性益生菌高通量反向筛选方法，可快速、高效地筛选出可分泌鸭疫里默氏杆菌免疫类似物的功能性益生菌。与现有的鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗相比，本发明筛选得到的功能性益生菌混合应用不仅能够预防多种血清型鸭疫里默氏杆菌感染，而且无副反应发生，极大地提高了筛选效率和降低筛选成本，具有重要的临床应用价值。

[0077] 利用本发明的预防鸭疫里默氏杆菌的功能性益生菌筛选方法，得到可分泌鸭疫里默氏杆菌免疫类似物的功能性益生菌，混合应用后，安全无毒且免疫持续期长。

[0078] 本发明筛选得到的功能性益生菌可以制备成功能性益生菌疫苗或口服产品，有效预防临床养殖中鸭传染性浆膜炎病，显著降低肉鸭死亡率，提高经济效益。

[0079] 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。