培养组合物及其在培养免疫细胞中的应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及培养组合物及其在培养免疫细胞中的应用。本发明提供了组分1和/或组分2在培养免疫细胞中的应用；所述组分1包括IL‑21；所述组分2包括CD3和重组人纤维连接蛋白。本发明通过添加诱导因子，改变激活细胞方式，研究一种新型细胞培养的方法，制备了新型刺激细胞增殖的配方，增加诱导辅助性CD4+T细胞的分化，获得混合型T细胞，增强INF‑γ分泌能力，延缓免疫细胞耗竭，保持细胞增殖速率，提高肿瘤细胞杀伤能力，培养出具有更好的杀伤实体肿瘤作用的混合型免疫T细胞。该细胞培养方法由可以延伸至其他的相同类型的细胞中刺激培养，可达到更好的降低耗竭细胞的比例，并发挥更好的杀伤肿瘤的作用。

权利要求

1.培养组合物，其特征在于，所述培养组合物由培养基和包被液组成；所述培养基由基础培养基、IL‑21和IL‑2组成；所述包被液由CD3抗体和重组人纤维连接蛋白组成；

所述IL‑21的浓度为10 50ng/mL；

~

所述CD3抗体的浓度为5μg/mL；

所述重组人纤维连接蛋白的浓度为10μg/mL；

所述IL‑2的浓度为1000单位/mL。

2.如权利要求1所述的培养组合物在培养免疫细胞中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，包括但不限于以下任意一项：（I）、增加诱导辅助性CD4+T细胞的分化；和/或（II）、增强INF‑γ分泌能力；和/或（III）、延缓免疫细胞耗竭；和/或（IV）、保持免疫细胞增殖速率；和/或（V）、制备提高肿瘤细胞杀伤能力的制剂或药物。

4.免疫细胞的制备方法，其特征在于，取免疫细胞与如权利要求1所述培养组合物中的所述培养基混合，接种至经如权利要求1所述培养组合物中的包被液包被的培养载体，培养，获得所述免疫细胞。

6

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述接种的密度为1×10个/mL。

6.如权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述培养的时间为24 360h，温度为~

37℃。

说明书

培养组合物及其在培养免疫细胞中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及培养组合物及其在培养免疫细胞中的应用。

背景技术

[0002] 手术，放疗和化疗是癌症治疗的三大基石，可迅速清除大量的肿瘤细胞，降低体内肿瘤细胞负荷，但实际上任何一种单一疗法都无法彻底清除体内癌细胞。长期放射治疗会导致患者出现恶心、呕吐等不良反应。分子靶向药物治疗，在使用及疗效上也具有一定的局限性。

[0003] 近年来，生物免疫治疗在肝癌治疗领域体现出一定的疗效。随着免疫学与分子生物学的发展，过继性免疫细胞治疗逐渐成为恶性肿瘤免疫治疗研究的趋势。过继细胞免疫治疗作为一种新型治疗手段，受到越来越多的关注，尤其对于晚期转移病人或重症病人，是延长生存时间、提高生存质量的重要手段。

[0004] 过继性免疫细胞治疗(Adoptive Cell Transfer Therapy,ACT)是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，增加防御细胞的兵力，或者是对免疫细胞进行改造，使其成为靶向性杀伤功能增强的超级警察细胞，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力。免疫细胞治疗技术具有疗效好、不良反应少或无、无耐药性等显著优势，近年来发展迅速，被誉为继外科手术、药物治疗、放射治疗后最有前景的肿瘤治疗技术之一。免疫细胞包括人体的T细胞、NK细胞、B细胞、DC(树突状细胞)细胞等，是人体的防卫军。

[0005] 目前，为了使过继免疫细胞具有更好的临床获益，得到具有更好的持久性杀伤肿瘤能力的T细胞，研究者们做了多种尝试。其中主要可以分为以下几类：1、改变T细胞外共刺激结构域的类型，降低免疫原性而增加细胞存活持久性；2、通过在培养基中添加细胞因子、抗氧化剂等，抑制效应器分化或免疫抑制细胞产生，促进TSCM及记忆细胞亚群的扩增比例，提高细胞的持久性；3、输注T细胞产品前，对患者进行淋巴清除，减少或清除调节性T细胞和其他免疫抑制细胞，增加细胞的扩增能力和持久性。过继性免疫细胞治疗主要包括TIL、LAK、CD3AK、CIK、DC、NK、TCR‑T、CAR‑T等几大类。

[0006] 体外应用白细胞介素2(IL‑2)活化、扩增可获得自体或同种具有抗瘤活性的效应细胞被称为LAK细胞。将LAK细胞回输给肿瘤患者能产生一定的杀伤活性，杀伤瘤谱较广泛，且不损伤正常的淋巴细胞。最早使用的LAK细胞疗法虽然在肾癌患者体内产生一定疗效，但由于其体外扩增和体内维持需要大剂量IL‑2，会造成大量的副作用，而且对于许多病患的反应性有限。

[0007] CD3AK疗法是在LAK的基础上建立的细胞疗法。它使用肿瘤患者的外周淋巴细胞，体外在抗CD3单抗与IL‑2的共同刺激下活化增殖，产生以 CD3+CD8+T细胞为主的杀伤细胞群，回输到患者体内治疗肿瘤得到了一些良好的效果。研究报道CD3AK疗法能延长肝癌患者生存率，两年生存率约为 33％。CD3AK疗法可以获得比LAK细胞治疗多的效应细胞，而且不需大量 IL‑2的维持，副作用也相对出现少，这种方法也被临床应用。

[0008] CIK细胞是由多种细胞因子诱导的杀伤细胞，相比CD3AK又增加了更多的细胞因子。它是人外周血单个核细胞在体外经多种细胞因子如IL‑2、IFN‑γ和CD3单克隆抗体等诱导而成的具有杀伤多种肿瘤活性的细胞毒性T细胞。 CIK细胞的增殖速度较LAK和CD3AK细胞有了更大地提高，具备更强的杀瘤活性，而且其体内杀伤活性的维持不必依赖大剂量外源性IL‑2的持续给予。 CIK疗法在临床治疗实体肿瘤也取得了一定的效果。但目前国内应用的CIK 细胞培养方法，在培养2周时，细胞的体外扩增倍数大多不超过100倍，未能获得能够进一步提高临床治疗有效率的细胞数量。

[0009] TIL细胞是一种淋巴细胞称为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，它是一种新型的抗肿瘤效应细胞。由于肿瘤微环境的复杂，TIL并不能发挥较好的杀伤肿瘤效果。所以通过拿出癌组织，切碎将癌组织中的T细胞拿到体外进行扩增，回输到体内。此类细胞虽能发挥一定的杀伤肿瘤的效果，但是由于细胞来源于肿瘤组织，此类T细胞培养数量受到大大限制，而且回输后有增加癌症负荷的风险。

[0010] TCR‑T(T‑cell‑receptor T cell)以及CAR‑T(Chimeric Antigen Receptor T cell)细胞通过增加T细胞的识别能力，增强了T细胞的靶向性，然而由于都采用了基因编辑的手段处理细胞，使得细胞更容易耗竭，并且通常存在on‑target/off‑tumor的效应，容易引起强烈的细胞因子风暴等，增加了副作用的产生。另外，基因编辑脱靶效应所导致的其他副反应仍不清晰。

[0011] 目前，对于过继性免疫细胞治疗领域，从安全性上表明，CIK细胞的安全性明显较其他细胞类型更好，且具有较为广泛的杀伤瘤谱。然而，目前CIK 细胞培养方案中，细胞毒性T细胞的增殖能力有限，肿瘤杀伤能力相对较弱。马洁教授通过在CD3AK细胞中加入Retronectin，研制出一款RAK细胞，大大提高了细胞毒性T细胞的增殖能力，使原本只能扩增100倍的CD3AK达到扩增500倍左右的程度，然而，在RAK细胞产品中，IL‑2作为诱导激活T 淋巴细胞增殖的主要细胞因子，除具有促进细胞毒性T淋巴细胞增殖及刺激细胞二次增长的作用外，同时也会诱导Treg细胞的增殖分化。然而，大量研究报道Treg细胞具有免疫抑制作用，在一定程度上会抑制免疫细胞的肿瘤杀伤能力。与其他的免疫细胞治疗技术相似，RAK细胞耗竭快，持续作用时间短、肿瘤杀伤能力有限，此问题依然是过继性免疫细胞治疗的关键瓶颈，有待进一步突破。

[0012] 研究认为，在慢性抗原刺激下，T细胞干性和耗竭同时共存于细胞发展过程中。干性T细胞具有自我更新、多能性和功能持久性；而T细胞耗竭则会导致细胞效应器功能丧失，在细胞增殖和细胞因子产生方面表现出严重缺陷。而在免疫细胞中，原始T细胞和一些记忆T细胞亚群具有干细胞特性，许多研究均支持记忆T细胞分化的渐进模型为原始T细胞‑记忆干细胞‑中央记忆细胞‑效应记忆细胞；细胞干性越强，则细胞耗竭越慢。另外，越来越多的研究显示，在免疫T细胞中，虽然表达CD8分子的毒性T淋巴细胞虽然发挥着主要的溶解靶细胞的作用，但是辅助性T细胞同样具有非常重要的辅助杀伤的能力。CD4+T细胞是效应T细胞的重要成分，根据所产生的细胞因子和效应细胞的生物功能特征，又可将其分为Th1、Th2、Treg、Th17、Th22和Tfh等。研究表明，Th1细胞可分泌IFN‑γ和IL‑2，进一步活化CD8+T细胞，促进细胞免疫；而Th2、Treg细胞等反而容易引起免疫抑制，促进肿瘤的发生发展。幸运的是，我们前期研究显示在我们所培养的免疫细胞中，在CD4+T细胞中 Th1细胞占多数，而其他如Th2、Treg等细胞比例较小。

[0013] 综上，我们需要一种新的刺激免疫T细胞增殖的配方，在保证机体安全性的情况下，达到更好的杀伤实体肿瘤的作用。

发明内容

[0014] 有鉴于此，本发明提供了培养组合物及其在培养免疫细胞中的应用。本发明通过添加诱导因子，改变激活细胞方式，研究发明了一种新型的细胞培养的方法，制备了新型刺激细胞增殖的配方，增加诱导辅助性CD4+T细胞的分化，获得混合型T细胞，增强INF‑γ分泌能力，延缓免疫细胞耗竭，保持细胞增殖速率，提高肿瘤细胞杀伤能力，以培养出具有更好的杀伤实体肿瘤作用的混合型免疫T细胞。该细胞培养方法由可以延伸至其他的相同类型的细胞中刺激培养，可以达到更好的降低耗竭细胞的比例，并发挥更好的杀伤肿瘤的作用。

[0015] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0016] 本发明提供了组分1和/或组分2在培养免疫细胞中的应用；

[0017] 所述组分1包括IL‑21；

[0018] 所述组分2包括CD3和重组人纤维连接蛋白。

[0019] 在本发明的一些实施方案中，上述应用，包括但不限于以下任意一项：

[0020] (I)、增加诱导辅助性CD4+T细胞的分化；和/或

[0021] (II)、增强INF‑γ分泌能力；和/或

[0022] (III)、延缓免疫细胞耗竭；和/或

[0023] (IV)、保持免疫细胞增殖速率；和/或

[0024] (V)、制备提高肿瘤细胞杀伤能力的制剂或药物。

[0025] 本发明还提供了培养组合物，上述培养组合物包括培养基和包被液；所述培养基包括基础培养基和IL‑21；所述包被液包括CD3和重组人纤维连接蛋白。

[0026] 在本发明的一些实施方案中，上述培养组合物中所述IL‑21的浓度为 10～50ng/mL。

[0027] 在本发明的一些实施方案中，上述培养组合物中所述IL‑21的浓度为 50ng/mL、30ng/mL或10ng/mL。

[0028] 在本发明的一些实施方案中，上述培养组合物中所述基础培养基包括 GT‑T551‑H3培养基。

[0029] 在本发明的一些实施方案中，上述培养组合物还包括IL‑2或血浆。

[0030] 在本发明的一些实施方案中，上述培养组合物中所述IL‑2的浓度为1000 单位/mL。

[0031] 在本发明的一些实施方案中，上述培养组合物中所述CD3的浓度为 5μg/mL。

[0032] 在本发明的一些实施方案中，上述培养组合物中所述重组人纤维连接蛋白的浓度为10μg/mL。

[0033] 本发明还提供了上述培养组合物在培养免疫细胞中的应用。

[0034] 本发明还提供了免疫细胞的制备方法，取免疫细胞与上述培养组合物中的所述培养基混合，接种至经上述培养组合物中的包被液包被的培养载体，培养，获得所述免疫细胞。

[0035] 在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述免疫细胞为T淋巴细胞或RAK细胞。

[0036] 在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述混合后，所述接种前，还包括与血浆混合的步骤。

[0037] 在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述血浆的制备方法包括以下步骤：取外周血离心，收集上清，灭活后，获得所述血浆。

[0038] 在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述免疫细胞的制备方法包括以下步骤：

[0039] S1：取外周血离心后，取下层细胞稀释后，获得稀释液；

[0040] S2：取所述稀释液与细胞分离液混合，离心，去上清后，取中间白膜层，获得所述免疫细胞。

[0041] 在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S1中所述离心的转速为 2200rpm，时间为20min。

[0042] 在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S1中所述稀释采用氯化钠溶液，所述氯化钠溶液与下层细胞的体积比为1:1。

[0043] 在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述稀释液与所述细胞分离液的体积比为1:1。

[0044] 在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述离心的转速为 2000rpm，时间为20min，温度为15～25℃。

[0045] 在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述离心的升速为1，降速为0。

[0046] 在本发明的一些实施方案中，上述制备方法S2中所述取中间白膜层还包括清洗的步骤，所述清洗采用生理盐水。

[0047] 在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述清洗的转速为 1400～1500rpm，时间为8min，温度为15～25℃，次数不少于3次。

[0048] 在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述接种的密度为1×106个/mL。

[0049] 在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述培养的时间为 24～360h，温度为37℃。

[0050] 在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述培养包括第一培养～第八培养。

[0051] 在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述第一培养的时间为自第24h至第72h，温度为37℃。

[0052] 在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述第二培养的时间为自第72h至第120h，温度为37℃。

[0053] 在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述第三培养的时间为自第120h至第168h，温度为37℃。

[0054] 在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述第四培养的时间为自第168h至第216h，温度为37℃。

[0055] 在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述第五培养的时间为自第216h至第264h，温度为37℃。

[0056] 在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述第六培养的时间为自第264h至第288h，温度为37℃。

[0057] 在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述第七培养的时间为自第288h至第336h，温度为37℃。

[0058] 在本发明的一些实施方案中，上述制备方法中所述第八培养的时间为自第336h至第360h，温度为37℃。

[0059] 具体的，本发明提供的免疫细胞的制备方法，包括以下步骤：

[0060] S1：取外周血离心后，收集上层灭活，获得灭活后的自体血浆；收集下层稀释，获得血细胞；

[0061] S2：取所述血细胞与淋巴细胞分离液混合，2000rpm，15～25℃离心， 1400～1500rpm，15～25℃清洗后，获得淋巴细胞；

[0062] S3：取所述淋巴细胞接种于上述包被液包被的培养载体中，培养，获得所述免疫细胞；

[0063] S3中所述培养采用包括10～50ng/mL的IL‑21和基础培养基，时间为 24～360h。

[0064] 本发明还提供了药物或制剂，包括上述制备方法获得的免疫细胞。

[0065] 本发明提供了组分1和/或组分2在培养免疫细胞中的应用；

[0066] 所述组分1包括IL‑21；

[0067] 所述组分2包括CD3和重组人纤维连接蛋白。

[0068] 本发明的有益效果包括：

[0069] (1)本发明通过添加诱导因子，改变激活细胞方式，研究发明了一种新型的细胞培养的方法，制备了新型刺激细胞增殖的配方，增加诱导辅助性 CD4+T细胞的分化，获得混合型T细胞，增强INF‑γ分泌能力，延缓免疫细胞耗竭，保持细胞增殖速率，提高肿瘤细胞杀伤能力，以培养出具有更好的杀伤实体肿瘤作用的混合型免疫T细胞。该细胞培养方法由可以延伸至其他的相同类型的细胞中刺激培养，可以达到更好的降低耗竭细胞的比例，并发挥更好的杀伤肿瘤的作用。

[0070] (2)本发明保留CD3+CD8+T细胞的高倍扩增能力。本发明通过保留使用Retronectin以及CD3单抗作为包被激活液的一部分，使免疫细胞在初期得到充分的激活。Retronectin是重组人纤维连接蛋白片段，包括细胞结合域，肝磷脂结合域和CS1位点三个功能区域，由574个氨基酸组成，分子量63kDa。 Retronectin特异性单克隆抗体为捕捉抗体，并且将其包被于微孔板，方便刺激淋巴细胞，使其获得激活增殖。CD3为在T细胞上发现的一次跨膜蛋白，有四种亚型即CD3D,CD3E,CD3G和CD3Z,其CD3D/CD3E,CD3G/CD3E为异源二聚的形式和TCR的α链和β链形成TCR‑CD3复合物。抗原呈递细胞 (APC)呈递的特异性MHC多肽复合物能够和TCR‑CD3复合物，诱导T细胞的激活。CD3抗体与细胞膜上CD3抗原结合后，会刺激淋巴细胞激活。

[0071] (3)本发明通过添加IL‑2和IL‑21保持了细胞活率，或使细胞活率增高，增强肿瘤杀伤能力。IL‑2、IL‑21均是γ‑chain细胞因子家族主要成员，共同享用同一个γ‑chain受体，因此在激活下游通路时具有许多相似或重叠功能。不同于IL‑2主要促进效应细胞快速增殖和蛋白合成，IL‑21的不同在于跟受体复合物与STAT3的亲和力；使它在调节记忆T细胞的维持和发展方面更好。在对Treg细胞的影响方面，IL‑2对Treg细胞具有较强的刺激增殖的作用，远远高于IL‑21。通过在培养基中加入一定剂量的IL‑21，使IL‑21与IL‑2竞争γ‑chain 受体，在共同刺激细胞增殖的情况下，诱导CD4+T细胞更多的分化而减少 Treg细胞的产生，促进细胞分泌INF‑γ，增强细胞杀伤能力。与此同时，降低了细胞耗竭的比例。

[0072] (4)如原理图(图1)中所示，本发明通过同时扩增CD4+T细胞与CD8+ T细胞，即维持了CD8+T细胞的杀伤功能，同时通过CD4+T细胞分泌INF‑γ因子，一方面二次刺激CD8+T细胞的增殖，CD8+T细胞通过抗原抗体识别作用，发挥溶细胞作用，达到更持久杀伤靶细胞的效果。另一方面通过与肿瘤细胞中的受体结合直接诱导靶细胞凋亡。肿瘤杀伤能力得到进一步提升。

[0073] (5)现有技术与本发明技术对比如下表所示；

[0074]CIK RAK 本发明
扩增倍数100倍 扩增倍数500倍 扩增倍数500倍
30:1效靶比杀伤率低 30:1效靶比杀伤率低 30:1效靶比杀伤率高
INF‑γ分泌量低 INF‑γ分泌量中 INF‑γ分泌量高
辅助性CD3+CD4+T细胞少 辅助性CD3+CD4+T细胞少 辅助性CD3+CD4+T细胞高

附图说明

[0075] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

[0076] 图1示诱导增殖混合型T细胞杀伤靶细胞示意图；

[0077] 图2示对比例与实施例细胞表面抗体流式检测结果；其中a图示对比例1中 CD3+CD8+表达的细胞比例检测结果；b图示对比例1中CD3+CD4+表达的细胞比例检测结果；c图示实施例1中CD3+CD8+表达的细胞比例检测结果；d图示实施例1中CD3+CD4+表达的细胞比例检测结果；e图示实施例2中CD3+CD8+ 表达的细胞比例检测结果；f图示实施例2中CD3+CD4+表达的细胞比例检测结果；g图示对比例2中CD3+CD8+表达的细胞比例检测结果；h图示对比例2中 CD3+CD4+表达的细胞比例检测结果；i图示对比例3中CD3+CD8+表达的细胞比例检测结果；j图示对比例3中CD3+CD4+表达的细胞比例检测结果；k图示实施例3中CD3+CD8+表达的细胞比例检测结果；l图示实施例3中CD3+CD4+ 表达的细胞比例检测结果；

[0078] 图3示对比例3与实施例3细胞培养不同天数细胞密度检测结果；其中：A 示对比例3细胞密度变化折线图；B示实施例3细胞密度变化折线图；

[0079] 图4示对比例与实施例细胞与靶细胞共培养后靶细胞活率、对比例与实施例细胞分泌INF‑γ浓度；其中：a图示肿瘤杀伤率，A示对比例1，B示实施例1； b图示IFN‑γ释放量，A示对比例1，B示实施例1；c图示肿瘤杀伤率，A示对比例2，B示实施例2；d图示IFN‑γ释放量，A示对比例2，B示实施例2；e图示肿瘤杀伤率，A示对比例3，B示实施例3；f图示IFN‑γ释放量，A示对比例3， B示实施例3；

[0080] 图5示对比例3与实施例3细胞与靶细胞共培养后镜下细胞状态；其中：A 组示对比例3靶细胞与所培养免疫细胞共培养后，靶细胞状态图；B组示实施例3靶细胞与所培养免疫细胞共培养后，靶细胞状态图。

具体实施方式

[0081] 本发明公开了培养组合物及其在培养免疫细胞中的应用。

[0082] 应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。

[0083] 术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。

[0084] 应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。

[0085] 本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。

[0086] 此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或 0.5％之内。

[0087] 本发明提供了免疫细胞的制备方法，包括以下步骤：

[0088] (1)采集人体外周血，按照如下步骤分离外周血单个核细胞与自体血浆。

[0089] 1)制备自体血浆：将采集的外周血转移至50mL离心管中，将外周血 2200rpm(1000g)，离心20min，分为上下两层，上层为自体血浆、下层为血细胞。用移液管吸出上层血浆至新的离心管中，放入水浴锅中，56℃、30min 进行血浆灭活，灭活结束后离心2800rpm，20min，弃蛋白沉淀保留上层液，即灭活后的自体血浆。

[0090] 2)血细胞稀释：将步骤1)中分离的下层血细胞用氯化钠注射液1:1稀释血细胞。

[0091] 3)单个核细胞分离：将步骤2)稀释后的血细胞加入25mL的淋巴细胞分离液(货号：2020121701S71；厂家：天津灏洋华科生物科技有限公司)中 (细胞悬液：淋巴细胞分离液体积比1:1)，注意用移液管吸取全部血样轻轻的沿管壁缓慢加于分离液液面之上，尽量避免自体血浆与淋巴细胞分离液混合，2000rpm，15～25℃离心20min，使用最低升降速率。离心结束后，小心取出离心管竖直放置。可见淋巴细胞在管中部形成环状乳白色分层。

[0092] 4)吸取白细胞层：用移液管小心吸掉大部分上层分离液，再吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层，将其小心加入到装有生理盐水的离心管中，尽量避免气泡产生。

[0093] 5)清洗：加入生理盐水至装有淋巴细胞的离心管中，轻轻上下颠倒混匀， 1400～1500rpm 15～25℃，离心8min，弃上清液。

[0094] 6)重复步骤5)清洗3次。备用。

[0095] 7)细胞计数，取20μL步骤6)获得的细胞悬液，加入20μL AOPI染液，使用K2细胞计6
数仪进行计数。使用完全培养基重悬，约使细胞浓度处于 1×10/mL。

[0096] (2)细胞完全培养基配制

[0097] RAK细胞完全培养基成分表

[0098] GT‑T551‑H3培养基液 自体血浆(可选) 白介素‑21 IL‑21000mL 10mL(可选) 100万IU 10μg

[0099] 1)细胞完全培养基1

[0100] 在1000mL GT‑T551‑H3培养基中加入100W单位IL‑2，使其浓度为1000 单位/mL；加入10μg IL‑21，使其浓度为(10‑50)ng/mL。混匀，为细胞完全培养基1。

[0101] 2)细胞完全培养基2

[0102] 在1000mL GT‑T551‑H3培养基中加入100W单位IL‑2，使其浓度为1000 单位/mL；混匀，即为细胞完全培养基2。

[0103] (3)包被液的配制及包被瓶的制备

[0104] 1)5mL生理盐水中加入25μg CD3(Takara，批号YBAA11)，使其浓度为5μg/mL；加入50μg重组人纤维连接蛋白(Takara，批号AL1G001)，使其浓度为10μg/mL，即为包被液。

[0105] 2)T75培养瓶中加入5mL步骤1)获得的包被液，4℃过夜或20℃±5℃放置4h，即得包被瓶。

[0106] (4)混合型T细胞培养

[0107] 1)将步骤(1)分离得到的PBMC用步骤(2)获得的细胞完全培养基1 按照约1×106个/mL浓度接种于步骤(3)获得的包被瓶中，37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0108] 2)培养至24～72小时，补加30～40mL细胞完全培养基1，总培养体积为 60～70mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0109] 3)培养至72～120小时，将细胞转入1L培养袋(或其他培养瓶)。补充200～300mL细胞完全培养基1，于37℃5％CO2的培养箱内继续培养。

[0110] 4)培养至120～168小时分两袋培养，每袋添充细胞完全培养基1至 300～500mL，总培养体积为600～1000mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0111] 5)培养至168～216小时每袋添充细胞完全培养基1至800～1000mL，总培养体积为1600～2000mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0112] 6)培养至240～288小时每袋添充细胞完全培养基2至1800～2000mL，总培养体积为3600～3800mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0113] 7)培养至312～360小时收获细胞悬夜，即获得混合型T细胞。

[0114] 本发明实施例1～实施例3和对比例1～对比例3中，采集人体外周血中，实施例与对比例相同，分离所获得细胞，实施例1与对比例1均来源于同一个捐赠者的外周血，外周血编号：TR002103。实施例2与对比例2来源于同一个捐赠者的外周血，外周血编号：TR002104。实施例3与对比例3来源于同一个捐赠者的外周血，外周血编号：TR002208。所用原料及试剂均可由市场购得。

[0115] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0116] 实施例1

[0117] (1)采集人体外周血，按照如下步骤分离外周血单个核细胞与自体血浆。

[0118] 1)制备自体血浆：将采集的30mL外周血转移至50mL离心管中，将外周血2200rpm(1000g)25℃，离心20min，分为上下两层，上层为自体血浆、下层为血细胞。用移液管吸出上层血浆至新的离心管中，放入水浴锅中，56℃、 30min进行血浆灭活，灭活结束后离心2800rpm，20min，弃蛋白沉淀保留上层液，即灭活后的自体血浆。

[0119] 2)血细胞稀释：将步骤1)中分离的下层血细胞用氯化钠注射液1:1稀释血细胞。

[0120] 3)单个核细胞分离：将步骤2)中稀释后的血细胞加入25mL的淋巴细胞分离液(货号：2020121701S71；厂家：天津灏洋华科生物科技有限公司) 中(细胞悬液：淋巴细胞分离液体积比1:1)，注意用移液管吸取全部血样轻轻的沿管壁缓慢加于分离液液面之上，尽量避免自体血浆与淋巴细胞分离液混合，2000rpm，25℃离心20min，使用最低升降速率。离心结束后，小心取出离心管竖直放置。可见淋巴细胞在管中部形成环状乳白色分层。

[0121] 4)吸取白细胞层：用移液管小心吸掉大部分上层分离液，再吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层，将其小心加入到装有生理盐水的离心管中，尽量避免气泡产生。

[0122] 5)清洗：加入生理盐水至步骤4)中装有淋巴细胞的离心管中，轻轻上下颠倒混匀，1400～1500rpm 25℃离心8min，弃上清液。

[0123] 6)重复步骤5)清洗3次。备用。

[0124] 7)细胞计数，取20μL步骤6)获得的细胞悬液，加入20μL AOPI染液，使用K2细胞计7
数仪进行计数。约获得细胞2×10cells.

[0125] (2)细胞完全培养基配制

[0126] 1)细胞完全培养基1

[0127] 在1000mL GT‑T551‑H3培养基中加入100W单位IL‑2，使其浓度为1000 单位/mL；加入50μg IL‑21，使其浓度为50ng/mL。混匀，为细胞完全培养基 1。

[0128] 2)细胞完全培养基2

[0129] 在1000mL GT‑T551‑H3培养基中加入100W单位IL‑2，使其浓度为1000 单位/mL；混匀，即为细胞完全培养基2。

[0130] (3)包被液的配制及包被瓶的制备

[0131] 1)5mL生理盐水中加入25μg CD3，使其浓度为5μg/mL；加入50μg重组人纤维连接蛋白，使其浓度为10μg/mL，即为包被液。

[0132] 2)T75培养瓶中加入5mL步骤1)获得的包被液，4℃过夜或20℃±5℃放置4h，即得包被瓶。

[0133] (4)混合型T细胞培养

[0134] 1)将步骤(1)分离得到的PBMC用步骤(2)获得的细胞完全培养基2 按照约1×106个/mL浓度接种于步骤(3)获得的包被瓶中，37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0135] 2)培养至72小时，补加35mL细胞完全培养基2，总培养体积为65mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0136] 3)培养至120小时，将细胞转入1L培养袋(或其他培养瓶)。补充250mL 步骤(2)获得的细胞完全培养基1，于37℃5％CO2的培养箱内继续培养。

[0137] 4)培养至168小时分两袋培养，每袋添充细胞完全培养基1至400mL，总培养体积为800mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0138] 5)培养至216小时每袋添充细胞完全培养基1至900mL，总培养体积为 1800mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0139] 6)培养至288小时每袋添充细胞完全培养基2至1900mL，总培养体积为3800mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0140] 7)培养至360小时收获细胞悬夜，即获得混合型T细胞。

[0141] 对比例1

[0142] (1)采集人体外周血，按照如下步骤分离外周血单个核细胞与自体血浆。

[0143] 1)制备自体血浆：将采集的30mL外周血转移至50mL离心管中，将外周血2200rpm(1000g)25℃，离心20min，分为上下两层，上层为自体血浆、下层为血细胞。用移液管吸出上层血浆至新的离心管中，放入水浴锅中，56℃、 30min进行血浆灭活，灭活结束后离心2800rpm，20min，弃蛋白沉淀保留上层液，即灭活后的自体血浆。

[0144] 2)血细胞稀释：将步骤1)中分离的下层血细胞用氯化钠注射液1:1稀释血细胞。

[0145] 3)单个核细胞分离：将步骤2)稀释后的血细胞加入25mL的淋巴细胞分离液(货号：2020121701S71；厂家：天津灏洋华科生物科技有限公司)中 (细胞悬液：淋巴细胞分离液体积比1:1)，注意用移液管吸取全部血样轻轻的沿管壁缓慢加于分离液液面之上，尽量避免自体血浆与淋巴细胞分离液混合，2000rpm，25℃离心20min，使用最低升降速率。离心结束后，小心取出离心管竖直放置。可见淋巴细胞在管中部形成环状乳白色分层。

[0146] 4)吸取白细胞层：用移液管小心吸掉大部分上层分离液，再吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层，将其小心加入到装有生理盐水的离心管中，尽量避免气泡产生。

[0147] 5)清洗：加入生理盐水至步骤4)装有淋巴细胞的离心管中，轻轻上下颠倒混匀，1400～1500rpm 25℃离心8min，弃上清液。

[0148] 6)重复步骤5)清洗3次。备用。

[0149] 7)细胞计数，取20μL步骤6)获得的细胞悬液，加入20μL AOPI染液，使用K2细胞计数仪进行计数。约获得细胞2×10^7cells。

[0150] (2)细胞完全培养基配制

[0151] 1)细胞完全培养基2

[0152] 在1000mL GT‑T551‑H3培养基中加入100W单位IL‑2，使其浓度为1000 单位/mL；混匀，即为细胞完全培养基2。

[0153] (3)包被液的配制及包被瓶的制备

[0154] 1)5mL生理盐水中加入25μg CD3，使其浓度为5μg/mL；加入250μg重组人纤维连接蛋白，使其浓度为50μg/mL，即为包被液。

[0155] 2)T75培养瓶中加入5mL步骤1)获得的包被液。4℃过夜或20℃±5℃放置4h，即得包被瓶。

[0156] (4)RAK细胞培养

[0157] 1)将步骤(1)分离得到的PBMC用步骤(2)获得的细胞完全培养基2 按照约1×106个/mL浓度接种于步骤(3)获得的包被瓶中，37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0158] 2)培养至72小时，补加35mL细胞完全培养基2，总培养体积为65mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0159] 3)培养至120小时，将细胞转入1L培养袋(或其他培养瓶)。补充250mL 细胞完全培养基2，于37℃5％CO2的培养箱内继续培养。

[0160] 4)培养至168小时分两袋培养，每袋添充细胞完全培养基2至400mL，总培养体积为800mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0161] 5)培养至216小时，每袋添充细胞完全培养基2至900mL，总培养体积为1800mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0162] (6)培养至288小时每袋添充细胞完全培养基2至1900mL，总培养体积为3800mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0163] (7)培养至360小时收获细胞悬夜，即获得RAK细胞。

[0164] 实施例2

[0165] (1)采集人体外周血，按照如下步骤分离外周血单个核细胞与自体血浆。

[0166] 1)制备自体血浆：将采集的外周血15mL转移至50mL离心管中，将外周血2200rpm(1000g)25℃，离心20min，分为上下两层，上层为自体血浆、下层为血细胞。用移液管吸出上层自体血浆至新的离心管中，放入水浴锅中， 56℃、30min进行血浆灭活，灭活结束后离心2800rpm，20min，弃蛋白沉淀保留上层液，即灭活后的自体血浆。

[0167] 2)血细胞稀释：将步骤1)中分离的下层血细胞用氯化钠注射液1:1稀释血细胞。

[0168] 3)单个核细胞分离：将步骤2)稀释后的血细胞加入25mL的淋巴细胞分离液(货号：2020121701S71；厂家：天津灏洋华科生物科技有限公司)中 (细胞悬液：淋巴细胞分离液体积比1:1)，注意用移液管吸取全部血样轻轻的沿管壁缓慢加于分离液液面之上，尽量避免自体血浆与淋巴细胞分离液混合，2000rpm，25℃离心20min，使用最低升降速率。离心结束后，小心取出离心管竖直放置。可见淋巴细胞在管中部形成环状乳白色分层。

[0169] 4)吸取白细胞层：用移液管小心吸掉大部分上层分离液，再吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层，将其小心加入到装有生理盐水的离心管中，尽量避免气泡产生。

[0170] 5)清洗：加入生理盐水至步骤4)中装有淋巴细胞的离心管中，轻轻上下颠倒混匀，1400～1500rpm 25℃离心8min，弃上清液。

[0171] 6)重复步骤5)清洗3次。备用。

[0172] 7)细胞计数，取20μL步骤6)获得的细胞悬液，加入20μL AOPI染液，使用K2细胞计7
数仪进行计数。获得PBMC 1.4×10细胞.

[0173] (2)细胞完全培养基配制

[0174] 1)细胞完全培养基1

[0175] 在1000mL GT‑T551‑H3培养基中加入100W单位IL‑2，使其浓度为1000 单位/mL；加入30μg IL‑21，使其浓度为30ng/mL。混匀，为细胞完全培养基 1。

[0176] 2)细胞完全培养基2

[0177] 在1000mL GT‑T551‑H3培养基中加入100W单位IL‑2，使其浓度为1000 单位/mlL；混匀，即为细胞完全培养基2。

[0178] (3)包被液的配制及包被瓶的制备

[0179] 1)5mL生理盐水中加入25μg CD3，使其浓度为5μg/mL；加入50μg重组人纤维连接蛋白，使其浓度为10μg/mL，即为包被液。

[0180] 2)T75培养瓶中加入5mL步骤1)获得的包被液。4℃过夜或20℃±5℃放置4h，即得包被瓶。

[0181] (4)混合型T细胞培养

[0182] 1)将步骤(1)分离得到的PBMC用步骤(2)获得的细胞完全培养基2 按照约1×106个/mL浓度接种于步骤(3)获得的包被瓶中，37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0183] 2)培养至36小时，补加40mL细胞完全培养基2，总培养体积为70mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0184] 3)培养至72小时，将细胞转入1L培养袋(或其他培养瓶)。补充400mL 步骤(2)获得的细胞完全培养基1，于37℃5％CO2的培养箱内继续培养。

[0185] 4)培养至120小时分两袋培养，每袋添充细胞完全培养基1至500mL，总培养体积为1000mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0186] 5)培养至168小时每袋添充细胞完全培养基1至1000mL，总培养体积为2000mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0187] 6)培养至240小时每袋添充细胞完全培养基2至2000mL，总培养体积为4000ml，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0188] 7)培养至312小时收获细胞悬夜，即获得混合型T细胞。

[0189] 对比例2

[0190] (1)采集人体外周血，按照如下步骤分离外周血单个核细胞与自体血浆。

[0191] 1)制备自体血浆：将采集的15mL外周血转移至50mL离心管中，将外周血2200rpm(1000g)25℃，离心20min，分为上下两层，上层为自体血浆、下层为血细胞。用移液管吸出上层自体血浆至新的离心管中，放入水浴锅中， 56℃、30min进行血浆灭活，灭活结束后离心2800rpm，20min，弃蛋白沉淀保留上层液，即灭活后的自体血浆。

[0192] 2)血细胞稀释：将步骤1)中分离的下层血细胞用氯化钠注射液1:1稀释血细胞。

[0193] 3)单个核细胞分离：将步骤2)稀释后的血细胞加入25mL的淋巴细胞分离液(货号：2020121701S71；厂家：天津灏洋华科生物科技有限公司)中 (细胞悬液：淋巴细胞分离液体积比1:1)，注意用移液管吸取全部血样轻轻的沿管壁缓慢加于分离液液面之上，尽量避免自体血浆与淋巴细胞分离液混合，2000rpm，25℃离心20min，使用最低升降速率。离心结束后，小心取出离心管竖直放置。可见淋巴细胞在管中部形成环状乳白色分层。

[0194] 4)吸取白细胞层：用移液管小心吸掉大部分上层分离液，再吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层，将其小心加入到装有生理盐水的离心管中，尽量避免气泡产生。

[0195] 5)清洗：加入生理盐水至步骤4)装有淋巴细胞的离心管中，轻轻上下颠倒混匀，1400～1500rpm 25℃离心8min，弃上清液。

[0196] 6)重复步骤5)清洗3次。备用。

[0197] 7)细胞计数，取20μL步骤6)获得的细胞悬液，加入20μL AOPI染液，使用K2细胞计7
数仪进行计数。约获得PBMC 1.4×10细胞。

[0198] (2)细胞完全培养基配制

[0199] 1)细胞完全培养基2

[0200] 在1000mL GT‑T551‑H3培养基中加入100W单位IL‑2，使其浓度为1000 单位/mL；混匀，即为细胞完全培养基2。

[0201] (3)包被液的配制及包被瓶的制备

[0202] 1)5mL生理盐水中加入25μg CD3，使其浓度为5μg/mL；加入250μg重组人纤维连接蛋白，使其浓度为50μg/mL，包被液。

[0203] 2)T75培养瓶中加入5mL步骤1)获得的包被液。4℃过夜或20℃±5℃放置4h，即得包被瓶。

[0204] (4)RAK细胞培养

[0205] 1)将步骤(1)分离得到的PBMC用步骤(2)获得的细胞完全培养基2 按照约0.5×6
10个/mL浓度接种于步骤(3)获得的包被瓶中，37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0206] 2)培养至36小时，补加40mL细胞完全培养基2，总培养体积为70mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0207] 3)培养至72小时，将细胞转入1L培养袋(或其他培养瓶)。补充400mL 细胞完全培养基2，于37℃5％CO2的培养箱内继续培养。

[0208] 4)培养至120小时分两袋培养，每袋添充细胞完全培养基2至500mL，总培养体积为1000mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0209] (5)培养至168小时每袋添充细胞完全培养基2至1000mL，总培养体积为2000mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0210] (6)培养至240小时每袋添充细胞完全培养基2至2000mL，总培养体积为4000mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0211] (7)培养至312小时收获细胞悬夜，即获得RAK细胞。

[0212] 实施例3

[0213] (1)采集人体外周血，按照如下步骤分离外周血单个核细胞与自体血浆。

[0214] 1)制备自体血浆：将采集的外周血20mL转移至50mL离心管中，将外周血2200rpm(1000g)25℃，离心20min，分为上下两层，上层为自体血浆、下层为血细胞。用移液管吸出上层自体血浆至新的离心管中，放入水浴锅中， 56℃、30min进行血浆灭活，灭活结束后离心2800rpm，20min，弃蛋白沉淀保留上层液，即灭活后的自体血浆。

[0215] 2)血细胞稀释：将步骤1)中分离的下层血细胞用氯化钠注射液1:1稀释血细胞。

[0216] 3)单个核细胞分离：将步骤2)稀释后的血细胞加入25mL的淋巴细胞分离液(货号：2020121701S71；厂家：天津灏洋华科生物科技有限公司)中 (细胞悬液：淋巴细胞分离液体积比1:1)，注意用移液管吸取全部血样轻轻的沿管壁缓慢加于分离液液面之上，尽量避免自体血浆与淋巴细胞分离液混合，2000rpm，25℃离心20min，使用最低升降速率。离心结束后，小心取出离心管竖直放置。可见淋巴细胞在管中部形成环状乳白色分层。

[0217] 4)吸取白细胞层：用移液管小心吸掉大部分上层分离液，再吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层，将其小心加入到装有生理盐水的离心管中，尽量避免气泡产生。

[0218] 5)清洗：加入生理盐水至步骤4)装有淋巴细胞的离心管中，轻轻上下颠倒混匀，1400～1500rpm 25℃离心8min，弃上清液。

[0219] 6)重复步骤5)清洗3次。备用。

[0220] 7)细胞计数，取20μL步骤6)获得的细胞悬液，加入20μL AOPI染液，使用K2细胞计7
数仪进行计数，获得PBMC约2×10细胞。

[0221] (2)细胞完全培养基配制

[0222] 1)细胞完全培养基1

[0223] 在1000mL GT‑T551‑H3培养基中加入100W单位IL‑2，使其浓度为1000 单位/mL；加入10μg IL‑21，使其浓度为10ng/mL。混匀，为细胞完全培养基 1；

[0224] 2)细胞完全培养基2

[0225] 在1000mL GT‑T551‑H3培养基中加入100W单位IL‑2，使其浓度为1000 单位/mL；混匀，即为细胞完全培养基2。

[0226] (3)包被液的配制及包被瓶的制备

[0227] 1)5mL生理盐水中加入25μg CD3，使其浓度为5μg/mL；加入50μg重组人纤维连接蛋白，使其浓度为10μg/mL，即为包被液。

[0228] 2)T75培养瓶中加入5mL步骤1)获得的包被液。4℃过夜或20℃±5℃放置4h，即得包被瓶。

[0229] (4)混合型T细胞培养

[0230] 1)将步骤(1)分离得到的PBMC用步骤(2)获得的完全培养基1按照约1×106个/mL浓度接种于步骤(3)获得的包被瓶中，37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0231] 2)培养至48小时，补加30mL细胞完全培养基1，总培养体积为60mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0232] 3)培养至96小时，将细胞转入1L培养袋(或其他培养瓶)。补充200mL 细胞完全培养基1，于37℃5％CO2的培养箱内继续培养。

[0233] 4)培养至144小时分两袋培养，每袋添充细胞完全培养基1至300mL，总培养体积为600mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0234] 5)培养至192小时每袋添充细胞完全培养基1至800mL，总培养体积为 1600mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0235] 6)培养至264小时每袋添充细胞完全培养基2至1800mL，总培养体积为3600mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0236] 7)培养至336小时收获细胞悬夜，即获得混合型T细胞。

[0237] 对比例3

[0238] (1)采集人体外周血，按照如下步骤分离外周血单个核细胞与自体血浆。

[0239] 1)制备自体血浆：将采集的外周血转移至50mL离心管中，将外周血 2200rpm(1000g)25℃，离心20min，分为上下两层，上层为自体血浆、下层为血细胞。用移液管吸出上层自体血浆至新的离心管中，放入水浴锅中，56℃、30min进行血浆灭活，灭活结束后离心2800rpm，20min，弃蛋白沉淀保留上层液，即灭活后的自体血浆。

[0240] 2)血细胞稀释：将步骤1)中分离的下层血细胞用氯化钠注射液1:1稀释血细胞。

[0241] 3)单个核细胞分离：将步骤2)稀释后的血细胞加入25mL的淋巴细胞分离液(货号：2020121701S71；厂家：天津灏洋华科生物科技有限公司)中 (细胞悬液：淋巴细胞分离液体积比1:1)，注意用移液管吸取全部血样轻轻的沿管壁缓慢加于分离液液面之上，尽量避免自体血浆与淋巴细胞分离液混合，2000rpm，25℃离心20min，使用最低升降速率。离心结束后，小心取出离心管竖直放置。可见淋巴细胞在管中部形成环状乳白色分层。

[0242] 4)吸取白细胞层：用移液管小心吸掉大部分上层分离液，再吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层，将其小心加入到装有生理盐水的离心管中，尽量避免气泡产生。

[0243] 5)清洗：加入生理盐水至步骤4)装有淋巴细胞的离心管中，轻轻上下颠倒混匀，1400～1500rpm 25℃离心8min，弃上清液。

[0244] 6)重复步骤5)清洗3次。备用。

[0245] 7)细胞计数，取20μL步骤6)获得的细胞悬液，加入20μL AOPI染液，使用K2细胞计7
数仪进行计数。计算后约获得细胞2×10细胞。

[0246] (2)细胞完全培养基配制

[0247] 1)细胞完全培养基2

[0248] 在1000mL GT‑T551‑H3培养基中加入100W单位IL‑2，使其浓度为1000 单位/mL；混匀，即为细胞完全培养基2。

[0249] (3)包被液的配制及包被瓶的制备

[0250] 1)5mL生理盐水中加入25μg CD3，使其浓度为5μg/mL；加入50μg重组人纤维连接蛋白，使其浓度为10μg/mL，即为包被液。

[0251] 2)T75培养瓶中加入5mL步骤1)获得的包被液。4℃过夜或20℃±5℃放置4h，即得包被瓶。

[0252] (4)RAK细胞培养

[0253] 1)将步骤(1)分离得到的PBMC用步骤(2)获得的细胞完全培养基2 按照约1×106个/mL浓度接种于步骤(3)获得的包被瓶中，37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0254] 2)培养至48小时，补加30mL细胞完全培养基2，总培养体积为60mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0255] 3)培养至96小时，将细胞转入1L培养袋(或其他培养瓶)。补充200mL 细胞完全培养基2，于37℃5％CO2的培养箱内继续培养。

[0256] 4)培养至144小时分两袋培养，每袋添充细胞完全培养基2至300mL，总培养体积为600mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0257] 5)培养至192小时每袋添充细胞完全培养基2至800mL，总培养体积为 1600mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0258] 6)培养至264小时每袋添充细胞完全培养基2至1800mL，总培养体积为3600mL，于37℃5％CO2的培养箱内培养。

[0259] 7)培养至336小时收获细胞悬夜，即获得RAK细胞。

[0260] 验证例

[0261] 对上述实施例1～3和对比例1～3培养的细胞做肿瘤细胞杀伤检测(A498 细胞)、流式表型检测、INF‑γ分泌量检测。检测结果如表1所示：

[0262] 表1

[0263]

[0264] 表1对应图4的数据。

[0265] 如图2所示，实施例、和对比例中培养的细胞进行流式表型检测，实施例制备的免疫细胞表达的CD3+CD4+T细胞高于对比例制备的免疫细胞。CD 3+CD8+T细胞维持在了较高程度。

[0266] 如图4b，4d，4f所示，对实施例和对比例中培养的细胞进行ELISA因子分泌量检测，免疫细胞与靶细胞共培养比例为15:1和30:1的情况下，3组实施例INF‑γ释放量均显著高于对比例，有统计学意义。INF‑γ高表达表明细胞因子诱导作用有效，CD4+T细胞发挥了较大的作用。结果显示，相较于对比例，实施例均分泌了更高浓度的INF‑γ因子。

[0267] 对实施例和对比例中细胞进行了CCK8细胞杀伤率检测，如图4a，4c， 4e所示，免疫细胞与靶细胞共培养比例为15:1和30:1的情况下，本发明培育的免疫细胞对于肿瘤细胞株的杀伤效果也显然高于对比例培育的免疫细胞的杀伤效果，有统计学意义。

[0268] 表2对比例3和实施例3细胞密度变化统计表

[0269]   0d 5d 7d 9d 11d 14d 16d 18dA(对比例3) 0.09988 0.388 0.482 0.744 1.1 0.99 0.882 0.357
B(实施例3) 0.09988 0.514 0.594 1.04 1.71 1.49 0.956 0.498

[0270] 表2对应图3的数据。

[0271] 如表2和图3所示，结果表明0～11天时，对比例和实施例增殖速度逐渐上升，11天开始下降，整个增殖过程中对比例增殖速度均低于实施例。

[0272] 如图5所示60:1效靶比过大，对比例和实施例均将肿瘤细胞杀死外，15:1 和30:1效靶比下实施例组剩余肿瘤细胞量均少于对比例，实施例肿瘤杀伤效果优于对比例。

[0273] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。