一种PDC抗肿瘤药物及其制备方法与应用

摘要

本发明公开一种PDC抗肿瘤药物及其制备方法与应用，属于抗肿瘤药物技术领域。为了解决喜树碱药物水溶性差，没有靶向性，生物利用度低，会产生很多副反应的技术问题。本发明提供一种PDC抗肿瘤药物，所述PDC抗肿瘤药物是由喜树碱通过连接键与靶向肽连接获得的。本发明提供的PDC抗肿瘤药物具有改善喜树碱药物水溶性，提高化合物的溶解度；将靶向多肽与喜树碱偶联，解决药物靶向性问题，提高药物生物利用度；设计具有可断裂二硫键结构的连接臂连接多肽与药物，解决药物的传递；降低喜树碱药物毒性，减少副作用。

权利要求

1.一种PDC抗肿瘤药物，其特征在于，所述PDC抗肿瘤药物的结构如下：。

2.权利要求1所述的PDC抗肿瘤药物在制备抗癌药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，抗肺癌、抗胰体癌、抗胰尾癌、抗胰头癌和抗脑胶质瘤。

4.权利要求1的PDC抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤如下：步骤1：利用连接化合物3‑(2‑吡啶二硫代)丙酸对靶向肽进行修饰，获得修改后的靶向肽；

步骤2：利用连接化合物3‑(2‑吡啶二硫代)丙酸对喜树碱进行修改，获得修饰后的喜树碱；

步骤3：将步骤1和步骤2获得的物质通过二硫键连接，获得PDC抗肿瘤药物。

说明书

一种PDC抗肿瘤药物及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于抗肿瘤药物技术领域，具体涉及一种PDC抗肿瘤药物及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 近年来，不同的肽被显著用作载体以递送各种抗肿瘤药，并被用作纳米技术中最有前途的治疗性配体之一，以治疗癌症。短肽(例如二肽和三肽)在这方面起着重要作用，因为它们的结构非常小，具有生物相容性，并且易于修饰。诸如环状，α‑螺旋，线性和两亲性的肽可以自组装以形成不同的纳米结构，例如纳米棒，纳米球，纳米管和纳米纤维。这些含有几种抗肿瘤药，如姜黄素，紫杉醇和阿霉素的自组装肽的临床前和临床研究已经成功进行了研究。生理上稳定的二肽比其他肽更具优势，因为它们毒性小且可生物降解。肽‑药物缀合物由于易于制备，经济且用途广泛，在靶向抗癌药物中起着重要的药物递送载体的作用。

[0003] 常规肿瘤药物大多存在水溶性差、代谢不及时等问题，链接靶向多肽后，可改善链接后产物的水溶性，提供了成药性，避免了添加对人体有害或有刺激性的助溶剂，也提高了体外和体内的生物利用度。传统肿瘤药物，随着使用次数增加，肿瘤细胞膜会产生阻碍药物进入细胞的蛋白，使得药物吸收利用率降低，药效下降。链接靶向肽的药物，可通过靶向肽与肿瘤细胞表面特异性受体结合，有效的把药物带入肿瘤细胞内，避免了耐药性的问题。

[0004] 喜树碱(CPT)是从中国珙桐科植物喜树中提取出的一种吲哚类生物碱，对许多实体瘤具有很好的抗肿瘤活性，但是由于其水溶性差，没有靶向性，生物利用度低，会产生很多副反应。

发明内容

[0005] 本发明的目的是为了解决喜树碱药物水溶性差，没有靶向性，生物利用度低，会产生很多副反应的技术问题。

[0006] 本发明提供一种PDC抗肿瘤药物，所述PDC抗肿瘤药物是由喜树碱通过连接键与靶向肽连接获得的。

[0007] 进一步地限定，所述喜树碱的化学式如下：

[0008]

[0009] 进一步地限定，所述连接键为可断裂的二硫键。

[0010] 进一步地限定，所述可断裂的二硫键的结构为 进一步地限定，所述靶向肽为[Arg‑Gly‑Pro‑Asp]n，n≥1的正整数。

[0011] 进一步地限定，靶向肽的结构为

[0012] 进一步地限定，PDC抗肿瘤药物的结构为：

[0013]

[0014] 本发明提供上述的PDC抗肿瘤药物在制备抗癌药物中的应用。

[0015] 进一步地限定，抗癌为抗肺癌、抗胰体癌、抗胰尾癌胰头癌和抗脑胶质瘤。

[0016] 本发明提供上述的PDC抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤如下：

[0017] 步骤1：利用连接化合物SPDP‑COOH对靶向肽进行修饰，获得修改后的靶向肽；

[0018] 步骤2：利用连接化合物SPDP‑COOH对喜树碱进行修改，获得修饰后的喜树碱；

[0019] 步骤3：将步骤1和步骤2获得的物质通过二硫键连接，获得PDC抗肿瘤药物。

[0020] 有益效果：本发明提供的PDC抗肿瘤药物具有改善喜树碱药物水溶性，提高化合物的溶解度；将靶向多肽与喜树碱偶联，解决药物靶向性问题，提高药物生物利用度；设计具有可断裂二硫键结构的连接臂连接多肽与药物，解决药物的传递；降低喜树碱药物毒性，减少副作用。

[0021] 本发明提供了一种喜树碱PDC在抗肿瘤药物中的应用。使用本发明的多肽偶联药物，能够显著提高药物的水溶性，不需要加入有机溶剂助溶。为后续通过改造多肽序列，改善药物水溶液提供一种参考。

[0022] 本发明提供了一种RGPD靶向多肽的制作方法，同时也包括靶向多肽与连接臂及喜树碱的连接工艺。

[0023] 本发明提供了一种含有二硫键的连接臂Linker的制作方法，二硫键在细胞内断裂释放出药物，解决了药物传递问题，提高了药物的生物利用度，也为其他二硫键结构的连接臂开发提供一种思路。

附图说明

[0024] 图1为合成技术路线图；

[0025] 图2为SPDP‑COOH合成后HPLC检测图谱；

[0026] 图3为Mpa(Trt)‑CPT合成后HPLC检测图谱；

[0027] 图4为Mpa(Trt)‑CPT脱保护后HPLC检测图谱；

[0028] 图5为合成终产物(PDC)质谱检测图谱；

[0029] 图6为在细胞系PANC‑1与A549中，JP‑001‑C0在高、中、低浓度下作用三天数据柱状图；

[0030] 图7为在细胞系PANC‑1与A549中，JP‑001‑C3在高、中、低浓度下作用三天数据柱状图；

[0031] 图8为在细胞系MIA中，JP‑001‑C0在高、中、低浓度下作用三天数据柱状图；

[0032] 图9为在细胞系MIA中，JP‑001‑C3在高、中、低浓度下作用三天数据柱状图；

[0033] 图10为在细胞系U251中，JP‑001‑C0在高、中、低浓度下作用三天数据柱状图；

[0034] 图11为在细胞系U251中，JP‑001‑C3在高、中、低浓度下作用三天数据柱状图；

[0035] 图12为在细胞系PANC1与A549中，JP‑001‑C3在高、中、低浓度下作用三天数据柱状图。

具体实施方式

[0036] 合成SPDP‑COOH(3‑(2‑吡啶二硫代)丙酸)

[0037] 称取2,2‑二硫二吡啶33.75g于圆底烧瓶中，加入270ml乙醇搅拌溶解，并加入3.6ml冰乙酸，称8.11g巯基丙酸用180ml乙醇稀释后滴加至反应液，30min内滴加完毕，室温反应5h。真空浓缩除去溶剂，用柱层析分离纯化，流动相二氯甲烷：乙醇＝3:2，(3％冰乙酸)，得到目标收集液。真空浓缩，萃取除去冰乙酸，真空浓缩得12.52g SPDP‑COOH。结果图如图2所示。

[0038] 合成SPDP‑RGPD‑OH

[0039] 称替代度为1.14mmol/g的CTC树脂于反应容器中，加DMF溶胀1h后抽滤。称量氨基酸Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH、DIEA，制作Fmoc‑Asp(OtBu)‑CTC resin，测替代度0.60mmol/g。

[0040] 称量Fmoc‑Asp(OtBu)‑CTC resin 10g，合成规模6mmol，HOBT/DIC为缩合剂，氨基酸按照合成规模摩尔算的3倍量计算，称量氨基酸Fmoc‑Pro‑OH 6.07g、HOBt 2.43g，DIC1.2ml，加入50ml DMF溶解后投入树脂中，反应2h

[0041] 后续重复操作，按照肽序依次连接Fmoc‑Gly‑OH、Fmoc‑Arg(pbf)‑OH、SPDP‑COOH得到肽树脂。按照TFA:Tis:水＝95:2.5:2.5的比例切割肽树脂，甲基叔丁基醚析出、洗涤、干燥得到粗肽。经HPLC纯化、冻干得到3.5g SPDP‑RGPD‑OH。

[0042] 合成Mpa‑CPT

[0043] 称取3.01g CPT(喜树碱)，6.02g 3‑(3‑苯甲硫基)丙酸，0.21g DMAP加入100ml二氯甲烷搅拌溶解，冷却至5℃加入5.4ml DIC，反应0.5h后将反应转移至室温条件下，TLC检测无原料剩余，反应结束。加水淬灭反应，二氯甲烷萃取，5％碳酸氢钠水溶液洗涤、0.1M盐酸水溶液洗涤，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后收集有机相。浓缩除去液体得到固体，用二氯甲烷/石油醚的混合溶液打浆固体，抽滤，干燥得黄色固体5.21g Mpa(Trt)‑CPT。结果如图3所示。

[0044] 向Mpa(Trt)‑CPT固体中加入20ml 50％TFA/DCM(含2％Tis)，室温条件下反应1h，TLC检测无原料剩余，反应结束。真空浓缩除去反应液得到固体，用乙醚打浆固体，抽滤，干燥得黄色固体3.23g Mpa‑CPT。结果如图4所示。

[0045] 合成RGPD‑Mpa‑S‑S‑Mpa‑CPT

[0046] 将0.32g SPDP‑RGPD‑OH用20ml DMF溶解，加入0.17ml DIEA，搅拌状态下向反应液中加入0.25g Mpa‑CPT的DMF溶液，液相监测反应结束。将反应液用水稀释后，通过制备型高效液相使用乙腈和0.1％的三氟乙酸水溶液纯化，冻干后得到0.38gRGPD‑Mpa‑S‑S‑Mpa‑CPT(代号JP‑001‑C3)。结果如图5。

[0047] 英文简写对应中文名称

[0048]

[0049] 实施例1.制备PDC抗肿瘤药物

[0050] 1.结构： (简称JP‑001‑C3)。

[0051] 整体技术路线如图1所示：

[0052] 2.制备方法：

[0053] (1)对巯基丙酸进行化学改造，获得连接化合物SPDP‑COOH：

[0054]

[0055] 二硫键连接臂Linker结构为可断裂的二硫键，二硫键在细胞内断裂，释放出药物[0056] 结构如下：

[0057]

[0058] (2)通过全固相合成靶向肽RGPD或包含RGPD肽序列的树脂，同时用一连接化合物(SPDP‑COOH)对其进行修饰，修饰后的靶向肽具备可以与自由基巯基形成二硫键的功能。

[0059]

[0060] (3)选用的抗肿瘤药物为喜树碱类抗肿瘤药物，用一连接化合物巯基丙酸对喜树碱羟基进行化学修饰，修饰后的该化合物具有裸露的自由基巯基。

[0061]

[0062] (4)用上述修饰过的喜树碱与修饰过的靶向肽，通过二硫键交换获得具有二硫键Linker的PDC药物。

[0063]

[0064] 简写结构：RGPD‑Mpa‑S‑S‑Mpa‑CPT。

[0065] 具体的步骤如下：

[0066] 1.靶向多肽RGPD制作技术方案如下：

[0067] 采用全固相合成的方法法合成多肽RGPD，固相载体选择取代度在0.2‑1.5mmol/g的王树脂或者CTC树脂，采用Fmoc‑策略合成多肽合成肽树脂。缩合剂采用HOBT/DIC或TBTU/DIEA，其中优选缩合剂HOBt/DIC

[0068]

[0069] 2.巯基丙酸改造技术方案如下：

[0070]

[0071] 疏基丙酸与二硫二疏基吡啶溶解在有机溶剂中，在醋酸催化条件下反应，经纯化后，得到带有活性二硫键位点的化合物(b)SPDP‑COOH，用于二硫键交换反应所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、二氯甲烷，作为优选选择乙醇。

[0072] 3.靶向肽的修饰技术方案如下

[0073]

[0074] 将所得化合物(b)通过固相法连接到多肽树脂中间体(a)上，通过TFA裂解切割，HPLC纯化后，得到(c)SPDP‑RGPD‑OH。

[0075] 4.喜树碱化学修饰技术制作Mpa‑CPT如下：

[0076]

[0077] 上述结构Mpa‑CPT制作方法包括：

[0078] (1)喜树碱与3‑(三苯甲硫基)丙酸在溶剂中溶解，在DMAP催化条件及缩合剂条件下，制作得化合物(d)，所述溶剂包括DMF、吡啶、二氯甲烷、NMP、DMSO中的一种或两种混合溶液，作为优选，选择二氯甲烷。

[0079] 所述缩合剂包括DCC、EDC、DIC、EEDQ中的一种，作为优选，选择DIC。

[0080] (2)化合物(c)在有机溶剂中溶解，再加入一定浓度的三氟乙酸、Tis条件下脱除Trt保护基得到化合物(e)所述有机溶剂包括二氯甲烷、乙酸乙酯、1,4‑二氧六环，作为优选，选择二氯甲烷所述三氟乙酸浓度在10％‑90％之间，优选50％Tis浓度在1％‑10％，优选2％。

[0081] 5.PDC药物化合物通过二硫键交换

[0082]

[0083] 化合物c与化合物e在碱性条件下，通过二硫键交换制作化合物f，在经过制备液相纯化获得化合物f(RGPD‑Mpa‑S‑S‑Mpa‑CPT，代号JP‑001‑C3)。所述碱性条件包括DMF、DIEA、Et3N、NMM，碳酸氢钠中的一种或混合溶液，作为优选，选择DMF与DIEA的混合溶液。

[0084] 利用以下实验验证实验效果：

[0085] 一、JP‑001‑C3急性毒性试验

[0086] 实验1：

[0087] 一、试验目的：确认JP‑001‑C3与喜树碱的毒性强弱

[0088] 二、试验原理：以半数致死量(LD50)来衡量，通过对动物静脉或腹腔注射试验材料或其浸提液来观察实验动物体重在1周内的变化、运动、呼吸状态以及死亡情况作为评价的指标，判定供试材料的急性毒性作用。小鼠腹腔注射喜树碱的半数致死量为68.4‑83.6mg/kg，将JP‑001‑C3药物换算成喜树碱的给药剂量给药。按小鼠体重20mg计算给药量。给药剂量如表1所示：

[0089] 表1

[0090]样品名称 分子量(g/mol) 摩尔量(mmol) 重量(mg)
喜树碱(JP‑001‑C0) 348.34 0.00861 3
JP‑001‑C3 966.05 0.00861 8.32

[0091] JP‑001‑C3(批号D20210916)30.60mg，用生理盐水配制成20mg/ml。

[0092] 三、试验步骤：

[0093] 1.将称重后的健康、未做过其他实验的小鼠随机分为实验组和对照组，每组3只。

[0094] 2.将不同浓度的供试品溶液腹腔注射于实验组小鼠。

[0095] 3.记录注射后7天各组小鼠的体重，观察其各种生物学反应情况。

[0096] 四、评价方法

[0097] 注射后动物反应观察指标如表2所示：

[0098] 表2

[0099]

[0100] 实验结果如表3所示：

[0101] 表3

[0102]

[0103] 结论：喜树碱(JP‑001‑C0)与文献记录的毒性相当，小鼠单次给药恢复期至少4天。JP‑001‑C3的毒性明显小于喜树碱(JP‑001‑C0)。285mg/kg无死亡，初期小鼠受影响，体重增长缓慢，一周后恢复。

[0104] 给药剂量如表4所示：

[0105] 表4

[0106]样品名称 分子量(g/mol) 摩尔量(mmol) 20mg小鼠给药量
喜树碱(JP‑001‑C0) 348.34 0.0048 1.67mg
JP‑001‑C3 966.05 0.0048 4.64mg

[0107] 结果如表5所示：

[0108] 表5

[0109]

[0110] 结果：JP‑001‑C3给药量在300mg/kg时，小鼠状态良好。本发明的JP‑001‑C3的毒性明显降低，按喜树碱半数致死量的上限给药未出现小鼠死亡。

[0111] 二、药效实验：

[0112] 1.试验所用细胞系：

[0113] A549：人非小细胞肺癌细胞；

[0114] BxPC‑3：人原位胰腺腺癌细胞(胰体癌细胞)；

[0115] MIA PaCa‑2：人胰腺癌细胞(胰尾癌细胞)；

[0116] PANC‑1：人胰腺癌细胞(胰头癌细胞)；

[0117] U251：人脑胶质瘤细胞；

[0118] 2.试验方法：设置三个浓度，分别为H、M、L如表6所示。

[0119] 表6

[0120] 浓度 JP‑001‑C3 喜树碱(JP‑001‑C0)低浓度(ug/ml) 36.2 13.1
中浓度(ug/ml) 72.4 26.1
高浓度(ug/ml) 144.8 52.5

[0121] 试验对照组：不加药物正常培养的细胞。

[0122] 3.试验步骤：

[0123] (1)在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔，5000细胞/孔),将培养板放在培养箱中预培养(37℃,5％ CO2)；

[0124] (2)培养过夜后测定第0天OD值；

[0125] (3)将加药组的正常培养基弃掉，换有待测药物的培养基，将培养板放在培养箱中培养(37℃,5％ CO2)；

[0126] (4)根据时间依次测定第一天至第三天的OD值(每孔扣入10μL CCK8溶液)[0127] (5)将培养板在培养箱内孵育3小时。

[0128] (6)用酶标仪测定在450nm处的吸光度

[0129] 结果：同一药物对不同细胞作用三天的效果如下(a)试验细胞：PANC‑1和A549[0130] JP‑001‑C0试验数据如表7所示和图6所示：

[0131] 表7

[0132]

[0133] JP‑001‑C3试验数据如表8所示和图7所示：

[0134] 表8

[0135]

[0136]

[0137] 结果证明三种不同浓度的JP‑001‑C3样品对两种细胞均有抑制作用，不同浓度条件下的抑制效果差别不大。

[0138] (b)试验细胞：MIA‑PaCa‑2

[0139] JP‑001‑C0试验数据如表9所示和图8所示：

[0140] 表9

[0141]

[0142] JP‑001‑C3实验数据如表10所示和图9所示：

[0143] 表10

[0144]

[0145] 结果证明：JP‑001‑C3对MIA细胞系呈现明显的抑制作用，且三种浓度下的抑制效果相似。

[0146] (c)试验细胞：U251

[0147] JP‑001‑C0试验数据如表11所示和图10所示：

[0148] 表11

[0149]

[0150]

[0151] JP‑001‑C3实验数据如表12所示和图11所示：

[0152] 表12

[0153]

[0154] 结果证明：JP‑001‑C3在三种浓度下对U251均有明显的抑制作用，且抑制效果随浓度的降低略有减弱。

[0155] (d)试验细胞：PANC‑1、A549

[0156] JP‑001‑C3实验数据如表13所示和图12所示：

[0157] 表13

[0158]

[0159] 结果证明：JP‑001‑C3在H、M、L浓度下对两种细胞系均存在抑制作用，且抑制效果随浓度的降低而减弱。(吸光值越高表示存活的细胞越多)

[0160] 对比例1.

[0161] 喜树碱通过连接键连接的不同类型的靶向肽获得的化合物如表12所示：

[0162] 表12

[0163]序号 编号 肽序/结构
1 C2 RGPD‑S‑S‑CPT
2 C3 RGPD‑Mpa‑S‑S‑Mpa‑CPT
3 C4 c[CDGRRGDC]‑Mpa‑S‑S‑Mpa‑CPT

[0164] 1、C2急毒试验

[0165] 实验对象：小鼠

[0166] 与C3等物质量给药

[0167] 结果：先少食少动，个别拉稀，后不食、不动、眼睑下垂，体重下降，第3天死亡1只，第6天全部死亡。

[0168] 结论：毒性大，安全性差，无法成药。该结构失败

[0169] 说明：该试验，由于小鼠反应剧烈，陆续死亡，未记录体重数据。

[0170] 2、C3、C4药效对比试验

[0171] 本次试验所用细胞系：A549、PANC‑1

[0172] 实验步骤：

[0173] 2.1.在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔，5000细胞/孔),将培养板放在培养箱中预培养(37℃,5％ CO2)；

[0174] 2.2.培养过夜后测定第0天OD值；

[0175] 2.3.将加药组的正常培养基弃掉，换有待测药物的培养基，将培养板放在培养箱中培养(37℃,5％ CO2)；

[0176] 2.4.根据时间依次测定第一天至第三天的OD值(每孔扣入10μL CCK8溶液)；

[0177] 2.5.将培养板在培养箱內孵育3小时；

[0178] 2.6.用酶标仪测定在450nm处的吸光度如表13所示。

[0179] 表13

[0180]

[0181]

[0182] 结论：C4与C3相比较，结构上将原靶向肽更换为自行设计的环状靶向肽，其作用效果与C3相似，但未体现出优势，反而抑制效果略微低于C3。