一种复合添加剂提升同步糖化发酵生产乙醇的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种复合添加剂提升同步糖化发酵生产乙醇的方法及其应用，包括如下步骤：S1）在反应釜中向杨木原料中加入NaOH、乙醇水溶液，在一定温度和时间下进行预处理，固液分离后得到预处理杨木；S2）向预处理杨木中加入去离子水、营养盐、调节pH、灭菌得到灭菌杨木混合料；S3）加入复合添加剂、纤维素酶、酵母，进行同步糖化发酵。本发明通过采用含有特定组分组成且特定复配质量比复合添加剂提升杨木同步糖化发酵生产乙醇方法中，能够明显减少纤维素酶用量，并大大缩短杨木同步糖化发酵时间（发酵时间不超过24 h），且能显著提升同步糖化发酵产乙醇得率至92.70%，为杨木制备液体燃料乙醇提供技术支持，具有良好应用前景。

权利要求

1.一种复合添加剂提升杨木同步糖化发酵生产乙醇的方法，包括如下步骤：

S1）在反应釜中向杨木原料中加入NaOH、乙醇水溶液，在一定温度和时间下进行预处理，固液分离后得到预处理杨木，所述乙醇水溶液的浓度为50～70%（v/v），所述杨木的绝干质量与乙醇水溶液体积比为1 g：（8～12）mL ；所述NaOH的浓度为1.0～1.5%；所述预处理反应的工艺条件为：在200～210℃下反应15～25min，所述固液分离采用真空抽滤或离心分离；

S2）向预处理杨木中加入去离子水、营养盐、调节pH、灭菌得到灭菌杨木混合料，所述预处理杨木的绝干质量与去离子水的质量比为（3～8）：100，所述营养盐包括酵母提取物、NH4Cl、KH2PO4、MgSO4·7H2O，其质量比分别为2：1：1：0.3；所述营养盐的添加量为4.0～4.5%g/L水；所述pH调节至4.6～5.0；

S3）向灭菌杨木混合料中加入复合添加剂、纤维素酶、酵母，进行同步糖化发酵，所述纤维素酶的用量为3～15FPU/g绝干预处理杨木，所述酵母为酵母活化液，所述酵母活化液的用量为40～60 mL/L水；所述同步糖化发酵的工艺条件为：在32～36 ℃，转速为120～140 rpm下发酵，发酵时间不超过24h，所述复合添加剂选自以下复配中的一种：

25 mg/g PEG 8000与75 mg/g牛血清白蛋白BSA的复配；

150 mg/g吐温80与75 mg/g牛血清白蛋白BSA的复配；

150 mg/g茶皂素与75 mg/g牛血清白蛋白BSA的复配；

25 mg/g木质素磺酸钙与75 mg/g牛血清白蛋白BSA的复配。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3）中，所述酵母活化液的制备方法为：称取1～3 g葡萄糖溶于80～120 mL去离子水中，接入6.4～6.8 g酿酒酵母，1～3 g蛋白胨，0.5～1.5 g酵母提取物，先在150～170 rpm摇床上34～38 ℃活化8～12 min，再在150～170 rpm摇床上32～36 ℃活化50～70 min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3）中，所述灭菌为在高压灭菌锅中

121 ℃灭菌15～25 min。

说明书

一种复合添加剂提升同步糖化发酵生产乙醇的方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物质转化与利用技术领域，更具体地，涉及一种复合添加剂提升同步糖化发酵生产乙醇的方法及其应用。

背景技术

[0002] 随着石油资源短缺、环境恶化和温室效应加剧等问题的不断出现，木质纤维燃料乙醇作为一种清洁、环保的可再生能源，其发酵技术逐渐受到越来越多国家的重视和积极支持。木质纤维类生物质制液体燃料的方法是把该原料中的纤维素经预处理、酶解水解成葡萄糖等单糖，再通过发酵生产燃料乙醇。

[0003] 杨木具有生长快、经济效率强、营养循环化、抗旱/抗病虫害能力强等特点，广泛分布于世界各地，产量丰富，可持续利用性强。杨木的纤维素含量相对高于其他木质纤维素生物质（甘蔗渣、秸秆、小麦等），是生物燃料生产和高价值产品的主要生物炼制原料。但由于杨木中的纤维素与半纤维素和木素紧密连接在一起，结构稳定，不易被纤维素酶破坏，因此在进行生物质资源转化时需要先对其进行预处理，然后再对预处理杨木进行酶解和发酵。

[0004] 目前已有大量文献证明添加剂在增强纤维素酶促进木质纤维素生物质水解的能力，但大多仅用于酶解，鲜少将添加剂用于同步糖化发酵生产乙醇。中国专利申请CN109457000A公开了通过添加吐温80可以在一定程度下缩短酶解时间，降低酶用量，提高葡萄糖产率。亦有其他研究表明也有一些蛋白等可以减少纤维素酶的用量，但是也存在使用成本较高，增效效果不佳的问题。这些不同的处理方法虽然能一定程度上提高酶解效率，但是若获得较高的酶解效率通常需要较高的纤维素酶用量来达到，且在后续的同步糖化发酵生产乙醇存在发酵时间过长以及产乙醇效率较低的缺陷。

发明内容

[0005] 针对上述现有技术存在的不足，本发明的首要目的旨在提供一种用复合添加剂在杨木同步糖化发酵生产乙醇的方法，该方法能够明显减少纤维素酶的用量，并大大缩短杨木同步糖化发酵时间（发酵时间不超过24 h），且能显著提升同步糖化发酵产乙醇效率（同步糖化发酵液的乙醇得率为92.7%）。

[0006] 本发明的再一目的是提供上述方法在促进同步糖化发酵中的应用。

[0007] 本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

[0008] 本发明提供的一种复合添加剂提升杨木同步糖化发酵生产乙醇的方法，包括如下步骤：

[0009] S1）在反应釜中向杨木原料中加入NaOH、乙醇水溶液，在一定温度和时间下进行预处理，固液分离后得到预处理杨木；

[0010] S2）向预处理杨木中加入去离子水、营养盐、调节pH、灭菌得到灭菌杨木混合料；

[0011] S3）向灭菌杨木混合料中加入复合添加剂、纤维素酶、酵母，进行同步糖化发酵。

[0012] 在一些实施例中，步骤S1）中，所述乙醇水溶液的浓度为50～70%（v/v），所述杨木的绝干质量与乙醇水溶液体积比为1 g：（8～12）mL ；所述NaOH的浓度为1.0～1.5%；所述预处理反应的工艺条件为：在200～210℃下反应15～25min，所述固液分离采用真空抽滤或离心分离。

[0013] 在一些实施例中，步骤S2）中，所述预处理杨木的绝干质量与去离子水水的质量比为（3～8）：100。

[0014] 在一些实施例中，步骤S2）中，所述营养盐包括酵母提取物、NH4Cl、KH2PO4、MgSO4·7H2O，其质量比分别为2：1：1：0.3；所述营养盐的添加量为4.0～4.5%g/L水；所述pH调节至
4.6～5.0；所述灭菌为在高压灭菌锅中121 ℃灭菌15～25 min。

[0015] 在一些实施例中，步骤S3）中，所述复合添加剂，包括牛血清白蛋白，与PEG 8000、吐温80、茶皂素、木质素磺酸钙中的一种或多种的复配。

[0016] 在一些实施例中，步骤S3）中，所述复合添加剂选自25 mg/g PEG 8000与75 mg/g牛血清白蛋白BSA的复配；所述复合添加剂选自150 mg/g吐温80与75 mg/g牛血清白蛋白BSA的复配；所述复合添加剂选自150 mg/g茶皂素与75 mg/g牛血清白蛋白BSA的复配；所述复合添加剂选自25 mg/g木质素磺酸钙与75 mg/g牛血清白蛋白BSA的复配。

[0017] 在一些实施例中，步骤S3）中，所述酵母为酵母活化液，所述酵母活化液的用量为40～60 mL/L水；所述同步糖化发酵的工艺条件为：在32～36 ℃，转速为120～140 rpm下发酵，发酵时间不超过24h。

[0018] 在一些实施例中，步骤S3）中，所述酵母活化液的制备方法为：称取1～3 g葡萄糖溶于80～120 mL去离子水中，接入6.4～6.8 g酿酒酵母，1～3 g蛋白胨，0.5～1.5 g酵母提取物，先在150～170 rpm摇床上34～38 ℃活化8～12 min，再在150～170 rpm摇床上32～36 ℃活化50～70 min。

[0019] 在一些实施例中，步骤S3）中，所述纤维素酶的用量为3～15FPU/g绝干预处理杨木。

[0020] 此外，本发明还提供上述方法在促进同步糖化发酵中的应用。

[0021] 与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：

[0022] 本发明通过采用含有特定组分组成且特定复配质量比复合添加剂提升杨木同步糖化发酵生产乙醇方法中，能够明显减少纤维素酶用量，并大大缩短杨木同步糖化发酵时间（发酵时间不超过24 h），且能显著提升同步糖化发酵产乙醇得率至92.70%，为杨木制备液体燃料乙醇提供技术支持，具有良好应用前景。

具体实施方式

[0023] 下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。

[0024] 以下实施例中部分原料和方法：

[0025] 所用杨木原料为经风干、搓丝、粉碎处理后的杨木，其粒径<1毫米，组分含量为纤维素43.08%，半纤维素13.91%，木素23.65%。

[0026] 所述酵母活化液的制备方法为：称取2 g葡萄糖、2 g蛋白胨、1 g酵母提取物溶于100 mL去离子水中，接入6.6 g酵母粉，先在摇床上于160 rpm，36 ℃活化10 min，然后在
160 rpm摇床上34 ℃活化60 min。

[0027] 同步糖化发酵液中的乙醇浓度采用高效液相色谱法直接测定：在进行6 h、12 h和发酵终点后取出0.5 mL样品进行测定。

[0028] 同步糖化发酵液中的乙醇得率的测试方法：

[0029] 。

[0030] 实施例1

[0031] 一种用复合添加剂在杨木同步糖化发酵生产乙醇的方法，包括如下步骤：

[0032] S1）在反应釜中向杨木原料中加入1.2%的NaOH，按绝干质量体积比为1 g：10 mL加入60%（v/v）乙醇水溶液，在205 ℃下反应20 min进行预处理，离心分离后得到预处理杨木；

[0033] S2）向预处理杨木中加入去离子水、营养盐、调节pH至4.8、放入高压灭菌锅中121 ℃灭菌20 min，得到灭菌杨木混合料；其中，预处理杨木的绝干质量与去离子水的质量比为5：100，营养盐的添加量为4.3 g/L去离子水，营养盐中酵母提取物、NH4Cl、KH2PO4、MgSO4·7H2O的质量比为2:1:1:0.3；

[0034] S3）向5 g（绝干质量）灭菌杨木混合料中加入复合添加剂、15 FPU/g绝干预处理杨木的纤维素酶、50 mL/L去离子水的酵母活化液，在34 ℃，120 rpm摇床上进行同步糖化发酵；其中，所述复合添加剂包括如下两种组分：75 mg/g 牛血清白蛋白BSA 与150 mg/g茶皂素；其中此步骤的牛血清白蛋白BSA为生物蛋白类添加剂，需在样品瓶灭菌后于超净工作台操作加入；所述同步糖化发酵的工艺条件为：在34 ℃，转速为130 rpm下发酵。

[0035] 所述同步糖化发酵在进行6 h、12 h和发酵终点得到的发酵液中乙醇浓度及其转化率如表1所示。

[0036] 实施例2

[0037] 同实施例1的用复合添加剂在杨木同步糖化发酵生产乙醇的方法，区别在于，同步糖化发酵过程中加入的复合添加剂为150 mg/g吐温80与75 mg/g牛血清白蛋白BSA的复配。

[0038] 所述同步糖化发酵在进行6 h、12 h和发酵终点得到的发酵液中乙醇浓度及其转化率如表1所示。

[0039] 实施例3

[0040] 同实施例1的用复合添加剂在杨木同步糖化发酵生产乙醇的方法，区别在于，同步糖化发酵过程中加入的复合添加剂为25 mg/g PEG 8000与75 mg/g牛血清白蛋白BSA的复配。

[0041] 所述同步糖化发酵在进行6 h、12 h和发酵终点得到的发酵液中乙醇浓度及其转化率如表1所示。

[0042] 实施例4

[0043] 同实施例1的用复合添加剂在杨木同步糖化发酵生产乙醇的方法，区别在于，同步糖化发酵过程中加入的复合添加剂为25 mg/g木质素磺酸钙与75 mg/g牛血清白蛋白BSA的复配。

[0044] 所述同步糖化发酵在进行6 h、12 h和发酵终点得到的发酵液中乙醇浓度及其转化率如表1所示。

[0045] 实施例5

[0046] 同实施例1的方法，区别在于，同步糖化发酵过程中使用的酶用量为3 FPU/g。所述同步糖化发酵在进行6 h、12 h和发酵终点得到的发酵液中乙醇浓度及其转化率如表1所示[0047] 实施例6

[0048] 同实施例1的方法，区别在于，同步糖化发酵过程中使用的酶用量为5 FPU/g。所述同步糖化发酵在进行6 h、12 h和发酵终点得到的发酵液中乙醇浓度及其转化率如表1所示[0049] 实施例7

[0050] 同实施例1的方法，区别在于，同步糖化发酵过程中使用的酶用量为8 FPU/g。所述同步糖化发酵在进行6 h、12 h和发酵终点得到的发酵液中乙醇浓度及其转化率如表1所示[0051] 实施例8

[0052] 同实施例1的方法，区别在于，同步糖化发酵过程中使用的酶用量为10 FPU/g。所述同步糖化发酵在进行6 h、12 h和发酵终点得到的发酵液中乙醇浓度及其转化率如表1所示

[0053] 对比例1

[0054] 同实施例1的方法，区别在于，同步糖化发酵过程中不加入任何添加剂，酶用量15 FPU/g，在6 h、12 h、24 h和36 h后取出0.5 mL样品，用高效液相测定发酵液中乙醇浓度，分别为7.10、12.24、13.33 和11.97 g/L。所述同步糖化发酵在进行6 h、12 h和发酵终点得到的发酵液中乙醇浓度及其转化率如表1所示。

[0055] 对比例2

[0056] 同实施例1的方法，区别在于，同步糖化发酵过程中使用的添加剂为75 mg/g牛血清白蛋白BSA。所述同步糖化发酵在进行6 h、12 h和发酵终点得到的发酵液中乙醇浓度及其转化率如表1所示。

[0057] 对比例3

[0058] 同实施例1的方法，区别在于，同步糖化发酵过程中使用的添加剂为150 mg/g吐温80。所述同步糖化发酵在进行6 h、12 h和发酵终点得到的发酵液中乙醇浓度及其转化率如表1所示。

[0059] 对比例4

[0060] 同实施例1的方法，区别在于，同步糖化发酵过程中使用的添加剂为150 mg/g茶皂素。所述同步糖化发酵在进行6 h、12 h和发酵终点得到的发酵液中乙醇浓度及其转化率如表1所示。

[0061] 对比例5

[0062] 同实施例1的方法，区别在于，同步糖化发酵过程中使用的添加剂为25 mg/gPEG8000。所述同步糖化发酵在进行6 h、12 h和发酵终点得到的发酵液中乙醇浓度及其转化率如表1所示。

[0063] 对比例6

[0064] 同实施例1的方法，区别在于，同步糖化发酵过程中使用的添加剂为25 mg/g木质素磺酸钙。所述同步糖化发酵在进行6 h、12 h和发酵终点得到的发酵液中乙醇浓度及其转化率如表1所示。

[0065] 表1 实施例1～8和对比例1～6发酵的发酵液中乙醇浓度（g/L）及其转化率（%）[0066]

[0067] 从表1的结果可以看出：

[0068] （1）通过对比实施例1～4和对比例1～6可知，在其他条件相同的情况下，同步糖化发酵过程中加入本发明中特定组分复配的复合添加剂均能提高发酵乙醇浓度及其转化率。复合添加剂中BSA的加入对比其他单一添加剂能更有效的提高发酵效率，其中效果最好的为75 mg/g BSA与150 mg/g茶皂素的复合添加剂，在24 h能将乙醇浓度提高到18.82 g/L，转化率92.71%；对比此时无添加剂的杨木发酵（13.33 g/L）增长了41.19%，转化率提高了
27.04%。其他复合添加剂虽然没有BSA与茶皂素的效果好，但能在较短时间内提高发酵效率，将反应提前至12 h完成，大大缩短了发酵所需时间。

[0069] （2）另外，对比实施例1、实施例5 8及对比例1可知，加入复合添加剂的杨木样品在~酶用量仅为8 FPU/g时产生比不加添加剂（酶用量15 FPU/g）更高的乙醇浓度。说明加入复合添加剂可在提高发酵效率的同时大幅减少酶用量。

[0070] 可见，按照本发明在同步糖化发酵过程中加入复合添加剂的方法可有效减少酶用量并提高杨木发酵的乙醇产率，对杨木制备液体燃料乙醇方面具有良好的应用前景。

[0071] 以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的的任何修改、等同替换和改进等，都在本发明的保护范围之内。