一种基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法转让专利
申请号 : CN202211542418.6
文献号 : CN115925704B
文献日 : 2023-06-30
发明人 : 王方远 , 张娜 , 叶敏 , 丁亚莉 , 杨德志 , 淳泽利 , 蔡国徽 , 赵学发 , 刘建国
申请人 : 遵义医科大学
摘要 :
本申请公开了生物分析技术领域中的一种基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法，步骤如下：将反应体系加入检测体系中，用荧光光谱仪检测荧光强度，通过荧光强度获得凝血酶的浓度；其中，检测体系由苝衍生物探针、聚阳离子聚合物溶液和缓冲液组成，反应体系由凝血酶、凝血酶核酸适配体(ssDNA)、凝血酶适配体互补链(C‑ssDNA)、外切酶III、溶剂和缓冲液组成。本申请所需材料成本低，无需荧光标记，无需大型仪器，便捷高效，操作简单，反应条件温和，且稳定性好、灵敏度高，在0～13.5nM范围内有很好的线性响应，检测限低至270pM。
权利要求 :
1.一种基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法，其特征在于，步骤如下：将含有凝血酶的待测物加入反应体系中，再将反应后的体系加入到检测体系中，用荧光光谱仪检测荧光强度，通过荧光强度变化获得凝血酶的浓度；
所述反应体系包括凝血酶核酸适配体（ssDNA）、及凝血酶适配体互补链（C‑ssDNA）、核酸外切酶III、溶剂和缓冲液混合组成；
所述检测体系由带负电荷的苝衍生物探针、带正电荷的聚阳离子聚合物、溶剂和缓冲液混合组成；
所述检测体系中，带负电荷的苝衍生物探针的结构式如下：
；
所述检测体系中，苝衍生物探针的浓度为5 nM～1 μM；聚阳离子聚合物的浓度为0.01～50 nM；所述反应体系中，凝血酶核酸适配体的浓度为0.1 nM～50 nM；凝血酶核酸适配体互补链的浓度为0.1 nM～100 nM。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述待测物为水溶液、血清、唾液或细胞裂解液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述凝血酶核酸适配体的序列为：GGTTGGTGTGGTTGG、AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT、ATAGGTTGGTGTGGGTTGG、CTATCAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT或GGTTGGTGTGGTTGGTGTGGTTGG。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述溶剂为水或有机溶剂，所述缓冲液为Tris‑HCl缓冲液、PBS缓冲液、MOPS缓冲液或HEPES缓冲液。
5. 根据权利要求1～4任一所述的方法，其特征在于：凝血酶的检测浓度为0～13.5 nM。
说明书 :
一种基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物分析技术领域，具体涉及一种基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法。
背景技术
[0002] 凝血酶是一种由凝血酶前体形成的丝氨酸蛋白质水解酶，参与凝血级联反应，可催化可溶性纤维蛋白转化为不溶性纤维蛋白，在血液凝固和调控凝血作用方面发挥着重要的作用。故而，凝血酶水平的定量检测具有重要意义。
[0003] 现有技术中，常用的检测凝血酶的手段有许多种，例如荧光光谱法、表面增强拉曼散射、电化学传感器、化学发光适体传感器、比色传感器等。其中，基于荧光光谱法的检测方法因其简单、灵敏、快速、检测范围广等优势而被越来越多的运用在生物分析和生物传感上。2021年Jin等人构建了用适配体识别凝血酶的荧光检测方法(Microchemical Journal,2021,160:105649.)。2021年Yu等人开发了一种基于阳离子聚合物诱导苝探针自组装的新型荧光传感器阵列，以100％的交叉验证准确率区分不同浓度的掺假物掺假的牛奶(Food Chemistry,2021,343:128492.)。
[0004] 核酸适配体，是通过配体指数富集系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)在体外筛选获得的一类DNA或者RNA寡核苷酸片段，也被称为“化学抗体”，它可高特异性地识别金属离子、小分子、多肽、蛋白质、细胞表面抗原甚至整个细胞等多种靶标。与抗体相比，核酸适配体具有尺寸小、易合成、易修饰、稳定性高、配体广泛、低毒性、低免疫原性、更强的组织穿透性、和设计灵活等优势，已经广泛运用到疾病诊断、生物传感器和适配体药物等各个方面。同样，已有多种凝血酶核酸适配体被筛选出来，可以有效的识别凝血酶。
[0005] 但是，目前已见报道的检测酶活性的方法，大多存在着需要荧光标记、稳定性差或成本高等缺点。
发明内容
[0006] 本发明针对现有技术的不足，设计一种基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法。
[0007] 本发明的目的之一是提供苝衍生物探针在检测凝血酶中的应用，苝衍生物探针为N,N'‑二(L‑丙氨酸基)苝二酰亚胺(命名为ProbeA)，其结构式如下所示：
[0008]
[0009] 本发明的目的之二是提供一种基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法，其特征在于，步骤如下：
[0010] 将含有凝血酶的待测物加入反应体系中，再将反应体系加入到检测体系中，用荧光光谱仪检测荧光强度，通过荧光强度变化获得凝血酶的浓度；
[0011] 所述反应体系包括凝血酶核酸适配体(ssDNA)、及凝血酶适配体互补链(C‑ssDNA)、核酸外切酶III、溶剂和缓冲液混合组成；
[0012] 所述检测体系由带负电荷的苝衍生物探针、带正电荷的聚阳离子聚合物、溶剂和缓冲液混合组成；
[0013] 所述检测体系中，带负电荷的苝衍生物探针的结构式如下：
[0014]
[0015] 其中，所述检测体系中，带正电荷的聚阳离子聚合物的结构式如下：
[0016]
[0017] 其中，n＝100～2000。
[0018] 如CAS No.:30551‑89‑4，产品编号479144，分子量65000，n＝1140；
[0019] CAS No.:30551‑89‑4，产品编号479136，分子量17000，n＝298；CAS No.:30551‑89‑4，产品编号479136，分子量15000，n＝263。
[0020] 进一步，所述待测物为水溶液、血清、唾液或细胞裂解液。
[0021] 进一步，所述检测体系中，苝衍生物探针的浓度为5nM～1μM。
[0022] 进一步，所述检测体系中，聚阳离子聚合物的浓度为0.01～50nM。浓度优选为0.01～20nM。
[0023] 进一步，所述反应体系中，凝血酶核酸适配体的浓度为0.1nM～50nM。浓度优选为1nM～20nM。
[0024] 进一步，所述反应体系中，凝血酶核酸适配体互补链的浓度为0.1nM～100nM。浓度优选为1nM～50nM。
[0025] 进一步，所述凝血酶核酸适配体的序列为：GGTTGGTGTGGTTGG、AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT、ATAGGTTGGTGTGGGTTGG、CTATCAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT或GGTTGGTGTGGTTGGTGTGGTTGG。凝血酶核酸适配体互补链的序列分别为：
AACCACACCAA、TCACCCCAACCTGCCCTACCACGGA、AACCCACACCAACCT、
TCACCCCAACCTGCCCTACCACGGACTGAT或AACCACACCAACCACACCAA。
AACCACACCAA、TCACCCCAACCTGCCCTACCACGGA、AACCCACACCAACCT、
TCACCCCAACCTGCCCTACCACGGACTGAT或AACCACACCAACCACACCAA。
[0026] 进一步，所述溶剂为水或有机溶剂，所述缓冲液为Tris‑HCl缓冲液、PBS缓冲液、MOPS缓冲液或HEPES缓冲液。溶剂优选为水或有机溶剂，缓冲液优选为Tris‑HCl缓冲液。
[0027] 进一步的，所述反应体系中，核酸外切酶III的浓度为0.1～1U/μL。浓度优选为0.2～0.4U/μL。
[0028] 进一步的，凝血酶的检测浓度为0～13.5nM。
[0029] 本发明的发明原理为：(1)带负电荷的苝衍生物探针单体在水溶液中呈现强荧光，聚集的苝衍生物探针荧光强度降低。向苝衍生物探针的溶液中加入带有正电荷的聚阳离子聚合物后，强烈的静电、疏水和相互作用导致苝探针聚集，苝衍生物探针的荧光被有效猝灭。当将ssDNA、C‑ssDNA等单链DNA添加到聚合物‑苝衍生物探针的溶液中时，聚合物和单链DNA之间的强静电吸引相互作用减弱了苝衍生物探针聚集体与聚阳离子聚合物的结合。然后释放出的苝衍生物探针在水溶液中呈现单体状态，荧光光谱仪检测到增强的荧光信号。(2)当不加入凝血酶，凝血酶核酸适配体与凝血酶适配体互补链通过碱基互补原则形成双链，核酸外切酶III能切断凝血酶适配体互补链，只剩下凝血酶核酸适配体，没有足够量的DNA和聚阳离子聚合物络合，苝衍生物探针还是和聚阳离子聚合物结合在一起，呈现聚集状态，导致荧光猝灭。(3)当加入凝血酶后，凝血酶核酸适配体会和凝血酶因为相互之间的高亲和力优先结合在一起，导致凝血酶核酸适配体和凝血酶适配体互补链不能结合在一起，加入核酸外切酶III不能切断凝血酶适配体互补链，凝血酶适配体互补链可以和聚阳离子聚合物结合在一起，苝衍生物探针呈单体状态，荧光强度恢复。简而言之，有凝血酶则荧光强度较低，没有凝血酶荧光强度较高，本发明通过荧光强度的变化达到能够检测凝血酶的浓度的目的。
[0030] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0031] 本发明的基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法能够采用免标记的方法定量检测凝血酶，所需材料成本低，无需大型仪器，便捷高效，构建方法简单，基本无毒害，反应条件温和，选择性好，且稳定性好，灵敏度高，在0～13.5nM范围内有很好的线性响应，检测限低至270pM。
[0032] 本发明的检测方法特异性更强，由于苝衍生物探针不直接与适配体相互作用，所以也避免出现只要存在能够切除适配体或者与适配体进行静电等非特异性结合的物质，易产生假阳性荧光信号的现象。
附图说明
[0033] 图1为本发明基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法的原理图。
[0034] 图2为本发明实施例1中在苝衍生物探针中加入不同浓度的聚阳离子(ploycation)聚合物的响应曲线。
[0035] 图3为本发明实施例2中在凝血酶，凝血酶适配体，凝血酶适配体互补链和加入外切酶III后，用不同的酶切时间(Time)酶切后再加入到苝衍生物探针、聚阳离子聚合物的检测体系中，检测体系荧光强度的变化。
[0036] 图4为本发明实施例3中在检测体系中加入不同浓度的凝血酶(Thrombin)的响应曲线。
[0037] 图5为本发明实施例4中检测体系对凝血酶的特异性示意图。
具体实施方式
[0038] 下面通过具体实施方式进一步详细说明。
[0039] 下述技术方案中，苝衍生物探针、聚阳离子聚合物、凝血酶，凝血酶核酸适配体、凝血酶核酸适配体互补链、核酸外切酶III、溶剂和缓冲液均可通过商购获得。
[0040] 其中，图1为本发明基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的方法的原理，其英文注释分别为：凝血酶(Thrombin)、凝血酶核酸适配体(Thrombin aptamer)、凝血酶核酸适配体互补链(Thrombin aptamer complementary chain)、聚阳离子(ploycation)聚合物、苝衍生物探针(ProbeA)、外切酶III(exoIII)。
[0041] 实施例1：
[0042] 将苝衍生物探针ProbeA(N,N'‑二(L‑丙氨酸基)苝二酰亚胺)溶液(溶剂为水)、聚阳离子聚合物(n＝298)溶液(溶剂为水)、水和Tris‑HCl缓冲液(5mM Tris，5mM NaCl，pH7.4)混合，得到苝衍生物探针终浓度50nM，聚阳离子聚合物终浓度0nM～1.6nM的检测体系，用荧光光谱仪检测其荧光强度。
[0043] 图2为本发明实施例1中在苝衍生物探针ProbeA中加入不同浓度的聚阳离子聚合物的响应曲线，从图2可以看出，随着聚阳离子加入浓度从0增加到1.6nM，苝衍生物探针的荧光强度逐渐降低，随后达到平台期，聚阳离子聚合物的浓度优选为1nM。
[0044] 实施例2：
[0045] 将苝衍生物探针ProbeA(N,N'‑二(L‑丙氨酸基)苝二酰亚胺)溶液(溶剂为水)、聚阳离子聚合物(n＝298)溶液(溶剂为水)、水和Tris‑HCl(5mM Tris，5mM NaCl，pH 7.4)缓冲液混合，得到苝衍生物探针终浓度50nM，聚阳离子聚合物浓度为1nM的检测体系，再将凝血酶，2nM凝血酶适配体，凝血酶适配体(ssDNA)为：AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT，10nM凝血酶核酸适体互补链,凝血酶核酸适体互补链为(C‑ssDNA)：TCACCCCAACCTGCCCTACCACGGA，0.2U/μL核酸外切酶III混合后在37℃的水浴锅中酶切时间分别为0min、15min、30min、
45min、60min后形成反应体系，再将反应体系加入检测体系中用荧光光谱仪检测其荧光强度。
45min、60min后形成反应体系，再将反应体系加入检测体系中用荧光光谱仪检测其荧光强度。
[0046] 图3为本发明实施例2的反应体系中不同的酶切时间对检测体系中荧光强度变化的影响，从图3可以看出，酸外切酶III的酶切时间30min为最佳。
[0047] 实施例3：
[0048] 将苝衍生物探针ProbeA(N,N'‑二(L‑丙氨酸基)苝二酰亚胺)溶液(溶剂为水)、聚阳离子聚合物溶液(溶剂为水)、水和Tris‑HCl(5mM Tris‑HCl，5mM NaCl，pH 7.4)缓冲液混合，得到苝衍生物探针终浓度50nM，聚阳离子聚合物终浓度1nM的检测体系，再将不同浓度的凝血酶(0、0.34nM、0.68nM、1.01nM、1.35nM、3.38nM、6.75nM、10.13nM、13.5nM)，2nM凝血酶适配体，凝血酶适配体(ssDNA)为：AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT，10nM凝血酶核酸适体互补链,凝血酶核酸适体互补链(C‑ssDNA)为：TCACCCCAACCTGCCCTACCACGGA,10nM凝血酶适配体互补链，0.2U/μL核酸外切酶III混合后在37℃的水浴锅中酶切时间为30min形成反应体系后再加入到检测体系中，用荧光光谱仪检测其荧光强度。
[0049] 图4为本发明实施例3中在检测体系中加入不同浓度的凝血酶的响应曲线。从图42
可以看出，检测体系的荧光随凝血酶的浓度的升高而荧光强度增强，R ＝0.997，检测体系在0～13.5nM范围内与荧光强度有良好的线性关系和较小的数据偏差，检测限低至270pM。
说明本发明的传感器阵列在检测凝血酶方面具有较高的重现性和稳定性。
可以看出，检测体系的荧光随凝血酶的浓度的升高而荧光强度增强，R ＝0.997，检测体系在0～13.5nM范围内与荧光强度有良好的线性关系和较小的数据偏差，检测限低至270pM。
说明本发明的传感器阵列在检测凝血酶方面具有较高的重现性和稳定性。
[0050] 实施例4：
[0051] 将苝衍生物探针ProbeA(N,N'‑二(L‑丙氨酸基)苝二酰亚胺)溶液(溶剂为水)、聚阳离子聚合物溶液(溶剂为水)、水和Tris‑HCl(5mM Tris‑HCl，5mM NaCl，pH 7.4)缓冲液混合，得到苝衍生物探针终浓度50nM，聚阳离子聚合物终浓度1nM的检测体系。分别加入凝血酶Thrombin(凝血酶)、Trypsin(木瓜蛋白酶)、CEA(癌胚抗原)、Lysozyme(溶菌酶)以及所有蛋白 酶混 合 起来 ，2 n M凝 血酶 适 配体 ，凝 血酶 适 配体 (s s DN A) 为 ：AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT，10nM凝血酶核酸适体互补链，凝血酶核酸适体互补链(C‑ssDNA)为：TCACCCCAACCTGCCCTACCACGGA,0.2U/μL核酸外切酶III混合后在37℃的水浴锅中酶切时间分别为30min形成反应体系后再加入到检测体系中，用荧光光谱仪检测其荧光强度。
[0052] 图5为本发明的基于苝衍生物探针免标记检测凝血酶的传感器阵列对凝血酶的特异性检测，其英文注释分别为：空白组(Blank)、凝血酶(Thrombin)、木瓜蛋白酶(Trypsin)、癌胚抗原(CEA)、溶菌酶(Lysozyme)以及所有蛋白酶混合起来(mixture)。从图5可以看出，只有凝血酶组相对于空白组来说荧光增强了14倍，混合组和凝血酶组荧光差异不大，其他组和对照组相比没有显著差异，这说明检测体系中干扰蛋白的存在不影响凝血酶的检测。
[0053] 以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。