颖壳发育相关基因OsAPx5及其蛋白的应用

摘要

本发明公开了颖壳发育相关基因OsAPx5及其蛋白的应用。本发明首次分离克隆了一个新的调控水稻颖壳发育的基因OsAPx5，通过实验证明，其功能缺失型突变体srg12在高温条件下颖壳开裂、籽粒发育受阻、结实率及产量显著下降；通过超表达OsAPx5基因可恢复srg12突变体在高温环境下的表型；同时敲除或降低OsAPx5基因表达，也可获得类似srg12突变体的表型。同时，本发明克隆的OsAPx5基因能够提高颖花对高温胁迫的耐受性，对进一步阐明植物抗逆的分子机理并通过基因工程手段培育抗逆、优质、高产的作物新品种具有重要的理论意义和现实意义。(56)对比文件Chwan Yang Hong等人.NaCl-inducedexpression of ASCORBA TE PEROXIDASE 8in roots of rice ( Oryza sativa L.)seed lings is not associated withosmotic component.Plant Signaling &Behavior.2008,第199-201页.安辽原 等人.过量表达 Os APX1 基因增强水稻的抗热和抗氧化能力.中国农业科技导报.2012,第28-32页.

权利要求

1.OsAPx5基因或其蛋白在调控水稻颖壳发育中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过调控水稻中OsAPx5基因的表达水平，使水稻在高温条件下颖壳发育正常。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述调控水稻中 OsAPx5基因的表达水平的方法包括：通过转基因使OsAPx5基因在水稻中过表达，或通过修饰OsAPx5基因的启动子序列来提高该基因的表达水平。

4.OsAPx5基因或其蛋白在水稻颖壳选育中的应用。

5. OsAPx5基因或其蛋白在调控水稻花器官发育中的应用。

6. OsAPx5基因或其蛋白在高温胁迫下水稻品种改良中的应用。

7. 根据权利要求1‑6任一所述的应用，其特征在于，所述OsAPx5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述OsAPx5基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

9. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述OsAPx5基因的启动子序列如SEQ ID NO.3所示。

说明书

颖壳发育相关基因OsAPx5及其蛋白的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程和植物遗传育种技术领域，具体而言，涉及颖壳发育相关基因OsAPx5及其蛋白的应用。

背景技术

[0002] 水稻的颖壳由内颖与外颖组成，分别由内稃、外稃发育而来，是维持颖花结构、籽粒发育的一个重要器官。通常水稻的授粉要在扬花期颖壳顶端分开(开颖)后进行，开颖后闭颖时间的长短对籽粒的发育影响极大，而开颖后不能正常闭颖(裂颖)的颖花往往发育成畸形的籽粒，严重影响籽粒粒重、结实率、稻米品质及种子储存能力。

[0003] 水稻的颖壳发育异常现象主要与品种间的遗传差异有关。大量研究表明，许多颖壳发育有关的基因编码转录因子，如MADS家族相关基因OsMADS1、OsMADS6及OsMADS34、GARP转录因子编码基因OsADD1、C2H2型锌指结构域的蛋白编码基因NSGI等。OsMADS1是控制外稃和内稃中特定细胞类型分化的一个关键基因，该基因的可变剪接突变体内、外稃发育异常，甚至产生裂颖的表型。OsMADS34突变后会造成水稻的护颖外稃化特征，其在水稻颖壳发育中也起着十分重要的作用。OsMADS6基因突变体afg1(abnormal flower and grain 1)表现为内稃失去了其边缘区域，获得了类似外稃的结构。GRAIN LENGTH 10(GL10)编码MADS56转录因子，通过促进水稻籽粒颖壳中更大的纵向细胞生长来调节谷粒长度，从而增加水稻产量。OsADD1编码一个GARP转录因子，通过调节一个花药开裂基因OsCSLD4的表达，影响水稻的裂颖及花药的开裂。SUPERNUMERARY BRACT(SNB)编码AP2转录因子，snb突变体中未发育的颖片数目增加，缺少空的颖片，并额外形成内外稃。此外，NONSTOP GLUMES1(NSGI)基因编码一个C2H2转录因子蛋白，通过与水稻TPR类转录共抑制子结合，再募集组蛋白去乙酰化酶，抑制LHS1/OsMADS1在护颖等侧生器官中的表达，从而维持水稻颖花器官的正常发育。

[0004] 除了转录因子调控水稻颖壳发育外，一些参与植物激素信号途径的基因在水稻颖壳的发育中也起着非常重要的作用。在水稻extra glume1(eg1)突变体中，一个编码JA合成所需的关键酶基因发生了突变，造成花器官数目的改变和额外的颖壳结构的形成。JA合成响应因子编码基因OsJAR1突变后，颖壳在完成授粉后不能按时闭合，导致开裂的花药中的花粉受损从而育性降低，严重影响水稻的产量。在籼稻品种9311通过γ射线诱变获得的开颖(open glume 1，og1)突变体中,基因定位发现8号染色体上的一个JA合成酶编码基因发生突变，造成突变体og1中阅读框移码，翻译时提前终止导致无JA积累，且浆片中碳代谢紊乱，从而产生开颖的表型。

[0005] 在这些决定水稻颖壳发育的基因中，以MADS家族与JA代谢途径相关基因为主，但这些基因的功能均不受外界环境因素的影响。我国主要的水稻产区在孕穗期常常遭遇持续极端高温天气影响，造成大面积减产甚至绝收。水稻颖花在高温条件下发育受阻，严重制约着水稻的籽粒发育及产量。

[0006] 鉴于此，特提出本发明。

发明内容

[0007] 本发明的第一目的在于提供OsAPx5基因或其蛋白在调控植物颖壳发育中的应用，该应用通过调控植物中OsAPx5基因的表达水平，使植物在高温条件下颖壳发育正常。

[0008] 本发明的第二目的在于提供OsAPx5基因或其蛋白在植物颖壳选育中的应用。

[0009] 本发明的第三目的在于提供OsAPx5基因或其蛋白在调控植物花器官发育中的应用。

[0010] 本发明的第四目的在于提供OsAPx5基因或其蛋白在逆境胁迫下植物品种改良中的应用。

[0011] 本发明是这样实现的：

[0012] 本发明实施例提供的OsAPx5基因或其蛋白在调控植物颖壳发育中的应用。

[0013] 在可选的实施方式中，上述应用是通过调控植物中OsAPx5基因的表达水平，使植物在高温条件下颖壳发育正常。

[0014] 在可选的实施方式中，上述调控植物中OsAPx5基因的表达水平的方法包括：通过转基因使OsAPx5基因在植物中过表达，或通过修饰OsAPx5基因的启动子序列来提高该基因的表达水平。

[0015] 本发明对恢复系R225经γ射线诱变处理后，筛选出的一个颖壳发育异常的突变体split rice grain 12(srg12)，该突变体在江西南昌表现为颖壳开裂性状，而在海南三亚则表现为野生型的颖壳正常闭合的性状。经Mut‑Map测序及图位克隆，成功克隆了一个新的调控颖壳发育的基因OsAPx5，该基因编码抗坏血酸过氧化物酶。在现有技术中，OsAPx5基因是水稻中的抗坏血酸过氧化物酶基因，属于OsAPx家族基因中的叶绿体型成员，其是叶绿体中清除过氧化氢的主要酶。

[0016] 而本发明进一步通过遗传转化实验，发现在srg12中过表达OsAPx5可使高温条件下水稻的颖壳恢复为野生型的正常发育，在野生型中分别通过RNA干扰与CRISPR技术降低OsAPx5表达水平及敲除该基因后，颖壳在高温条件下表现为突变体的颖壳开裂、无法闭合现象。这些结果表明OsAPx5基因具有改良高温胁迫下颖壳异常发育的育种应用潜力，同时可用于深入研究抗坏血酸过氧化物酶调控水稻颖壳发育的分子机制。

[0017] 本发明还提供了OsAPx5基因或其蛋白在植物颖壳选育中的应用。

[0018] 基于本发明发现的OsAPx5基因的功能，其可用于植物颖壳选育中。上述植物选育为提高植物颖壳对高温胁迫的耐受性，从而保证逆境条件下作物产量的稳定。

[0019] 本发明还提供了OsAPx5基因或其蛋白在调控植物花器官发育中的应用。

[0020] OsAPx5基因除了上述功能外，本发明还发现其提高植物的花器官对高温胁迫的耐受性，通过调控OsAPx5基因的表达水平，可以维持高温条件下花器官的正常发育。

[0021] 本发明还提供了提供OsAPx5基因或其蛋白在逆境胁迫下植物品种改良中的应用。

[0022] 在可选的实施方式中，上述植物为单子叶植物或双子叶植物；其中单子叶植物包括水稻、小麦、大麦和燕麦；双子叶植物包括番茄和苜蓿。

[0023] 在可选的实施方式中，上述OsAPx5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0024] 需要说明的是，SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为OsAPx5基因的cDNA序列。

[0025] 本发明还包括与OsAPx5基因具有90％以上同源性，优选95％更优选99％以上同源性且编码抗坏血酸过氧化物酶的基因。

[0026] 在可选的实施方式中，上述OsAPx5基因编码的氨基酸序列如(1)或(2)所示：(1)SEQ ID NO.2；(2)有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸得到的且与SEQ ID NO.2具有相同生物活性的衍生序列。

[0027] 应该理解为，在不影响OsAPx5蛋白活性的前提下(即不在蛋白的活性中心)，本领域技术人员可对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。因此，OsAPx5蛋白还包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸获得的具有同等活性的蛋白质。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

[0028] 在可选的实施方式中，上述OsAPx5基因的启动子序列如SEQ ID NO.3所示。

[0029] 本领域技术人员可以替换OsAPx5基因的启动子序列中部分顺式作用元件，或通过其它手段改变启动子活性，从而改变OsAPx5基因表达水平。

[0030] 本发明具有以下有益效果：

[0031] 本发明通过实验证明，OsAPx5基因与水稻的颖壳发育密切相关，这一结论为提高颖花对高温胁迫的耐受性改良的转基因植物奠定基础；OsAPx5基因的成功克隆，进一步证实了抗坏血酸过氧化物酶编码基因家族在水稻生长发育过程中的重要作用，对阐明APx基因家族的生物学功能有重要的意义；同时，本发明克隆的OsAPx5基因能够提高颖花对高温胁迫的耐受性，对进一步阐明植物抗逆的分子机理并通过基因工程手段培育抗逆、优质、高产的作物新品种具有重要的理论意义和现实意义。

附图说明

[0032] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

[0033] 图1为实施例1中是野生型R225与srg12突变体的株型图。A与D为野生型株型与穗型；B与E为srg12突变体种植于江西南昌的株型与穗型；C与F为srg12突变体种植于海南三亚的株型(C)与穗型(F)；G:WT与srg12突变体种植于江西南昌和海南三亚的粒型差异，srg‑JX指srg12突变体种植于江西南昌，srg‑HN指srg12突变体种植于海南三亚，A‑C中标尺为25cm，D‑E中标尺为5cm，G中标尺为0.5cm；

[0034] 图2为实施例1中野生型R225与srg12突变体的农艺性状统计柱状图，WT与srg12突变体种植于江西南昌和海南三亚的株高(A)、穗长(B)、分蘖数(C)、每穗穗粒数(D)、结实率(E)与单株产量(F)性状统计分析，数据采用GraphPad软件进行显著性分析(t‑test)，其中***代表p<0.001。；

[0035] 图3为实施例1中SRG12基因的Mut‑Map测序分析图，红线框显示OsAPx5基因的初步定位区间；

[0036] 图4为实施例1中SRG12基因的图位克隆，IN1‑IN11指不同的Indel标记；

[0037] 图5为实施例2中候选基因的遗传互补验证图。A为在srg12突变体中过表达OsAPx5基因的颖壳表型；B与C分别为在野生型中干扰OsAPx5基因及敲除OsAPx5基因后颖壳的表型，A‑C中标尺均为1cm。

具体实施方式

[0038] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述的重组技术(参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

[0039] 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

[0040] 实施例1

[0041] 本实施例为SRG12基因的克隆，其步骤如下：

[0042] 本发明鉴定到一个水稻颖壳开裂的辐射诱变突变体srg12，相对于野生型R225(WT)，该突变体在江西南昌表现为颖壳开裂性状(图1A‑B、D‑E)，而在海南三亚则表现为WT的颖壳正常闭合性状(图1C与F)，且srg12在江西南昌种植时籽粒中颖壳完全开裂，而在海南三亚则轻微开裂(图1G)。对WT与突变体常见农艺性状进行统计分析，发现srg12突变体株高(图2A)、穗长(图2B)、分蘖数(图2C)及每穗穗粒数(图2D)与WT相比均无显著性差异。srg12突变体种植于江西南昌时结实率与单株产量均显著低于WT，而种植于海南三亚时结实率与单株产量与WT相比并无显著性差异(图2E与F)。

[0043] 从WT与srg12突变体杂交构建的F2群体中，各挑选50株WT表型的单株与srg12异常表型的单株进行Mut‑Map测序，将SRG12基因初步定位于第12号染色体2‑11Mb区间(图3)，通过扩大群体采用分子标记的连锁分析，将SRG12基因定位于12号染色体的3964‑4554kb区间内，结合测序分析结果，该592kb区间内共有5个基因存在单核苷酸变异(SNP)，其中OsAPx5基因的一个SNP造成该基因在srg12突变体中翻译提前终止(图4)，因此将OsAPx5确定为SRG12基因的候选基因。

[0044] 其中，基因定位相关引物序列如下：

[0045] IN1F：5'‑TAGCCACAAGCCACATCAA‑3'(SEQ ID NO.4)

[0046] IN1R：5'‑GAGGCGGTGAAATAACGAG‑3'(SEQ ID NO.5)

[0047] IN2F：5'‑ACCTCTGGCTTGTCTGTGC‑3'(SEQ ID NO.6)

[0048] IN2R：5'‑GGGACATGGGATCTACAACA‑3'(SEQ ID NO.7)

[0049] IN3F：5'‑GTGACTGGCGGATAAGAAG‑3'(SEQ ID NO.8)

[0050] IN3R：5'‑GTGGTGGTCTTGTCCTAACT‑3'(SEQ ID NO.9)

[0051] IN4F：5'‑GCTGACGAGGCGATTGATT‑3'(SEQ ID NO.10)

[0052] IN4R：5'‑TCCGCACTTGTACTTCTCCTT‑3'(SEQ ID NO.11)

[0053] IN5F：5'‑ATGAGTAGTGGAGAGGATAA‑3'(SEQ ID NO.12)

[0054] IN5R：5'‑ATGAAAAAATGTAAGTTGAG‑3'(SEQ ID NO.13)

[0055] IN6F：5'‑GAAGCACCACCGCAAGAGG‑3'(SEQ ID NO.14)

[0056] IN6R：5'‑CGCTGGCAAAGACGCAAAA‑3'(SEQ ID NO.15)

[0057] IN7F：5'‑GTGGTGTAGCCAAGGAGTC‑3'(SEQ ID NO.16)

[0058] IN7R：5'‑GTCAAATGGCATCAAAGTG‑3'(SEQ ID NO.17)

[0059] IN8F：5'‑TTACATCAAAGCGATCAGA‑3'(SEQ ID NO.18)

[0060] IN8R：5'‑CAGCAGGAGTATTCAACGA‑3'(SEQ ID NO.19)

[0061] IN9F：5'‑GAACAATCAAGGCTAACG‑3'(SEQ ID NO.20)

[0062] IN9R：5'‑TTGCCACAAATAAGAACCT‑3'(SEQ ID NO.21)

[0063] IN10F：5'‑TATTTTGCGATTGTGGTCA‑3'(SEQ ID NO.22)

[0064] IN10R：5'‑ATGATGTCCAGTGCTTTGC‑3'(SEQ ID NO.23)

[0065] IN11F：5'‑AGCAGGGCGAAGCTAGGAC‑3'(SEQ ID NO.24)

[0066] IN11R：5'‑TATTCTCGGACCGCTCATTC‑3'(SEQ ID NO.25)。

[0067] 实施例2

[0068] 本实施例为SRG12基因的遗传互补验证，步骤如下：

[0069] 提取水稻R225的总RNA，并将其反转录成cDNA，采用KOD高保真DNA聚合酶以该cDNA为模板，利用引物对：

[0070] 5'‑ACGGGGGACGAGCTCGGTACCATGGCCGTCGTGCACCG‑3'(SEQ ID NO.26)[0071] 5'‑TCGTCGACTCTAGAGGATCCCTATTCAAGTGAAATAC‑3'(SEQ ID NO.27)[0072] 扩增出OsAPx5基因的cDNA序列，通过同源重组技术将OsAPx5基因的cDNA插入pCAMBIA1301‑35S‑NOS载体的多克隆位点5'KpnI/BamHI 3'之间，构建出OsAPx5基因的超表达载体pCAMBIA1301‑35S‑OsAPx5‑NOS。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入srg12突变体中。

[0073] 以R225的cDNA为模板，利用引物对：

[0074] F1：5'‑AGAGGATCCTTGGAAGGGCTGATG‑3'(BamH I)，(SEQ IDNO.28)[0075] R1：5'‑GAGGGTACCCTCGGCGTTCTTTGA‑3'(Kpn I)；(SEQ ID NO.29)[0076] F2：5'‑GATTTTCAGATCGATACTAGTCTCGGCGTTCTTTGA‑3'(SpeI)，(SEQ ID NO.33)[0077] R2：5'‑CGATCGGGGAAATTCGAGCTCTTGGAAGGGCTGATG‑3'(Sac I)；(SEQ ID NO.31)[0078] 分别扩增出OsAPx5基因的cDNA片段，通过限制性内切酶酶切‑连接技术连入RNA干扰载体pTCK303，构建出OsAPx5基因的干扰载体pTCK303‑OsAPx5。采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将该干扰表达载体导入野生型R225中。

[0079] 将经潮霉素溶液筛选48小时得到的所有转基因幼苗移栽于温室中种植，阳性植株单株收种，直至T2代鉴定出纯合的转基因植株，即分别得到OsAPx5基因的干扰株系与OsAPx5超表达株系。

[0080] OsAPx5基因超表达与干扰株系于水稻正常种植季节于田间播种，进行正常的水、肥管理及病虫害防治，于成熟期对不同转基因系的籽粒进行性状考察。如图5所示，在srg12突变体中过表达OsAPx5基因能够使突变体中开裂的颖壳恢复为正常表型，且在野生型中干扰OsAPx5基因的表达能产生突变体的颖壳开裂的表型。

[0081] 进一步根据OsAPx5基因的cDNA序列，选择如下2个靶标进行CRISPR敲除：

[0082] Target 1：GGTGAAGAATGCCCACCTGAGGG(SEQ ID NO.32)

[0083] Target 2：GTGCTCCTGGAGGGCAATCTTGG(SEQ ID NO.33)

[0084] 并进行CRISPR敲除载体的构建及遗传转化，获得OsAPx5基因在R225背景的阳性敲除株系。于成熟期对敲除株系籽粒进行性状考察，发现敲除株系籽粒的颖壳也表现为srg12突变体的颖壳开裂表型(图5)，进一步证明了OsAPx5基因对水稻籽粒颖壳发育的影响。

[0085] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。