一种长江鲟促食欲因子胃动素成熟肽及其应用

摘要

本发明提供了一种长江鲟促食欲因子胃动素成熟肽及其应用，属于水产养殖技术领域。本发明以长江鲟为试验对象，克隆了长江鲟胃动素的核苷酸序列，利用原核表达技术获得了具有生物学功能的长江鲟胃动素成熟肽，通过腹腔注射和体外组织孵育试验，发现胃动素成熟肽可显著增加长江鲟的摄食量，显著影响胃动素受体及食欲调节因子的表达量，对长江鲟的摄食具有促进作用。本发明有利于丰富长江鲟食欲变化的检测指标，促进长江鲟摄食，提高转食成功率，优化长江鲟的保护策略，为鲟鱼乃至鱼类摄食调控和生长研究提供理论参考。

权利要求

1.一种长江鲟促食欲因子胃动素成熟肽在增加长江鲟摄食量中的应用，其特征在于，所述成熟肽编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述成熟肽可以降低长江鲟胃动素受体Motilin receptor表达量，增加长江鲟脑中食欲调节因子POMC、NPY和AgRP的表达量。

说明书

一种长江鲟促食欲因子胃动素成熟肽及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及水产养殖技术领域，特别涉及一种长江鲟促食欲因子胃动素成熟肽及其应用。

背景技术

[0002] 摄食是动物生命活动的基础，如何调控摄食、提高摄食效率已经成为影响动物生存、生长和发育的关键问题。动物摄食量过高会降低饲料利用效率，而摄食量过低则导致摄入营养不能满足机体需要。动物摄食主要由中枢神经系统和外周组织分泌的食欲调控因子通过神经和内分泌途径联合调控。目前，已从动物中枢神经系统和外周组织中分离得到一系列与摄食调控相关的食欲因子。如中枢食欲因子如阿黑皮素原(Proopiomelanocortin,POMC)、神经肽Y(NeuropeptideY,NPY)、刺鼠相关蛋白(Agouti‑relatedprotein，AgRP)和增食欲素(Orexin)，肝脏中瘦素(Leptin)和抵抗素(Resistin)，胰脏中胰淀素(Amylin)等可直接调控动物摄食，或通过调控动物体内能量平衡影响摄食。此外，在脊椎动物中，胃肠道是动物重要的内分泌器官，在摄食调控中扮演了尤为重要的角色，其释放的胃肠激素如缩胆囊收缩素(Cholecystokinin，CCK)、胃饥饿素(Ghrelin)和胃动素(Motilin)等作为外周重要的食欲调节肽。

[0003] 长江鲟(Acipenserdabryanus)是中国长江上游特有的淡水定居性鲟科鱼类，为中国Ⅰ级保护动物和世界自然保护联盟极危保护物种，目前长江鲟资源的恢复主要依靠人工养殖及增殖放流，幸运的是目前已实现长江鲟的全人工繁殖，长江鲟具有较高的环境资源价值和科研价值。长江鲟的养殖周期长，生长速度缓慢，尤其在人工转食阶段和水温极低条件下其食欲和摄食量下降，甚至出现不食的现象，导致存活率较低，生长发育缓慢或停止，这与长江鲟的摄食状况密切相关。目前，对长江鲟摄食调控的探究仍处在初步阶段，仅见抑食欲因子促肾上腺皮质激素释放因子(CorticotropinReleasing FactorSystem,CRF)和Leptin影响长江鲟食欲的报道。因此，开展长江鲟的摄食调控研究对长江鲟的摄食调控、生长研究具有重要理论及现实意义。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明目的在于提供一种长江鲟促食欲因子胃动素成熟肽及其应用，本发明提供的长江鲟促食欲因子胃动素成熟肽能够有效调节胃动素受体、食欲调节因子的表达量，增加长江鲟的摄食量。

[0005] 为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

[0006] 一种长江鲟促食欲因子胃动素成熟肽，所述成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

[0007] 本发明还提供一种编码上述方案所述成熟肽的成熟肽编码序列，所述成熟肽编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

[0008] 本发明还提供一种包含上述方案所述成熟肽编码序列的重组质粒，所述重组质粒的构架用骨架质粒包括PET‑32a。

[0009] 本发明还提供一种包含上述方案所述重组质粒的重组菌，所述重组菌的原始菌包括大肠杆菌DH5α。

[0010] 本发明还提供一种上述方案所述成熟肽、所述成熟肽编码序列、所述重组质粒或所述重组菌在增加长江鲟摄食量中的应用。

[0011] 本发明还提供一种上述方案所述成熟肽、所述成熟肽编码序列、所述重组质粒或所述重组菌在调节长江鲟胃动素受体表达量中的应用。

[0012] 本发明还提供一种上述方案所述成熟肽、所述成熟肽编码序列、所述重组质粒或所述重组菌在影响长江鲟食欲调节因子表达量中的应用。

[0013] 有益技术效果：本发明提供了一种长江鲟促食欲因子胃动素成熟肽及其应用，本发明以长江鲟为试验对象，克隆了长江鲟胃动素的核苷酸序列，利用原核表达技术获得了具有生物学功能的长江鲟胃动素成熟肽，通过腹腔注射和体外组织孵育试验，发现胃动素成熟肽可显著增加长江鲟的摄食量，显著影响胃动素受体及食欲调节因子的表达量，对长江鲟的摄食具有促进作用。本发明有利于丰富长江鲟食欲变化的检测指标，促进长江鲟摄食，提高转食成功率，优化长江鲟的保护策略，为鲟鱼乃至鱼类摄食调控和生长研究提供理论参考。

附图说明

[0014] 图1A为长江鲟Motilin成熟肽序列PCR胶回收电泳图；图1B为重组的长江鲟Motilin克隆质粒的电泳图；图1C为表达重组质粒Motilin/pET32a的电泳图；图1D为长江鲟Motilin成熟肽重组序列示意图；

[0015] 图2为长江鲟Motilin/pET‑32a表达菌和pET‑32a空载菌的SDS‑PAGE结果图；

[0016] 图3为诱导时间对长江鲟Motilin/pET‑32a重组蛋白表达的影响；图3B为IPTG浓度对长江鲟Motilin/pET‑32a重组蛋白表达的影响；

[0017] 图4为长江鲟Motilin/pET‑32a重组蛋白和pET‑32a的Western‑blotting检测结果图；

[0018] 图5为长江鲟Motilin/pET‑32a重组蛋白存在形式的检测结果图；其中箭头指向的为Motilin/pET‑32a重组蛋白；

[0019] 图6A为Motilin/pET‑32a和PET‑32a空载蛋白的Ni‑NTP亲和层析结果图；其中，1～5为Ni‑NTP纯化蛋白；图6B为pET‑32a空载蛋白和Motilin/pET‑32a重组蛋白的PBS透析复性结果图；

[0020] 图7为Motilin/pET‑32a对瓣肠MotilinreceptormRNA表达量的影响；

[0021] 图8为腹腔注射Motilin/pET‑32a对长江鲟摄食量(A)、累积摄食量(B)和消化道充塞指数(C)的影响；#和*分别表示同一时间点腹腔注射Motilin/pET‑32a的剂量为30ng/gBW、90ng/gBW时与PBS组之间差异显著；

[0022] 图9为腹腔注射Motilin/pET‑32a对长江鲟体内胃动素受体表达量的影响；

[0023] 图10为腹腔注射Motilin/pET‑32a对长江鲟体内食欲调节因子表达量的影响。

[0024] 图11为10‑7M和10‑6MMotilin/32a对长江鲟脑和胃中Ghrelin(A、C)和CCK(B、D)表达量的影响。

[0025] 图12为10‑7M和10‑6MMotilin/32a对长江鲟脑中POMC(A)、CART(B)、NPY(C)和AgRP(D)表达量的影响。

具体实施方式

[0026] 一种长江鲟促食欲因子胃动素成熟肽，所述成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：FLSFFSPSDMRRMMEKEKSKTG；

[0027] 在本发明中，所述长江鲟促食欲因子胃动素的氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示，具体为：

[0028] MVHGKVIGSLLVVCLMAMLAEQTEGFLSFFSPSDMRRMMEKEKSK TGKKSVRSGETESGELAAPERYMEEEAARLGSPLELGVRLSPRQFDKYG AALGEVLNEMLEEGGKAQ；其中26～47的片段为长江鲟促食欲因子胃动素成熟肽，分子量为2640.08Da。

[0029] 本发明还提供一种编码上述方案所述成熟肽的成熟肽编码序列，所述成熟肽编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为：

[0030] TTTCTCAGCTTCTTCAGCCCCAGTGACATGAGGAGGATGATGGAG AAGGAGAAGAGCAAGACGGGG。

[0031] 本发明还提供一种包含上述方案所述成熟肽编码序列的重组质粒，所述重组质粒的构架用骨架质粒包括PET‑32a。

[0032] 在本发明中，所述成熟肽编码序列在PET‑32a上的插入位点优选为BamHⅠ和HindⅢ。

[0033] 在本发明中所述胃动素成熟肽克隆的引物为SEQ ID NO：4～SEQ IDNO：5，其中，SEQ ID NO：4为胃动素成熟肽克隆的正向引物，所述SEQ IDNO：5为胃动素成熟肽克隆的反向引物，SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：5的Tm值均为63℃，所述SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：5的核苷酸序列如下所示：

[0034] SEQ ID NO：4：CGCGGATCCTTTCTCAGCTTCTTCAG；

[0035] SEQ ID NO：5：CCAAGCTTCCCCGTCTTGCTCTTCT。

[0036] 本发明还提供一种包含上述方案所述重组质粒的重组菌，所述重组菌的原始菌包括大肠杆菌DH5α。

[0037] 在本发明中，所述重组质粒在表达菌株中的表达包括筛选阳性克隆菌和通过诱导表达获得Motilin/pET‑32a表达效率最优的表达条件，包括37℃下的诱导表达时间和异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导表达浓度。

[0038] 本发明还提供一种上述方案所述成熟肽、所述成熟肽编码序列、所述重组质粒或所述重组菌在增加长江鲟摄食量中的应用。

[0039] 在本发明中，所述应用中成熟肽的含量优选为30ng/gBW～90ng/gBW；本发明对所述应用的类型没有特殊限定，采用成熟肽、成熟肽编码序列、重组质粒或重组菌可接受的应用类型即可。

[0040] 本发明还提供一种上述方案所述成熟肽、所述成熟肽编码序列、所述重组质粒或所述重组菌在调节长江鲟胃动素受体表达量中的应用。

[0041] 在本发明中，所述应用中成熟肽腹腔注射的含量优选为90ng/gBW；本发明对所述应用的类型没有特殊限定，采用成熟肽、成熟肽编码序列、重组质粒或重组菌可接受的应用类型即可。

[0042] 本发明还提供一种上述方案所述成熟肽、所述成熟肽编码序列、所述重组质粒或所述重组菌在影响长江鲟食欲调节因子表达量中的应用。

[0043] 在本发明中，所述应用中成熟肽体外组织孵育的含量优选为90ng/gBW；所述食欲调节因子包括：本发明对所述应用的类型没有特殊限定，采用成熟肽、成熟肽编码序列、重组质粒或重组菌可接受的应用类型即可。

[0044] 为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

[0045] 本发明所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0046] 实施例1长江鲟促食欲因子胃动素基因的克隆

[0047] (1)基因克隆和组织分布样品采集及RNA提取和cDNA合成

[0048] 在投喂前6h，选取5尾(277.17±31.15g)健康的长江鲟，用0.01％MS‑222麻醉后，采取脑、食道、贲门胃、幽门胃、幽门盲囊、十二指肠、瓣肠、直肠、肝、脾、肾和胰腺组织，于液氮中速冻后研磨成粉置于‑80℃储存，进行RNA提取。根据AnimalTotalRNAIsolationKit(FOREGENE)说明书提取上述长江鲟组织样品的总RNA。经1.5％琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白仪进行RNA完整性、浓度和纯度检测。随后分别根据PrimeScriptTMRTReagent Kit037A(TaKaRa)、SMARTRACEcDNAConstructionKit(Clontech) 和PrimeScriptTMRTReagentKit047A(TaKaRa)说明书制备十二指肠逆转录‑聚合酶链式反应(RT‑PCR)和cDNA末端快速克隆(RACE)的cDNA模板，并制备12个组织样品的qPCR的模板，用于基因克隆、和组织分布定量分析。

[0049] (2)胃动素的克隆

[0050] 参考本课题组长江鲟转录组和Genbank数据库中小体鲟基因组Motilin核苷酸序列，利用Primer5.0软件设计Motilin基因核心片段和3’RACE的克隆引物，引物由生工生物工程股份有限公司合成。

[0051] 基因核心片段克隆：以长江鲟十二指肠cDNA为模板，进行PCR扩增。

[0052] PCR反应体系为：10μL：2×TaqPCRPreMix5μL、ddH2O3μL、cDNA模板1μL、上下游引物各0.5μL。

[0053] PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，引物退火温度51℃30s，72℃延伸1min，34个循环，72℃延伸5min，12℃forever。

[0054] PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测分析条带大小。根据Universal DNAPurificationKit试剂盒说明书回收目的条带，将目的片段连接到pMD19‑T载体，并转化入DH5α感受态细胞中，涂布于固体培养基上，挑选阳性克隆菌送生工生物工程股份有限公司测序。

[0055] 3’RACE：在获得基因核心片段的基础上，结合特异性接头引物，使用SMARTRACEcDNA试剂盒进行3’RACE克隆。PCR反应条件同基因核心片段克隆。

[0056] 克隆所述长江鲟促食欲因子胃动素基因所需的引物序列如SEQ ID NO：6～SEQ ID NO：9所示。其中，SEQ ID NO：6～SEQ ID NO：7用于胃动素基因核心片段的克隆，SEQ ID NO：6为胃动素基因核心片段的克隆的正向引物，SEQ ID NO：7为胃动素基因核心片段的克隆的反向引物，SEQ ID NO：6～SEQ ID NO：7的Tm值均为56℃；SEQ ID NO：8～SEQ ID NO：9用于
3’RACE的克隆，SEQ ID NO：8为3’RACE的克隆的正向引物1，SEQ ID NO：9为3’RACE的克隆的正向引物2，SEQ ID NO：8～SEQ ID NO：59的Tm值均为62℃。SEQ ID NO：6～SEQ ID NO：9的序列如下所示：

[0057] SEQ ID NO：6：AGCAAACAGCACAAGGAAAC；

[0058] SEQ ID NO：7：ATGTATCTCTCTGGAGCGGC；

[0059] SEQ ID NO：8：GACACGATGGTCCACGGCAAGGT；

[0060] SEQ ID NO：9：GATGGAGAAGGAGAAGAGCAAGACGG。

[0061] 本实施例获得了长江鲟Motilin基因序列(GenBank：OM141116)，经鉴定MotilincDNA有561bp，包括38bp的5’‑UTR，184bp的3’‑UTR和339bp的完整ORF。

[0062] 实施例2长江鲟Motilin的体外重组表达及活性分析

[0063] (1)长江鲟Motilin成熟肽的克隆：根据实施例1克隆获得的长江鲟Motilin编码区，分析成熟肽的位置，分别设计带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点和保护碱基的上下游引物(SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：5)。对Motilin成熟肽序列进行PCR扩增，并对目的片段进行回收，获得83bp的胶回收产物，回收产物的电泳图如图1A所示。

[0064] 参照实施例1中基因克隆的方法将目的片段回收后连接到pMD19‑T载体中，并转化到DH5α感受态细胞中，挑选菌进行测序验证，获得重组的长江鲟Motilin克隆质粒。其中，测序验证使用的引物为SEQ ID NO：10～SEQ ID NO：11，其中SEQ ID NO：10为正向引物，SEQ ID NO：11为反向引物，SEQ ID NO：10～SEQ ID NO：11的核苷酸序列如下所示；测序验证的电泳图如图1B所示。

[0065] SEQ ID NO：10：CGCGGATCCTTTCTCAGCTTCTTCAG；

[0066] SEQ ID NO：11：CCAAGCTTCCCCGTCTTGCTCTTCT；

[0067] (2)重组质粒的构建：提取重组的长江鲟Motilin克隆质粒和表达载体pET‑32a，同时使用BamHⅠ和HindⅢ双酶切37℃处理30min，进行胶回收，以T4连接酶连接到pET‑32a表达载体，转化至DH5α感受态细胞中，挑选菌进行测序验证，获得表达重组质粒Motilin/pET32a。其中，测序验证使用的引物为SEQ ID NO：12～SEQ ID NO：13，其中SEQ ID NO：12为正向引物，SEQ ID NO：13为反向引物，SEQ ID NO：12～SEQ ID NO：13的核苷酸序列如下所示；测序验证的电泳图如图1C所示，长江鲟Motilin成熟肽重组序列如图1D所示。

[0068] SEQ ID NO：12：TAATACGACTCACTATAGGG；

[0069] SEQ ID NO：13：GCTAGTTATTGCTCAGCGG；

[0070] (3)重组质粒在表达菌株中的表达：提取Motilin/pET‑32a表达重组质粒，转化到表达菌株BL21(DE3)感受态细胞中，挑选阳性克隆菌测序验证，测序验证使用pET‑32a通用引物SEQ ID NO：14～SEQ ID NO：15，其中SEQ ID NO：14为正向引物，SEQ ID NO：15为反向引物，SEQ ID NO：14～SEQ ID NO：15的核苷酸序列如下所示：

[0071] SEQ ID NO：14：TAATACGACTCACTATAGGG；

[0072] SEQ ID NO：15：GCTAGTTATTGCTCAGCGG；

[0073] 测序正确的表达菌在含有氨苄青霉素的LB培养基中37℃220r/min培养至OD600值达0.4～0.6，添加1mmol/L异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷(Isopropyl‑Beta‑D‑Thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达6h，对诱导表达后的Motilin/pET‑32a表达菌和pET‑32a空载菌进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS‑PAGE)检测，确定目的蛋白是否表达，SDS‑PAGE的检测结果如图2所示。

[0074] 获得最优表达条件：通过设置不同的诱导表达时间(0h、2h、4h、6h、8h、10h和12h)和不同IPTG诱导表达浓度(0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L和2.0mmol/LIPTG)，其它条件不变，获得Motilin/pET‑32a表达效率最优的诱导表达时间和IPTG诱导表达浓度。诱导时间和IPTG浓度对长江鲟Motilin/pET‑32a重组蛋白表达的影响分别见图3A和图3B。由图3A可以看出，在37℃条件下长江鲟Motilin/pET‑32a的最优诱导表达时间为8h，由图3B可以看出，在37℃条件下长江鲟Motilin/pET‑32a的最优IPTG诱导表达浓度为1.0mmol/L。

[0075] (4)通过最优表达条件，收集Motilin/pET‑32a表达菌液，与pET‑32a空载表达菌分别经SDS‑PAGE电泳后，利用湿电转膜仪将蛋白分别转移到0.2μmPVDF膜(碧云天)上，使用膜封闭液封闭，以抗6×His标签鼠单克隆抗体为一抗，HRP标记山羊抗小鼠IgG为二抗，分别4℃孵育过夜和常温孵育1h～2h，利用ImmobilonWesternChemiluminescentHRPSubstrate显色，观察拍照，检测目的蛋白是否表达特异。检测结果如图4所示。

[0076] (5)重组蛋白的纯化和复性：经最适条件诱导表达的重组菌，5000r/min离心4min收集菌体，PBS洗涤后重悬，加0.1mg/mL溶菌酶，37℃低速震荡溶菌30min，随后经过反复冻融彻底破碎菌体，形成上清液和沉淀，利用SDS‑PAGE检测pET32a、Motilin/pET32a、Motilin/pET32a沉淀、Motilin/pET32a上清，检测结果如图5所示，由图5可以看出，Motilin/pET‑32a表达菌破碎后的沉淀和上清中均存在长江鲟Motilin/pET‑32a，但Motilin/pET‑32a蛋白在沉淀中的浓度更高，表明Motilin/pET32a蛋白主要以包涵体蛋白的形式存在。

[0077] 将包涵体蛋白在尿素中溶解过夜，经7500r/min离心10min，取上清用0.45μm微孔滤膜过滤，通过ProteinIsoNi‑NTAResin试剂盒Ni‑NTA亲和层析介质分离纯化融合蛋白，经过PBS透析复性后，利用ProteinQuantitativeKit(BCA)检测纯化后重组蛋白的浓度，再以0.22μm微孔膜过滤除菌后做好标记于‑80℃超低温冰箱保存备用。同时，采用相同的方式制备PET‑32a空载蛋白备用。Motilin/pET‑32a和PET‑32a空载蛋白的Ni‑NTP亲和层析结果如图6A所示，由图6A可以看出，Ni‑NTP亲和层析介质可有效分离纯化包涵体中Motilin/pET‑
32a蛋白，纯化的Motilin/pET‑32a蛋白相对分子质量为23.04kDa，符合预期大小；pET‑32a空载蛋白和Motilin/pET‑32a重组蛋白的PBS透析复性结果如图6B所示，由图6B可以看出，Motilin/pET‑32a重组蛋白可溶于PBS，检测结果也符合预期大小。

[0078] 选择3尾健康、体重为310.9±59.9g的长江鲟，使用冰水混合物进行低温麻醉，断头处理后分离瓣肠组织，置于无菌PBS中，并于超净工作台中用无菌PBS清洗至澄清，用灭菌3 3
冷却后的剪刀将组织剪碎至1mm～2mm的组织碎片。将剪碎的瓣肠碎片均匀分配到24孔培养板中，每孔加入1mLDMEM培养基和1％的双抗，置于25℃、5％的二氧化碳培养箱预孵育3h。

[0079] 将(5)中所得的Motilin/pET32a用PBS分别稀释至10‑5M、10‑6M、10‑7M；在DMEM培养‑5 ‑6 ‑基中分别混合等量的PBS、pET‑32a、10 MMotilin/pET32a、10 MMotilin/pET32a、10
7
MMotilin/pET32a。将上述培养基分别添加到已预孵育3h的培养板中，每种处理设有三个孔数的重复，在25℃、5％的二氧化碳培养箱中孵育1h后，收样至RNAstoreReagent，用于RNA提取，比较分析MotilinreceptormRNA表达量的变化。Motilin/pET‑32a对瓣肠Motilin ‑6
receptormRNA的影响如图7所示，由图7可以看出，10 MMotilin/pET‑32a蛋白显著降低瓣肠‑5 ‑7
MotilinreceptormRNA的水平(P<0.01)，10 M和10 MMotilin/pET‑32a蛋白对
MotilinreceptormRNA没有显著的影响。

[0080] 实施例3腹腔注射试验

[0081] (1)腹腔注射Motilin/pET‑32a对长江鲟摄食的影响

[0082] 选取72尾健康、体重为56.3±8.3g的长江鲟，随机分为4组，每组3个重复，每个重复3尾鲟。4组分别腹腔注射PBS、pET‑32a、3ng/gBW Motilin/pET‑32a、30ng/gBWMotilin/pET‑32a和90ng/gBWMotilin/pET‑32a。

[0083] 为最大程度减少长江鲟的应激反应，在注射多肽的正式试验前2d，每天13:30开始，对试验鱼用质量浓度为0.01％的MS‑222麻醉、称重和腹腔注射PBS的适应性处理。投喂点14:00记为0h，分别在0h、1h和3h分别投喂预先称量的饲料。在1h、3h和6h收集饲料残饵，同时在每个时间点设置空白对照组。将饲料残饵于60℃烘箱烘至恒重，检测1h、3h和6h长江鲟摄食量变化，计算累积摄食量，明确腹腔注射Motilin/pET‑32a有食欲调控效应。

[0084] 腹腔注射Motilin/pET‑32a对长江鲟摄食量(A)、累积摄食量(B)和消化道充塞指数(C)的影响如图8所示，由图8可以看出，腹腔注射Motilin/pET‑32a也可促进长江鲟摄食。与PBS对照组相比(PBS组和pET‑32a组间无显著差异)，3ng/gBWMotilin/pET‑32a对长江鲟的摄食量和累积摄食量均没有显著的变化。30ng/gBWMotilin/pET‑32a可显著增加长江鲟
0h～1h的摄食量(P<0.05)，90ng/gBWMotilin/pET‑32a可显著增加长江鲟0h～1h和1h～3h的摄食量(P<0.01)，但Motilin/pET‑32a在3ng/gBW、30ng/gBW和90ng/gBW三种剂量在3h～
6h时对长江鲟摄食量均没有显著的影响(图8A)。与PBS对照组相比(PBS组和pET‑32a组间无显著差异)，30ng/gBWMotilin/pET‑32a和90ng/gBWMotilin/pET‑32a可显著增加1h、3h和6h的累积摄食量(图8B)。同时，根据摄食量获得有效剂量和有效时间点，通过腹腔注射90ng/gBWMotilin/pET‑32a1h后，消化道充塞指数也显著高于PBS对照组(图8C)。

[0085] 上述结果表明，腹腔注射Motilin/pET‑32a均可促进长江鲟摄食。

[0086] (2)腹腔注射Motilin/pET‑32a对长江鲟体内胃动素受体和食欲调节因子表达量的影响

[0087] 选取27尾体重为61.6±8.6g、正常摄食的长江鲟，分为3组，每组3个重复，每个重复3尾鲟，3组分别腹腔注射PBS和pET‑32a，以及有效剂量90ng/gBWMotilin/pET‑32a。每组随机选取6尾鲟，进行消化道食物团重量和鱼体去内脏后的重量的称重，计算消化道充塞指数(Fillnessindex，记作万分数)＝(消化道内食物团重量/鱼体去内脏后重量)×10000。采取长江鲟脑、胃和十二指肠组织，检测Motilinreceptor或食欲调控因子(脑：Motilin receptor、POMC、CART、NPY、AgRP、Apelin、NUCB2、NPFF、Ghrelin、CCK和Gastrin；胃：Ghrelin、CCK和Gastrin；十二指肠：Motilinreceptor)mRNA表达量的变化，荧光定量引物为SEQ ID NO：16～SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：16～SEQ ID NO：43的对应检测物质及核苷酸序列见表2，其中F代表正向引物，R代表反向引物。

[0088] 表2荧光定量引物

[0089]

[0090]

[0091] 腹腔注射Motilin/pET‑32a对长江鲟体内胃动素受体表达量的影响如图9所示。通过腹腔注射90ng/gBWMotilin/pET‑32a1h后，检测了长江鲟脑和胃中MotilinreceptormRNA表达量的变化。结果发现，与对照组相比，在长江鲟脑和胃中，90ng/gBWMotilin/pET‑32a均可显著降低Motilinreceptor的表达量(脑P<0.05，胃P<0.01)。

[0092] 腹腔注射Motilin/pET‑32a对长江鲟体内食欲调节因子表达量的影响如图10所示。腹腔注射90ng/gWBMotilin/pET‑32a也会影响长江鲟脑和胃中食欲调节因子的表达水平。在脑中，Motilin/pET‑32a可显著降低CART、NPY、AgRP、Apelin、NUCB2和CCKmRNA的表达量，对POMC、NPFF、Ghrelin和Gastrin无显著影响(图10A)。在胃中，Motilin/pET‑32a显著降低Ghrelin和CCKmRNA的表达量(P<0.05)，对Gastrin没有显著的影响(图10B)。

[0093] 实施例4胃动素孵育全脑和胃组织试验

[0094] 参照Zhou等(ZhouYY,QiX,WenHSetal.Identification,expression analysis,andfunctionalcharacterizationofmotilinanditsreceptorinspottedsea bass(Lateolabraxmaculatus)[J].GenCompEndocrinol,2019,277:38‑48.)的方法，优化后进行体外全脑和胃组织的培养。简单来讲，选取9尾健康、体重为679.1±101.7g的长江鲟，使用冰水混合物对长江鲟进行麻醉，快速解剖并分离全脑和胃组织于无菌PBS中，于超净工作台
3 3
中用无菌PBS清洗至澄清，用灭菌冷却后的剪刀将组织剪碎至1mm ～2mm的碎片。在24孔板中，组织碎片于1mLDMEM培养基和1％的双抗，置于25℃、5％的二氧化碳培养箱预孵育3h(脑‑6
组织每孔约62.9mg，胃组织每孔约381.2mg)。随后用分别含有PBS、pET‑32a、10 MMotilin/‑7
pET‑32a和10 MMotilin/pET‑32a的双抗培养基，在25℃、5％的二氧化碳培养箱中培养1h和
3h，每个处理3个平行。孵育1h和3h后收集脑和胃组织于RNAstoreReagent中，储存在‑80℃下，用于检测相关食欲因子(脑：POMC、CART、NPY、AgRP、Ghrelin和CCK；胃：Ghrelin和CCK)mRNA表达量的变化。

[0095] 10‑7M和10‑6MMotilin/32a对长江鲟脑和胃中Ghrelin(A、C)和CCK(B、D)表达量的影响如图11所示。由图11可以看出，Motilin/pET‑32a也会影响脑和胃中胃肠激素Ghrelin‑7 ‑和CCKmRNA的表达，PBS对照组和pET‑32a组间均没有显著差异。在脑中，10 M和10
6 ‑6
MMotillin/pET‑32a分别显著增加Ghrelin1h和3h的表达量(图11A)。10 MMotillin/pET‑‑7 ‑6
32a显著降低CCK1h的表达量，3h时则显著增加(图11B)。在胃中，10 M和10 MMotillin/‑7
pET‑32a分别显著增加Ghrelin1h和3h的表达量(图11C)，10 M则显著降低CCK1h和3h的表达量(图11C和11D)。上述结果表明，在1h时，Motilin/pET‑32a可促进Ghrelin的表达量，降低CCK的表达。

[0096] 10‑7MMotilin/32a和10‑6MMotilin/32a对长江鲟脑中POMC(A)、CART(B)、NPY(C)和AgRP(D)表达量的影响如图12所示。由图12可以看出，Motilin/pET‑32a会影响脑中枢食欲调控因子POMC、CART、NPY和AgRPmRNA的表达，PBS对照组和pET‑32a组间均没有显著差异。‑7 ‑6 ‑7
10 M和10 MMotillin/pET‑32a显著增加脑POMC1h的表达量，10 M也能增加POMC3h的表达‑7 ‑6
量(图12A)。体外10 M和10 MMotillin/pET‑32a组织孵育1h时，CART的表达量显著降低，10‑6 ‑6 ‑7
M孵育3h时则显著高于对照组(图12B)。体外脑组织孵育1h和3h时，10 M和10 MMotilin/‑6
pET‑32a显著增加NPY的表达量(图12C)。10 MMotilin/pET‑32a体外脑组织孵育后，AgRP在
1h时显著增加，3h时无显著变化(图12D)。上述结果显示，在1h时Motilin/pET‑32a可降低CART的表达量，增加POMC、NPY和AgRP的表达。

[0097] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。