一种简单芽孢杆菌及其应用

摘要

本发明公开了一种简单芽孢杆菌及其应用，涉及微生物技术领域。本发明公开的简单芽孢杆菌（Bacillus simplex），该菌株为简单芽孢杆菌SEUNEU‑119，已于2022年7月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 20221157。实验表明，SEUNEU‑119具有促进细胞增殖、抗衰老的功能，可用于制备药品、化妆品等。

权利要求

1.一种简单芽孢杆菌（Bacillus simplex），该菌株为简单芽孢杆菌SEUNEU‑119，已于

2022年7月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO: M 20221157。

2.权利要求1所述的简单芽孢杆菌在制备改善皮肤状况的产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述改善皮肤状况为促进细胞增殖、抗衰老中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述促进细胞增殖包括促进皮肤角质细胞HaCaT增殖的作用。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗衰老为上调细胞生长因子相关基因VEGF的表达。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗衰老为下调降解细胞外基质相关基因的表达；所述降解细胞外基质相关基因为P38MAPK、MMP1、 MMP8、MMP10中的至少一种。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗衰老为下调炎症因子相关基因TNF‑α和/或IL‑6的表达；和/或下调细胞凋亡相关基因的表达；所述细胞凋亡相关基因为Caspase‑8、Caspase‑9中的至少一种。

8.根据权利要求2 7任一项所述的应用，其特征在于，所述产品为化妆品。

~

9.一种改善皮肤状况的产品，其特征在于，由包括权利要求1所述简单芽孢杆菌的上清液制成。

说明书

一种简单芽孢杆菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种简单芽孢杆菌及其应用。

背景技术

[0002] 皮肤衰老是受内在因素和外在环境因素相互作用的复杂过程，包括自然衰老和光老化。照射后可剌激皮肤细胞产生大量的活性氧，可氧化脂质、导致转录因子活化和损伤等，从而引起蛋白质、脂类以及核酸等生物大分子的结构发生改变、功能丧失，甚至使基因发生突变，最终引起衰老或癌变等。由于皮肤衰老的基础和本质是细胞的衰老，目前对皮肤衰老的研究主要是对皮肤成纤维细胞和角质形成细胞衰老的研究。皮肤衰老真皮的组织学改变主要为皮肤基质成分的改变，即胶原成分减少和异常弹性纤维沉积。分子学改变主要为表皮增生和分化性标志表达异常，基质金属蛋白酶表达增加，ROS异常表达并导致炎症发生，细胞增殖降低，细胞凋亡增加，细胞外基质成分随着皮肤衰老而显着减少。此外，多种因素如线粒体损伤、炎症反应等产生的活性氧增加，氧化应激增加，老化受损细胞无法及时清除，从而导致了皮肤衰老。

[0003] 皮肤微生物是皮肤微生态系统的重要成员，皮肤表面的菌群通常可分为常驻菌和暂驻菌，皮肤固有免疫系统联合皮肤微生物群是人体抵御致病微生物和机会致病菌的屏障。皮肤微生物分解磷脂、固醇类、角质蛋白可使皮肤细胞吸收并促进细胞生长、延缓衰老和减少皱纹产生。因此，提供一种利用微生物技术开发的皮肤微生态相关产品，在改善皮肤状态方面具有重要的现实意义。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明提供了一种简单芽孢杆菌及其应用。

[0005] 本发明提供了简单芽孢杆菌（Bacillus simplex），该菌株为简单芽孢杆菌SEUNEU‑119，已于2022年7月25日保藏在中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址为:武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072），其保藏编号为CCTCC NO: M 20221157的简单芽孢杆菌；

[0006] 本发明的另一目的在于提供了上述简单芽孢杆菌在制备改善皮肤细胞状况的产品中的应用。

[0007] 在一些实施方式中，所述改善皮肤状况为促进细胞增殖、抗衰老能力中的至少一种。

[0008] 在一些实施方式中，所述促细胞增殖包括促进皮肤角质细胞HaCaT增殖的作用。

[0009] 在一些实施方式中，所述抗衰老为上调细胞生长因子相关基因VEGF的表达。

[0010] 在一些实施方式中，所述抗衰老为下调降解细胞外基质相关基因的表达；所述降解细胞外基质相关基因为P38MAPK、MMP1 MMP8、MMP10中的至少一种。

[0011] 在一些实施方式中，所述抗衰老为下调炎症因子相关基因TNF‑α和/或IL‑6的表达；下调细胞凋亡相关基因的表达；所述细胞凋亡相关基因为Caspase‑8、Caspase‑9中的至少一种。

[0012] 在一些实施方式中，所述产品为药品或化妆品。

[0013] 本发明的另一目的在于提供了一种改善皮肤状况的产品，由包括上述的简单芽孢杆菌的原料制成。

[0014] 在一些实施方式中，所述产品中的简单芽孢杆菌包括如下（1）或（2）所示的一种或两种：

[0015] （1）上述的简单芽孢杆菌的活菌；

[0016] （2）上述的简单芽孢杆菌的上清液。

[0017] 本发明公开的简单芽孢杆菌SEUNEU‑119，其保藏编号为 CCTCC NO: M 20221157。实验表明，SEUNEU‑119具有促进细胞增殖、抗衰老能力的功能，可用于制备药品、化妆品等。

[0018] 生物保藏说明

[0019] 简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）SEUNEU‑119，于2022年7月25日保藏在中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址为:武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072），其保藏编号为CCTCC NO: M 20221157。

具体实施方式

[0020] 本发明提供了简单芽孢杆菌及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0021] 本发明的简单芽孢杆菌菌株SEUNEU‑119，来源于腐熟纯松针土，经16S rDNA鉴定为简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）。该菌株革兰氏阳性，显微镜下呈杆状；在BHI平板上生长，可形成表面光滑的半透明乳白色圆形菌落，边缘整齐；最适生长温度37℃。

[0022] 简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）SEUNEU‑119，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期：2022年7月25日，保藏编号为 CCTCC NO: M 20221157。

[0023] 进一步，本发明提供的简单芽孢杆菌SEUNEU‑119在本发明所述的应用或产品中, 存在形式是活的或死的或经间歇灭菌的，或为裂解物和/或提取物的形式，或为细菌产物的形式或为上清液形式或衍生物形式，所述衍生物形式优选地选自：代谢产物、代谢生物产物、外泌体、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖，和含有免疫原性成分的化合物，优选地选自：上清液。

[0024] 体外细胞实验表明，本发明的简单芽孢杆菌SEUNEU‑119具有促进人皮肤角质细胞HaCaT增殖的作用，增殖率114.14% 119.67%。~

[0025] 体外细胞实验表明，本发明的简单芽孢杆菌SEUNEU‑119具有上调HaCaT细胞细胞生长因子相关的血管内皮生长因子基因VEGF，基因相对表达倍数1.11 1.29；具有下调降解~细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因MMP1和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因P38MAPK，以及细胞炎症因子相关的肿瘤坏死因子α基因TNF‑α和白介素6基因IL‑6，基因相对表达倍数0.19 0.90。
~

[0026] 体外细胞实验表明，本发明的简单芽孢杆菌SEUNEU‑119具有下调HFF细胞降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因MMP，细胞凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶家族基因Caspase，基因相对表达倍数0.34 0.77。~

[0027] 本发明采用的试材皆为普通市售品，均可市售购买得到，下面结合实施例，进一步阐述本发明：

[0028] 实施例1 SEUNEU‑119的分离

[0029] 于腐熟纯松针土中采样。将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于BHI固体平板，37℃恒温培养16h后，挑取菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为SEUNEU‑119。

[0030] 革兰氏染色镜检：菌株SEUNEU‑119为革兰氏染色阳性，显微镜下呈杆状；在BHI平板上生长，可形成表面光滑的半透明乳白色圆形菌落，边缘整齐；最适生长温度37℃。

[0031] 实施例2 SEUNEU‑119的核酸鉴定

[0032] 1、16S rDNA基因序列分析：

[0033] 挑取单菌落置BHI液体培养基中，37℃摇床培养过夜后，12000转离心1min收集菌体，按照DNA提取试剂盒步骤进行操作。引物采用细菌通用引物27F,1492R，PCR扩增体系为50μL体系，95℃预变性5min；94℃ 15s，57℃ 15s，72℃ 40s，35个循环；72℃延伸10min。

[0034] 2、结果

[0035] PCR产物测序结果与GenBank中已发表的标准序列进行同源性比较（BLASTN）后得出SEUNEU‑119菌株为简单芽孢杆菌（Bacillus simplex）。

[0036] 实施例3：SEUNEU‑119促进SDS诱导的人永生化角质形成细胞HaCaT损伤修复实验[0037] 1、SEUNEU‑119上清液制备：

[0038] 挑取简单芽孢杆菌SEUNEU‑119单菌落于BHI液体培养基，37℃摇床培养16 18h，酶~标仪检测并以BHI稀释调整OD600=0.2，121℃，30min高压灭活，12000转离心2min，经0.22μm滤膜过滤为上清液。

[0039] 2、HaCaT细胞修复实验：

[0040] 接种HaCaT细胞（5×104cells/孔）至96孔板，过夜培养至细胞贴壁。配制50μg/ml SDS，每孔加入100μl，5%二氧化碳培养箱37℃培养8h。各孔分别添加5%上清液（对照组以等体积BHI替代上清液）培养24h。向每孔加入10μl的CCK‑8溶液，培养4h，检测450nm处吸亮度A。

[0041] 细胞存活率计算公式及结果如下表：

[0042]

[0043] 结果显示SEUNEU‑119对HaCaT细胞SDS损伤具有修复作用。

[0044] 实施例4：SEUNEU‑119调节光老化HaCaT细胞外基质/抗氧化相关基因表达实验[0045] 1、SEUNEU‑119上清液制备：

[0046] 制备方法参照实施例3。

[0047] 2、HaCaT细胞制备及紫外线损伤

[0048] 将HaCaT细胞消化后以0.5ml/孔（内含2×105细胞）接种至24孔板，5%二氧化碳培2
养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为2J/cm的紫外线UVB照射损伤。

[0049] 3、SEUNEU‑119添加

[0050] 将上清液5%（V/V）分别加入刺激过的HaCaT细胞（对照组以等体积BHI替代上清液）。每组3平行，37℃培养过夜。

[0051] 4、qPCR法检测细胞外基质/抗氧化相关基因相对表达倍数

[0052] 将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测细胞细胞生长因子基因VEGF，降解细胞外基质相关基因MMP1和P38MAPK，以及炎症因子相关基因TNF‑α和IL‑6的表达。以对照组‑ΔΔCT基因相对表达倍数F=1，利用2 法计算各样品F值。

[0053] 公式：F=2‑ΔΔCT，其中：

[0054] △CT实验=CT实验‑CT内参（实验）;

[0055] △CT对照=CT对照‑CT内参（对照）;

[0056] △△CT=△CT实验‑△CT对照。

[0057]

[0058] 结果显示加入SEUNEU‑119具有增加HaCaT细胞生长因子、减少细胞外基质降解、减少炎症因子的抗衰老作用。

[0059] 实施例5：SEUNEU‑119调节氧化损伤HFF降解细胞外基质/细胞凋亡相关基因表达实验

[0060] 1、SEUNEU‑119上清液制备：

[0061] 制备方法参照实施例３。

[0062] 2、HFF细胞制备及H2O2诱导氧化损伤

[0063] 将DMEM培养的HFF细胞消化后以0.5ml/孔（内含2×105细胞）接种至24孔板，5%二氧化碳培养箱37℃培养过夜。每孔加入终浓度为200μM的H2O2进行刺激，37℃静置1h。

[0064] 3、SEUNEU‑119添加

[0065] 将上清液5%（V/V）分别加入刺激过的HFF细胞（对照组以等体积BHI替代上清液）。每组3平行，37℃培养过夜。

[0066] 4、qPCR法检测细胞外基质/细胞凋亡相关基因相对表达倍数

[0067] 将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总RNA，检测RNA浓度及纯度后反转录为cDNA，以GAPDH为内参基因，采用实时qPCR检测以及降解细胞外基质相关基因MMP家‑ΔΔCT族，细胞凋亡相关基因Caspase家族的表达。以对照组基因相对表达倍数F=1，利用2 法计算各样品F值。

[0068] 上清液下调降解细胞外基质相关基因MMP家族，细胞凋亡相关基因Caspase家族，结果见下表：

[0069]

[0070] 结果显示加入SEUNEU‑119具有减少HFF细胞凋亡、减少细胞外基质降解的抗衰老作用。

[0071] 实施例6: 简单芽孢杆菌SEUNEU‑119上清液乳膏制备实例

[0072] SEUNEU‑119上清液乳膏的制备，组方如下表所示：

[0073] 制备工艺：将凡士林、液体石蜡、甜杏仁油、荷荷芭油、丁二醇、丙二醇、甘油、水、SEUNEU‑119上清液按照上表配方比例，分别加入烧杯中，最后加入仙婷G57，充分搅拌，直到形成质地均匀乳膏即可。所得SEUNEU‑119上清液乳膏体感润滑舒适。

[0074] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。