一种高山美利奴羊AMH基因CNV标记辅助检测羊毛性状的方法及应用

摘要

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种高山美利奴羊AMH基因CNV标记辅助检测羊毛性状的方法及应用，本发明提供了一种与高山美利奴羊羊毛性状相关的CNV标记，位于高山美利奴羊AMH基因外显子区域chr5：18901101‑18905300，并提供了检测CNV标记的方法：以高山美利奴羊基因组DNA为模板，以引物对P1和P2分别通过qPCR扩增AMH基因的CNV区域以及内参基因，定量高山美利奴羊AMH基因的拷贝数变异；所述方法操作简单，准确可靠。本发明可以检测高山美利奴羊羊毛性状密切相关的CNV标记，用于高山美利奴羊早期选择，提高选种准确性，缩短培育周期，加快培育进程。

权利要求

1.检测高山美利奴羊羊毛净毛率性状相关的CNV标记的试剂在检测高山美利奴羊羊毛净毛率或高山美利奴羊羊毛净毛率性状选育中的应用；所述CNV标记位于高山美利奴羊AMH基因外显子区域chr5：18901101‑18905300，参考序列的GenBank登录号为NC_019462.2；所述试剂扩增所述CNV标记和内参基因ANKRD1；

所述试剂包括CNV标记的扩增引物对P1：

上游引物F1：5'‑AAGCCAGCACCTCCCTACTCC‑3'；

下游引物R1：5'‑CCAGCCTCACTATGCAGAACCAC‑3'；

和内参基因ANKRD1的扩增引物对P2：

上游引物F2：5'‑TCTTGTACCGATTCAGCC‑3'；

下游引物R2：5'‑TTCACTCGTTTATTGGGAT‑3'；

‑ΔΔCt ‑ΔΔCt ‑ΔΔCt

扩增结果根据2×2 法定义拷贝数变异类型：2×2 ＝2为正常型，2×2 >2为‑ΔΔCt

插入型，2×2 <2为缺失型；所述正常型和缺失型的羊毛净毛率显著高于插入型，同时所述正常型的羊毛净毛率显著高于缺失型。

2.一种与高山美利奴羊羊毛净毛率性状相关的CNV标记的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：以高山美利奴羊的基因组DNA为模板，通过QPCR分别扩增高山美利奴羊羊毛净毛率性状相关的CNV标记和内参基因ANKRD1；所述CNV标记位于高山美利奴羊AMH基因外显子区域chr5：18901101‑18905300，参考序列的GenBank登录号为NC_019462.2；

所述CNV标记的扩增引物对P1为：

上游引物F1：5'‑AAGCCAGCACCTCCCTACTCC‑3'；

下游引物R1：5'‑CCAGCCTCACTATGCAGAACCAC‑3'；

所述内参基因ANKRD1的扩增引物对P2为：上游引物F2：5'‑TCTTGTACCGATTCAGCC‑3'；

下游引物R2：5'‑TTCACTCGTTTATTGGGAT‑3'；

‑ΔΔCt ‑ΔΔCt ‑ΔΔCt

根据2×2 法定量结果将拷贝数变异分为三类：2×2 ＝2为正常型，2×2 >2‑ΔΔCt

为插入型，2×2 <2为缺失型；所述正常型和缺失型的羊毛净毛率显著高于插入型，同时所述正常型的羊毛净毛率显著高于缺失型。

3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述QPCR扩增体系包括： Top Green qPCR SuperMix 10μL，上、下游引物各0.4μL，基因组DNA 1μL，Nuclease‑free Water 

8.2μL。

4.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述QPCR所用的反应程序为：(1)预变性：94℃，30s；

(2)扩增反应：94℃，5s；之后58℃，15s；72℃，10s；45个循环；

(3)绘制熔解曲线：95℃，5s，之后从65℃到95℃，+0.5℃，5s。

说明书

一种高山美利奴羊AMH基因CNV标记辅助检测羊毛性状的方法

及应用

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种高山美利奴羊AMH基因CNV标记辅助检测羊毛性状的方法及应用。

背景技术

[0002] 羊毛是指覆盖在羊体表面的一层具有纺织价值的纤维，是皮肤的衍生物。羊毛是毛纺工业的主要原料，约占毛纺原料的97％，主要用来加工服装面料、毛线、毛毯等产品。在羊毛生产和育种实践中，羊毛性状是重要的经济性状，主要包括毛长、产毛量、平均纤维直径、弯曲度、断裂强度、伸度、净毛率等多个指标，与织造产品和经济效益密切相关。由于人口增长，羊毛的需求已经超过了供给。随着市场需求的变化，生产优质羊毛已成为山羊育种的主要目标。

[0003] 高山美利奴羊是以甘肃高山细毛羊为母本，澳洲美利奴羊为父本，综合利用现代先进生物技术和育种技术，经过20年育成的世界首例适应海拔2400～4070m高山寒旱生态区，羊毛纤维直径主体为19.0～21.5μm的美利奴羊新品种。羊毛形状也是决定其经济价值的一项重要指标，并且羊毛形状的客观检验在羊毛销售中越来越受到重视，它与纺织性能、育种和生产三者间结合的越来越紧密。

[0004] 与传统育种方法相比，分子标记辅助选择方法具有许多优势，例如可以明显缩短世代间隔，提高选择准确性，提前选择时间，同时对它低遗传力性状、早期未表现的性状、活体难以度量或者度量难度较大、成本较高的性状，有良好的选择效果。拷贝数变异(Copy Number Variations，CNVs)，作为一种新发现的基因组亚显微水平结构变异类型，是指基因组DNA中较大片段的缺失或重复现象，涉及的片段大小在50bp到数Mb之间，包括拷贝数增加(Copy number gain)和拷贝数减少(Copy number loss)。

[0005] CNV常用的检测方法主要分为在全基因组范围内检测未知CNV和用于定点检测或验证已知CNV两类。基因组未知CNV常用的检测方法有芯片法和测序法，但是，这两种方法受检测平台的局限，而且价格昂贵；对于已确定的CNV的检测，通常是采用基于PCR技术和杂交技术的一些方法。其中，实时荧光定量PCR(QPCR)最为常用。QPCR通过对目的基因(具有拷贝‑ΔΔCt数变异)及参考基因(无拷贝数变异)进行相对定量，根据2 方法统计检测样本候选基因的拷贝数。该方法操作简单，普适度高，速度快，受认同程度高。

[0006] 抗苗勒氏管激素(Anti‑Mullerian hormone，AMH)是由雄性睾丸支持细胞和雌性卵巢颗粒细胞分泌的一种仅在性腺中表达的糖蛋白，是TGFβ超家族(Transforming growth factor beta superfamily，TGFβ超家族)的一员，具有调节细胞分化和发育，促进苗勒氏管退化等作用。同时AMH还可以作为反刍动物超数排卵的预测指标，在反刍动物育种中起到了良好的作用，但目前尚未见有关AMH基因CNV与绵羊羊毛性状的关联性研究的文献报道。

发明内容

[0007] 本发明提供了一种检测高山美利奴羊AMH基因CNV标记的方法及应用，尤其涉及一种基于QPCR技术检测高山美利奴羊AMH基因CNV标记的方法及其应用。具体包括以下内容：

[0008] 第一方面，本发明提供了一种与高山美利奴羊羊毛净毛率性状相关的CNV标记，所述CNV标记位于高山美利奴羊AMH基因外显子区域chr5：18901101‑18905300。

[0009] 第二方面，本发明提供了检测上述第一方面所述高山美利奴羊羊毛净毛率性状相关的CNV标记的试剂在检测高山美利奴羊羊毛净毛率中的应用；所述试剂扩增权利要求1所述CNV标记和内参基因ANKRD1。

[0010] 优选地，所述扩增结果根据2×2‑ΔΔCt法定义拷贝数变异类型：2×2‑ΔΔCt＝2为正常‑ΔΔCt ‑ΔΔCt型，2×2 >2为插入型，2×2 <2为缺失型；所述正常型和缺失型的羊毛净毛率显著高于插入型，同时所述正常型的羊毛净毛率显著高于缺失型。

[0011] 优选地，所述试剂包括权利要求1所述CNV标记的扩增引物对P1：

[0012] 上游引物F1：5'‑AAGCCAGCACCTCCCTACTCC‑3'；

[0013] 下游引物R1：5'‑CCAGCCTCACTATGCAGAACCAC‑3'；

[0014] 和内参基因ANKRD1的扩增引物对P2：

[0015] 上游引物F2：5'‑TCTTGTACCGATTCAGCC‑3'；

[0016] 下游引物R2：5'‑TTCACTCGTTTATTGGGAT‑3'。

[0017] 第三方面，本发明提供了检测上述第一方面所述高山美利奴羊羊毛净毛率性状相关的CNV标记的试剂在高山美利奴羊早期育种中的应用；所述试剂扩增权利要求1所述CNV标记和内参基因ANKRD1。

[0018] 优选地，所述扩增结果根据2×2‑ΔΔCt法定义拷贝数变异类型：2×2‑ΔΔCt＝2为正常‑ΔΔCt ‑ΔΔCt型，2×2 >2为插入型，2×2 <2为缺失型；所述正常型和缺失型的羊毛净毛率显著高于插入型，同时所述正常型的羊毛净毛率显著高于缺失型。

[0019] 优选地，所述试剂包括权利要求1所述CNV标记的扩增引物对P1：

[0020] 上游引物F1：5'‑AAGCCAGCACCTCCCTACTCC‑3'；

[0021] 下游引物R1：5'‑CCAGCCTCACTATGCAGAACCAC‑3'；

[0022] 和内参基因ANKRD1的扩增引物对P2：

[0023] 上游引物F2：5'‑TCTTGTACCGATTCAGCC‑3'；

[0024] 下游引物R2：5'‑TTCACTCGTTTATTGGGAT‑3'。

[0025] 第四方面，本发明提供了一种用于检测与高山美利奴羊羊毛净毛率性状相关的CNV标记的引物对，所述引物对包括上述第一方面所述CNV标记的扩增引物对P1：

[0026] 上游引物F1：5'‑AAGCCAGCACCTCCCTACTCC‑3'；

[0027] 下游引物R1：5'‑CCAGCCTCACTATGCAGAACCAC‑3'；

[0028] 和内参基因ANKRD1的扩增引物对P2：

[0029] 上游引物F2：5'‑TCTTGTACCGATTCAGCC‑3'；

[0030] 下游引物R2：5'‑TTCACTCGTTTATTGGGAT‑3'。

[0031] 第五方面，本发明提供了一种用于QPCR检测权利要求1所述CNV标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有上述第四方面所述的引物对。

[0032] 优选地，所述试剂盒还包括 Top Green qPCR SuperMix、去离子水、对照样本中的一种或几种。

[0033] 第六方面，本发明提供了一种与高山美利奴羊羊毛净毛率性状相关的CNV标记的检测方法，所述方法包括以下步骤：

[0034] 以高山美利奴羊的基因组DNA为模板，通过QPCR分别扩增上述第一方面所述CNV标记和参照基因ANKRD1；

[0035] 根据2×2‑ΔΔCt法定量结果将所述拷贝数变异分为三类：2×2‑ΔΔCt＝2为正常型，2‑ΔΔCt ‑ΔΔCt×2 >2为插入型，2×2 <2为缺失型；所述正常型和缺失型的羊毛净毛率显著高于插入型，同时所述正常型的羊毛净毛率显著高于缺失型。

[0036] 优选地，所述CNV标记的扩增引物对P1为：

[0037] 上游引物F1：5'‑AAGCCAGCACCTCCCTACTCC‑3'；

[0038] 下游引物R1：5'‑CCAGCCTCACTATGCAGAACCAC‑3'；

[0039] 所述内参基因ANKRD1的扩增引物对P2为：

[0040] 上游引物F2：5'‑TCTTGTACCGATTCAGCC‑3'；

[0041] 下游引物R2：5'‑TTCACTCGTTTATTGGGAT‑3'。

[0042] 优选地，所述QPCR扩增体系包括： Top Green qPCR SuperMix 10μL，上、下游引物各0.4μL，基因组DNA 1μL，Nuclease‑free Water 8.2μL。

[0043] 优选地，所述QPCR所用的反应程序为：

[0044] (1)预变性：94℃，30s；

[0045] (2)扩增反应：94℃，5s；之后58℃，15s；72℃，10s；45个循环；

[0046] (3)绘制熔解曲线：95℃，5s，之后从65℃到95℃，+0.5℃，5s。

[0047] 结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：

[0048] 本发明提供了一种高山美利奴羊羊毛净毛率性状相关的CNV标记，所述CNV标记位于高山美利奴羊AMH基因外显子区域chr5：18901101‑18905300；

[0049] 本发明提供了检测CNV标记的方法，以高山美利奴羊的血液全基因组DNA为模板，通过实时荧光定量PCR方法分别扩增高山美利奴羊AMH基因CNV区域，并将ANKRD1基因作为‑ΔΔCt ‑ΔΔCt ‑ΔΔCt参照，2×2 法定量结果将所述拷贝数变异分为三类：2×2 ＝2为正常型，2×2 >
‑ΔΔCt
2为插入型，2×2 <2为缺失型；所述正常型和缺失型的羊毛净毛率更高，所述正常型和缺失型的羊毛净毛率显著高于插入型，同时所述正常型的羊毛净毛率显著高于缺失型；本发明在DNA水平上检测与高山美利奴羊羊毛净毛率性状密切相关的CNV标记，可作为高山美利奴羊羊毛净毛率性状的标记辅助选择的重要候选分子标记；

[0050] 本发明以高山美利奴羊AMH基因的CNV为候选位点，通过实时荧光定量PCR技术检测该位点在高山美利奴羊群体中的拷贝数变异情况，并与羊毛净毛率等重要经济性状进行关联分析；如果检测AMH基因候选位点的拷贝数变异类型为正常型和缺失型，则具有更高的羊毛净毛率，尤其是正常型羊毛净毛率最高；研究该基因CNV并将其与高山美利奴羊重要经济性状关联分析至关重要，可以为我国高山美利奴羊分子育种提供理论依据，便于高山美利奴羊羊毛净毛率性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的高山美利奴羊种群。

[0051] 本发明提供的高山美利奴羊基因的拷贝数变异检测方法，可用于高山美利奴羊的早期选育；检测AMH基因拷贝数变异的方法准确可靠、操作简便；AMH基因拷贝数变异位点的检出，为高山美利奴羊的分子标记辅助选择提供科学依据。

附图说明

[0052] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0053] 图1高山美利奴羊AMH基因的扩增曲线；

[0054] 图2高山美利奴羊AMH基因的溶解曲线；

[0055] 图3内参基因ANKRD1的溶解曲线。

具体实施方式

[0056] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0057] 实施例1检测高山美利奴羊AMH基因CNV标记

[0058] 1.样品采集

[0059] 高山美利奴羊样品来自甘肃省绵羊繁育技术推广站，采集具有生产性能记录的152只高山美利奴羊血样，每只羊静脉采血5mL于加入EDTA‑K2抗凝剂的采血管中，血样采集完毕后迅速混匀，放入含有冰袋的采样箱中暂存，运回实验室后于‑20℃冰箱冷冻保存，用以DNA的提取。每只羊羊毛性状(体侧毛长、羊毛纤维直径、剪毛量、净毛率)记录由甘肃省绵羊繁育技术推广站提供。

[0060] 2.主要试剂及仪器

[0061] EDTA‑K2真空采血管购自江苏宇力医疗器械有限公司；血液基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；NanoDrop2000分光光度计美国Thermo  Fisher Scientific公司； Top Green qPCR SuperMix购自北京全式金生物技术股份有限公司；实时定量荧光PCR仪器仪购自Roche公司。

[0062] 3.血液基因组DNA的提取

[0063] 采用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因组提取试剂盒，从血样中提取基因组DNA，将提取出的DNA置于紫外分光光度计下检测浓度与纯度，浓度＞20ng/μL、OD260/OD280在1.7‑1.9之间即满足实验需要，存放于‑20℃保存备用。

[0064] 4.引物设计

[0065] 参考国际绵羊基因组Oar_v4.0版本第5号染色体(GenBank登录号：NC_019462.2)AMH基因序列为参考序列，利用primer premier5.0软件在CNV区域(chr5：18901101‑18905300)设计一对特异性引物，同时采用相同的方法设计扩增内参基因ANKRD1的部分片段，引物序列信息如表1所示，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

[0066] 表1qPCR引物信息表

[0067]

[0068] 5.实时定量PCR扩增

[0069] qPCR扩增体系20μL： Top Green qPCR SuperMix 10μL，上、下游引物各0.4μL，基因组DNA 1μL，Nuclease‑free Water 8.2μL。

[0070] PCR扩增程序：预变性94℃30s；扩增反应94℃5s，58℃15s，72℃10s，45个循环；绘制熔解曲线95℃5s，从65℃到95℃，+0.5℃5s。

[0071] 通过绘制扩增曲线、溶解曲线确定引物适用于荧光定量PCR分析。其中扩增曲线平滑，表明荧光定量PCR扩增体系和条件合适(结果见图1)；目的基因和内参基因各样本溶解曲线在横坐标相同位置均具有明显的单一峰值，表明扩增产物单一(结果分别见图2和图3)。

[0072] 6.拷贝数变异的计算

[0073] 每个个体分别用目的基因和内参基因的引物进行扩增，并且每个个体设置3个技‑ΔΔCt术重复。根据2×2 方法进行拷贝数的分析。其中ΔΔCt＝(CT目的基因‑CT内参基因)实验组‑(CT目的基因‑CT内参基因)对照组；实验组为待检测有无拷贝数变异的个体样本；对照‑ΔΔCt
组即为已知无拷贝数变异的个体样本，可以采用重测序试验中所选择的参照个体。2 表‑ΔΔCt
示的是实验组目的基因的拷贝数相对于对照组的倍数，根据2×2 将结果分成三类：2×‑ΔΔCt ‑ΔΔCt ‑ΔΔCt
2 ＝2为正常型，2×2 >2为插入型，2×2 <2为缺失型。

[0074] 7.AMH基因CNV与羊毛性状的关联分析

[0075] 采用IBM SPSS Statistics 22软件中一般线性模型分析高山美利奴羊AMH基因拷贝数变异位点与羊毛性状的关联性，各组数据间存在的差异利用LSD多重比较来进行检验，结果以“平均值±标准误”表示。数据处理结果见表2，高山美利奴羊AMH基因拷贝数变异位点与羊毛净毛率具有显著的相关性(p<0.05)，其中正常型的羊毛净毛率显著高于插入型。

[0076] 表2高山美利奴羊AMH基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析

[0077]

[0078] 注：同一行数据间标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，n表示具有相同拷贝数的个体数。

[0079] 总之，以上结果表明AMH基因的拷贝数变异影响高山美利奴羊的羊毛性状，将CNV检测用于开展高山美利奴羊羊毛净毛率的早期选择，缩短培育周期、加快培育进程，降低育种成本，具有很高的应用价值。

[0080] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。