一种过表达蛋白酶的启动子、链霉菌重组菌及其构建方法与应用

摘要

本发明公开了一种过表达蛋白酶的启动子、链霉菌重组菌及其构建方法与应用。本发明发现一种过表达酶的启动子；并基于启动子工程和通过基因工程技术构建重组载体和链霉菌重组菌；该链霉菌重组菌可对蛋白酶Sep39和蛋白酶Sep40进行高效过表达，提高菌株的羽毛降解效率。本发明使用废弃羽毛为唯一碳氮源配制发酵培养基，通过固态发酵工艺对羽毛进行降解，回收得到可溶性的氨基酸和多肽；具有绿色高效等优势，实现廉价废弃羽毛的高值转化。

权利要求

1.一种过表达酶的启动子，其特征在于，其核酸序列如SEQ ID No.1所示，所述的酶为蛋白酶Sep39和/或蛋白酶Sep40。

2.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求1所述的过表达酶的启动子、蛋白酶Sep39的编码基因和蛋白酶Sep40的编码基因。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：

所述的蛋白酶Sep39的编码基因的序列如SEQ ID No.2所示；

所述的蛋白酶Sep40的编码基因的序列如SEQ ID No.3所示。

4.一种链霉菌重组菌，其特征在于，含有权利要求3所述的重组载体。

5.权利要求4所述的链霉菌重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）以pSET152‑ermE*质粒为模板通过PCR扩增得到pSET152质粒骨架；以链霉菌SCUT‑1基因组DNA为模板通过PCR扩增得到权利要求1所述的启动子，scutP1的片段；

（2）将步骤（1）得到的pSET152质粒骨架与启动子scutP1片段通过无缝克隆连接，得到带有启动子scutP1的重组质粒pSET152‑scutP1；

（3）以链霉菌SCUT‑1基因组DNA为模板，通过PCR分别扩增得到蛋白酶Sep39编码基因片段sep39和蛋白酶Sep40编码基因片段sep40；

（4）通过NdeI限制性核酸内切酶对步骤（2）得到的重组质粒pSET152‑scutP1进行酶切线性化；将线性化后的重组质粒pSET152‑scutP1分别与步骤（3）得到的sep39片段和sep40片段通过无缝克隆连接，获得重组质粒pSET152‑scutP1‑sep39和重组质粒pSET152‑scutP1‑sep40；

（5）以步骤（4）得到的重组质粒pSET152‑scutP1‑sep40为模板，通过PCR扩增得到片段scutP1‑sep40；通过NdeI限制性核酸内切酶对步骤（4）得到的重组质粒pSET152‑scutP1‑sep39进行酶切线性化；将线性化后的重组质粒pSET152‑scutP1‑sep39与片段scutP1‑sep40通过无缝克隆连接，获得重组质粒pSET152‑scutP1‑sep39‑scutP1‑sep40；

（6）将步骤（5）得到的重组质粒pSET152‑scutP1‑sep39‑scutP1‑sep40转化大肠杆菌ET12567/pUZ8002，再通过细菌接合的方式转入链霉菌SCUT‑1，获得链霉菌重组菌。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：

步骤（1）中PCR扩增得到pSET152质粒骨架用到的引物如下所示：pET152ProLineFw： 5’‑catatgttggggatcctctagaggatccg‑3’；

pET152ProLineRv： 5’‑agtcgacctgcagcccaagc‑3’；

步骤（1）中PCR扩增得到scutP1启动子片段用到的引物如下所示：scutP1‑Fw： 5’‑gcttgggctgcaggtcgactCGGCCCCTGAGCACGAA‑3’；

scutP1‑Rv： 5’‑tagaggatccccaacatatgGACGGTCCTTCCGGG‑3’；

步骤（3）中PCR扩增得到蛋白酶Sep39编码基因片段sep39用到的引物如下所示：sep39‑Fw：5’‑cggaaggaccgtccaATGAAGCGTTTCCGGATCG‑3’；

sep39‑Rv：5’‑ctagaggatccccaacatatgTCAGAGGCCGGACTTGAACA‑3’；

步骤（3）中PCR扩增得到蛋白酶Sep40编码基因片段sep40用到的引物如下所示：sep40‑Fw：5’‑ ccggaaggaccgtccaATGGCAGTGATGCGTCA ‑3’；

sep40‑Rv：5’‑ gccgcggatcctctagaTCAGGGGACGAGCCTGA ‑3’；

步骤（5）中PCR扩增得到片段scutP1‑sep40用到的引物如下所示：scutP1‑sep40‑Fw：5’‑gtccggcctctgacaCGGCCCCTGAGCACGAA‑3’；

scutP1‑sep40‑Rv：

5’‑ctagaggatccccaacaTCAGGGGACGAGCCTGAGCAGC‑3’。

7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：

步骤（6）中所述的转化的方法为电转化；

步骤（6）中所述的细菌接合包括以下步骤：

S1：将转化后的上述大肠杆菌接种至含有安普霉素、氯霉素和卡那霉素的LB培养基中，培养；取培养后得到的菌液，离心，去除上清；用LB培养基重悬菌体，离心，去除上清，得到大肠杆菌菌体；

S2：取链霉菌SCUT‑1 孢子保藏液孵育后，与步骤S1收集的大肠杆菌菌体混合均匀后，涂布于固体MS培养基平板，培养；

S3：取出培养后的固体MS培养基平板；将安普霉素和萘啶酮酸水溶液均匀覆盖在固体MS培养基平板上；平板充分晾干后培养；待MS培养基平板上长出明显单菌落后，用挑取单菌落接种至含有安普霉素和萘啶酮酸的种子液培养基中，震荡培养；

步骤S2中所述的链霉菌SCUT‑1孢子保藏液通过如下制备步骤制备：将链霉菌SCUT‑1接种至固体高氏1号培养基平板，培养至产生灰绿色孢子；将链霉菌SCUT‑1孢子接种至孢子保藏培养基，于4℃保藏，得到链霉菌SCUT‑1孢子保藏液；

所述的孢子保藏培养基包括以下组分：16 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物和5 g/L氯化钠。

8.权利要求4所述的链霉菌重组菌在降解羽毛制备发酵羽毛粉中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：

以羽毛为唯一的碳源和氮源制成发酵培养基，向所述发酵培养基中接种权利要求5所述的链霉菌重组菌进行发酵培养，降解羽毛得到发酵羽毛粉。

说明书

一种过表达蛋白酶的启动子、链霉菌重组菌及其构建方法与

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程和生物工程技术领域，特别涉及一种过表达蛋白酶的启动子、链霉菌重组菌及其构建方法与应用。

背景技术

[0002] 羽毛是禽类养殖过程中产生的主要废弃物之一，其重量可达禽类体重的5～10％。随着我国禽类养殖产业的快速发展，每年可产生数百万吨的废弃羽毛。羽毛中含有大约
85％的粗蛋白，是宝贵的可再生蛋白资源。饲料蛋白在畜牧业中需求巨大，廉价而富含蛋白质的废弃羽毛因而在畜牧业中拥有巨大的应用前景。然而，羽毛中存在大量的二硫键和分子间相互作用力，使其结构坚固难以被降解利用，导致其很难直接作为饲料蛋白被动物消化吸收。因此，目前的废弃羽毛大多被直接焚烧或填埋，不仅对羽毛这一高蛋白生物资源造成了极大浪费，还带来了严重的环境污染问题和公共卫生安全风险。

[0003] 羽毛的传统利用方式主要基于物理法或化学法。物理法主要是通过高温高压处理破坏羽毛结构，这种处理方式工艺简单、对设备需求低。但是为了维持高温高压条件，工艺所需能耗高昂。并且在处理过程中，对温度敏感的氨基酸，如半胱氨酸、赖氨酸等会被破坏，并产生硫化氢、氨气等废气污染，使得物理法回收废弃羽毛面临很大的局限性。而化学法则通常是利用酸碱氧化剂或者是还原剂来对羽毛进行处理，破坏其内部的化学键，从而制备可溶性的水解羽毛产品。化学法所需能耗低于物理法，但是在回收废弃羽毛时容易产生较为严重的废水污染，当使用酸碱试剂进行处理时，中和过程中产生的盐类也会造成产品盐浓度过高，致使其应用受到严重限制。高能耗、次生污染严重等问题使得物理和化学方法难以满足废弃羽毛回收的需求，亟待开发更加绿色高效的回收方法。

[0004] 生物法反应条件温和、污废产生少，是传统物理化学工艺回收废弃羽毛的绿色替代方法。生物法降解回收废弃羽毛主要包括酶解法和微生物发酵法两种。酶解法主要是利用蛋白酶对羽毛中的蛋白组分进行水解，得到氨基酸、多肽等水解产物，具有绿色环保、工艺简便等优点。但是富含二硫键的羽毛很难被单一的蛋白酶高效水解，往往需要与二硫键还原酶或还原剂(如亚硫酸钠)配伍使用，导致酶解法的成本过高。微生物发酵法则是利用具有羽毛降解能力的微生物，在发酵过程中直接对羽毛进行水解破坏，得到水解产物。微生物发酵法在兼具酶解法绿色环保等优点的同时，因微生物活细胞可同时具备二硫键还原机制，在发酵过程中大多无需额外添加二硫键还原酶或还原剂，从而比酶解法更具优势。然而目前大多数微生物的羽毛降解能力偏低，致使微生物发酵法的效率难以满足大规模生产需求。对微生物进行基因工程改造，提高微生物的羽毛降解能力，是充分利用微生物发酵法优势，实现废弃羽毛高效、绿色回收的关键。

[0005] 因此，有必要获得新的可高效降解回收羽毛的微生物菌株。

发明内容

[0006] 本发明的第一目的在于针对现有技术的不足，提供一种过表达酶的启动子；

[0007] 本发明的第二目的在于提供一种链霉菌重组菌；该链霉菌重组菌含有上述过表达酶的启动子，可对蛋白酶酶进行高效过表达，可提高菌株的羽毛降解效率。

[0008] 本发明的第三目的在于提供所述链霉菌重组菌的构建方法。

[0009] 本发明的第四目的在于提供所述过表达酶的启动子和链霉菌重组菌在降解羽毛中的应用。

[0010] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0011] 一种过表达酶的启动子scutP1，其核酸序列为(亦如SEQ ID No.1所示)：

[0012] CGGCCCCTGAGCACGAAGTAGGCGCCGACGGCCAGCAGCAGCGCCAGCTGCGCCCAGGCCGCCAGGAGCACCAGTCCCCGGTCCGCCATCGTCCGCCCTCCGCCCTTGCCTCCGTGTGGGCGGCCGCCTACCCCGGCCCCCGCGTCCGGATGCGCGCGGCGGCCGGCAGGCACCCGTCCGGGTGTGCGGCCGGGCGGGGGGCCGTCCCGCCGGGCGGGGGCCGTCCCGCCGGGCGGGGCCCGGGTCCTACCACTCCGGGGCGTGGATTTTCGGACGTTTCCCGCCGGGCGAGGGGGTACGGCGCCCGCGGGCCCGGCCCCACCCCTATGCTTCTACATGTCTGTAGAAACAAGCGAGGGCGGTGCGGGCCTCCCCTGCCGTCCTGCGGGACGCGGTCGTCCGGCCCGGCCGGGCCCCGGCCCGCACCTCTCTCTTTCGCATTCGTCCCCGGAAGGACCGTC。

[0013] 所述的酶优选为蛋白酶，更优选为蛋白酶Sep39和蛋白酶Sep40。

[0014] 所述的蛋白酶Sep39的编码基因的核酸序列为(亦如SEQ ID No.2所示)：

[0015] ATGAAGCGTTTCCGGATCGCAGCCCTGCTCCTGGCCGCCCCGACGGCCCTGATACCGGCCGCCGGCACGGCGTCCGCCGCCGAGGCCGCCACCCCGGTCGTCGCGGTCCAGAAGGCCGAGGCCGGCCAGGCCGTGAAGGGCAACTACATCGTCACCCTCAAGTCCGGCGTGGAGGCCGAGGACCTGACGGAGGCGAAGGACCTCTCGCCCCGCCACGTCTACTCCGAGGTGCTCAACGGCTTCGCCGCGAAGCTGACGGACGGCCAGCTGAAGTCGCTGCAGCGCGACTCCGCCGTCCTGGCCATCGAGGAGGACCAGAAGGTCACCGCCTCGGCCACCCAGTACAGCGCCACCTGGGGCCTGGACCGGATCGACCAGCGCAACCTGCCGCTGAGCGGCAGCTACACCTACAACCGCAACGGCGCGGGGGTGACGGCCTACATCATCGACACCGGCCTGGACACCTACCACTCCGAGTTCGGCGGCCGCGCCCGCAACGTCTTCGACGCCTTCGGCGGCAACGGCCAGGACTGCAACGGGCACGGCACCCACGTCGGCGGCACCGTCGGCGGCAGCACCCACGGCGTCGCCAAGGGCGTGGCGCTGCGCGGCGTGAAGGTGCTCGACTGCCAGGGCAGCGGCTCCTACTCGGGCATCATCGCCGGCTTCGACTGGGTGCGGCAGAACGCGGTGAAGCCCGCGGTGGCCAACGCCTCACTGGGCGGCGGCTACTCCTCCGCGGTGAACAACGCGGCCACCAACCTGGCCAACTCCGGCGTGCACCTGTCCGTCGCGGCCGGCAACGACAACCAGGACGCCTGCAACTACTCCCCGGCGAGCGCCCCGGGCGCCCTGAGCGTGGCCGCCTCCGACAGCGGCGACCGCAAGGCGTCGTTCAGCAACTACGGCAGCTGCACGGACCTCTACGCCCCCGGCGTGTCCATCACCTCCGCCCGCATGGGCGGCGGCGCCACCGCGATGAGCGGCACCTCGATGGCCTCCCCGCACGTCGCCGGTGTCGCCGCGCTGTACAAGGCGAACTACGGCGACGCCTCCTCCTCGACCGTCAACAGCTGGATCGTCAACAACTCCACCACCTACGTGATCAGCGGCAACTACAGCGGCACGCCCAACCGCCTGCTGTTCAAGTCCGGCCTCTGA。

[0016] 所述的蛋白酶Sep40的编码基因的核酸序列为(亦如SEQ ID No.3所示)：

[0017] ATGGCAGTGATGCGTCACACCAAGACCCGGTTCGCAGCGGCAGCCACCGCCGTCGTCGCGGCCGTCACCCTCGGCGCCGCCGCGGTTCCCGCCCAGGCCGCTCCCGCCGAGGGCCGCATCATCGGCGCCGGATCCGCCGACGCGGTCAAGGGCAGCTACATCGTCACGCTCAAGAAGGACACCGGTCTGAAGGCCGCCTCCGCCGCCGGCCGAAACGTCGTCAAGGAGCACGGCGGAACGATCAAGCACACCTACAAGGCGGCGCTGAACGGCTACGCCGCCCAGCTCACCGAGACCGAGGCCAAGCAGCTGGCCGCGGACCCGGCCGTGGAGTCCGTCGTCCAGGACGTCAAGGTCCAGGTCGACGCCACCCAGACCGGTGCCACCTGGGGCCTGGACCGCATCGACCAGGCCGCCCTGCCGCTCAACGGCTCCTACACCTACCCCGACTCCGCGGGCCAGGGCGTGACCGCGTACGTCATCGACACCGGCGTGCGCATCTCCCACAGCCAGTTCGGCGGCCGTGCGTTCAACGGCTACGACGCGGTCGACAACGACAACGTCGCCCAGGACGGCAACGGCCACGGCACCCACGTCGCCGGCACCATCGCCGGCAGCACCTACGGCGTCGCCAAGAAGGCCAAGATCGTCGGCGTGCGCGTGTTGGACAACAACGGCTCCGGCACCACCGCCGGCGTCATCAAGGGCATCGACTGGGTGACCGCCAACGCCCAGAAGCCGGCCGTGGCCAACATGAGCCTCGGCGGCGGCGCCAGCACCGCCCTGGACAACGCGGTGAAGAACTCCATCGCCTCCGGCGTCACCTACGCGGTGGCCGCGGGCAACTCCAACACCAACGCCTCCACGTCCTCCCCCGCCCGGGTGGCCGAGGCGATCACGGTCGGCTCCACGACCAACACCGACGCCCGTTCCAGCTTCTCCAACTACGGCTCGATCCTGGACATCTTCGCCCCCGGCTCGTCCATCACCTCCGCCTGGCACACCACGGACACGGCCACCAACACCATCTCCGGCACCTCGATGGCCACCCCGCACGTGGCCGGCGCCGCCGCCGTCTACCTGGCCGGCCACACCTCCGCCACCCCGGCCCAGGTGAGCACCGCCCTGGTCAACGGCGCCACCTCCAACGTCATCACCAGCCCGGGCAGCGGTTCCCCGAACAAGCTGCTCAGGCTCGTCCCCTGA。

[0018] 一种重组载体，含有上述过表达酶的启动子。

[0019] 所述的重组载体还含有目标基因；

[0020] 进一步地，所述的目标基因为酶的编码基因。

[0021] 更进一步地，所述酶的编码基因为蛋白酶的编码基因。

[0022] 再更进一步地，所述蛋白酶的编码基因为蛋白酶Sep39的编码基因和/或蛋白酶Sep40的编码基因。

[0023] 所述的重组载体中基础载体优选为pSET152。

[0024] 一种链霉菌重组菌，含有上述含有过表达酶的启动子、蛋白酶Sep39的编码基因和蛋白酶Sep40的编码基因的重组载体。

[0025] 上述链霉菌重组菌的构建方法，包括以下步骤：

[0026] (1)以pSET152‑ermE*质粒为模板通过PCR扩增得到pSET152质粒骨架；以链霉菌SCUT‑1基因组DNA为模板通过PCR扩增得到启动子scutP1片段；

[0027] (2)将步骤(1)得到的pSET152质粒骨架与启动子scutP1片段通过无缝克隆连接，得到带有启动子scutP1的重组质粒pSET152‑scutP1；

[0028] (3)以链霉菌SCUT‑1基因组DNA为模板，通过PCR分别扩增得到蛋白酶Sep39编码基因片段sep39和蛋白酶Sep40编码基因片段sep40；

[0029] (4)通过NdeI限制性核酸内切酶对步骤(2)得到的重组质粒pSET152‑scutP1进行酶切线性化；将线性化后的重组质粒pSET152‑scutP1分别与步骤(3)得到的sep39片段和sep40片段通过无缝克隆连接，获得重组质粒pSET152‑scutP1‑sep39和重组质粒pSET152‑scutP1‑sep40；

[0030] (5)以步骤(4)得到的重组质粒pSET152‑scutP1‑sep40为模板，通过PCR扩增得到片段scutP1‑sep40；通过NdeI限制性核酸内切酶对步骤(4)得到的重组质粒pSET152‑scutP1‑sep39进行酶切线性化；将线性化后的重组质粒pSET152‑scutP1‑sep39与片段scutP1‑sep40通过无缝克隆连接，获得重组质粒pSET152‑scutP1‑sep39‑scutP1‑sep40；

[0031] (6)将步骤(5)得到的重组质粒pSET152‑scutP1‑sep39‑scutP1‑sep40转化大肠杆菌ET12567/pUZ8002，再通过细菌接合的方式转入链霉菌SCUT‑1，获得链霉菌重组菌。

[0032] 步骤(1)中所述的链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT‑1为中国发明专利申请CN201910491700.8记载的链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT‑1。

[0033] 步骤(1)中所述的链霉菌SCUT‑1基因组DNA的提取步骤如下：

[0034] 将链霉菌SCUT‑1接种至固体高氏1号培养基平板，培养至产生灰绿色孢子；链霉菌SCUT‑1的孢子接种至种子液培养基，振荡培养，得到链霉菌SCUT‑1种子液；取1mL链霉菌SCUT‑1种子液，使用DNA快速抽提试剂盒提取基因组DNA。

[0035] 所述的固体高氏1号培养基包括以下组分：20g/L可溶性淀粉、1g/L硝酸钾、0.5g/L磷酸氢二钾、0.5g/L七水硫酸镁、0.5g/L氯化钠、0.01g/L七水硫酸亚铁和20g/L琼脂粉。

[0036] 所述的固体高氏1号培养基还包括蒸馏水。

[0037] 所述的种子培养基包括以下组分：10g/L胰蛋白胨、10g/L氯化钠和5g/L酵母提取物。

[0038] 所述的种子培养基还包括蒸馏水。

[0039] 所述的震荡培养的条件为30～45℃、150～250rpm震荡培养19～29h；优选为：37℃、220rpm震荡培养24h。

[0040] 所述的DNA快速抽提试剂盒优选为土壤基因组DNA快速抽提试剂盒。

[0041] 优选地，步骤(1)中PCR扩增得到pSET152质粒骨架用到的引物及引物序列如下所示：

[0042] pET152ProLineFw：5’‑catatgttggggatcctctagaggatccg‑3’；

[0043] pET152ProLineRv：5’‑agtcgacctgcagcccaagc‑3’。

[0044] 优选地，步骤(1)中PCR扩增得到启动子scutP1片段用到的引物及引物序列如下所示：

[0045] scutP1‑Fw：5’‑gcttgggctgcaggtcgactCGGCCCCTGAGCACGAA‑3’；

[0046] scutP1‑Rv：5’‑tagaggatccccaacatatgGACGGTCCTTCCGGG‑3’。

[0047] 优选地，步骤(3)中PCR扩增得到蛋白酶Sep39编码基因片段sep39用到的引物及引物序列如下所示：

[0048] sep39‑Fw：5’‑cggaaggaccgtccaATGAAGCGTTTCCGGATCG‑3’；

[0049] sep39‑Rv：5’‑ctagaggatccccaacatatgTCAGAGGCCGGACTTGAACA‑3’。

[0050] 优选地，步骤(3)中PCR扩增得到蛋白酶Sep40编码基因片段sep40用到的引物及引物序列如下所示：

[0051] sep40‑Fw：5’‑ccggaaggaccgtccaATGGCAGTGATGCGTCA‑3’；

[0052] sep40‑Rv：5’‑gccgcggatcctctagaTCAGGGGACGAGCCTGA‑3’。

[0053] 优选地，步骤(5)中PCR扩增得到片段scutP1‑sep40用到的引物及引物序列如下所示：

[0054] scutP1‑sep40‑Fw：5’‑gtccggcctctgacaCGGCCCCTGAGCACGAA‑3’；

[0055] scutP1‑sep40‑Rv：5’‑ctagaggatccccaacaTCAGGGGACGAGCCTGAGCAGC‑3’。

[0056] 步骤(6)中所述的转化的方法优选为电转化。

[0057] 步骤(6)中所述的细菌接合具体包括以下步骤：

[0058] S1：将转化后的将上述大肠杆菌接种至含有安普霉素、氯霉素和卡那霉素的LB培养基中，培养。取培养后得到的菌液，离心，去除上清；用LB培养基重悬菌体，离心，去除上清，得到大肠杆菌菌体；

[0059] S2：取链霉菌SCUT‑1孢子保藏液孵育后，与步骤S1收集的大肠杆菌菌体混合均匀后，涂布于固体MS培养基平板，培养；

[0060] S3：取出培养后的固体MS培养基平板；将安普霉素和萘啶酮酸水溶液均匀覆盖在固体MS培养基平板上；平板充分晾干后培养；待MS培养基平板上长出明显单菌落后，用挑取单菌落接种至含有安普霉素和萘啶酮酸的种子液培养基中，震荡培养。

[0061] 步骤S1中所述的含有安普霉素、氯霉素和卡那霉素的LB培养基包括以下组分：胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、酵母提取物5g/L、安普霉素50mg/L、氯霉素25mg/L和卡那霉素50mg/L。

[0062] 步骤S1中所述的含有安普霉素、氯霉素和卡那霉素的LB培养基还包括蒸馏水。

[0063] 步骤S1中所述的培养的条件为：30～45℃、150～250rpm培养12～20h；优选为37℃、220rpm震荡培养16h。

[0064] 步骤S1中所述的离心的条件优选为：6000×g离心2min。

[0065] 步骤S1中所述的用LB培养基重悬菌体优选用2mL的LB培养基重悬。

[0066] 步骤S2中所述的链霉菌SCUT‑1孢子保藏液优选通过如下制备步骤制备：

[0067] 将链霉菌SCUT‑1接种至固体高氏1号培养基平板，培养至产生灰绿色孢子；将链霉菌SCUT‑1孢子接种至孢子保藏培养基，于4℃保藏，得到链霉菌SCUT‑1孢子保藏液。

[0068] 所述的固体高氏1号培养基包括以下组分：20g/L可溶性淀粉、1g/L硝酸钾、0.5g/L磷酸氢二钾、0.5g/L七水硫酸镁、0.5g/L氯化钠、0.01g/L七水硫酸亚铁和20g/L琼脂粉。

[0069] 所述的固体高氏1号培养基还包括蒸馏水。

[0070] 所述的培养至产生灰绿色孢子的培养条件为30～45℃培养5～7天；优选为37℃培养5～7天。

[0071] 所述的孢子保藏培养基包括以下组分：16g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物和5g/L氯化钠。

[0072] 所述的孢子保藏培养基还包括蒸馏水。

[0073] 步骤S2中所述的孵育的条件为40～60℃孵育5～15min；优选为：50℃孵育10min。

[0074] 步骤S2中所述的固体MS培养基包括以下组分：20g/L甘露醇、20g/L黄豆粉、10mmol/L氯化镁和20g/L琼脂粉。

[0075] 步骤S2中所述的固体MS培养基还包括蒸馏水。

[0076] 步骤S2中所述的培养的条件为：20～40℃倒置培养12～20h；优选为：30℃倒置培养16h。

[0077] 步骤S3中所述的安普霉素和萘啶酮酸水溶液的溶质由以下组分组成：安普霉素1mg/L和萘啶酮酸0.5mg/L；溶剂为蒸馏水。

[0078] 步骤S3中所述的培养的条件为：30～45℃培养3～5天；优选为：37℃培养3～5天。

[0079] 步骤S3中所述的含有安普霉素和萘啶酮酸的种子液培养基包括如下组分：:胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、酵母提取物5g/L、安普霉素50mg/L和萘啶酮酸25mg/L。

[0080] 步骤S3中所述的含有安普霉素和萘啶酮酸的种子液培养基还包括蒸馏水。

[0081] 步骤S3中所述的震荡培养的条件为：30～45℃、150～250rpm震荡培养45～51h；优选为：37℃、220rpm震荡培养48h。

[0082] 上述链霉菌重组菌在降解羽毛制备发酵羽毛粉中的应用。

[0083] 所述的应用中，是以羽毛为唯一的碳源和氮源制成发酵培养基，向所述发酵培养基中接种上述链霉菌重组菌进行发酵培养，即可通过所述的重组菌降解羽毛得到发酵羽毛粉。

[0084] 所述的链霉菌重组菌降解羽毛得到发酵羽毛粉包括如下步骤：

[0085] P1：将链霉菌重组菌接种于种子培养基中，通过培养得到链霉菌重组菌种子液。

[0086] P2：将步骤P1所得的链霉菌重组菌种子液接种于发酵培养基中，发酵，得到发酵羽毛粉。

[0087] 步骤P1中所述种子培养基包括以下组分：10.0g/L胰蛋白胨、10.0g/L氯化钠和5.0g/L酵母提取物。

[0088] 步骤P1中所述种子培养基还包括蒸馏水。

[0089] 步骤P1中所述培养条件为：30～45℃，150～250rpm，培养时间15～35h。优选为37℃，220rpm，培养时间24h。

[0090] 步骤P2中所述发酵培养基由以下组分组成：600～700g/L干羽毛，余量为水；优选为667g/L干羽毛，余量为水。

[0091] 步骤P2中所述种子液的接种量为发酵培养基中干羽毛的质量的10％。

[0092] 步骤P2中所述发酵培养条件为：30～45℃，静置或震荡，培养时间50～70h。优选为40℃，静置，培养时间60h。

[0093] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

[0094] (1)本发明提供了一种来源于出发菌株链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT‑1的启动子，该启动子的启动效率比现有链霉菌通用强启动子ermE*明显提高，利用该启动子进行蛋白酶过表达的重组菌降解羽毛的能力得到显著增强；

[0095] (2)本发明通过基因工程技术构建了一株蛋白酶Sep39和蛋白酶Sep40的链霉菌，相较于出发菌株，该重组菌的蛋白酶活性得到了显著提升；

[0096] (3)本发明使用废弃羽毛为唯一碳氮源配制发酵培养基，通过固态发酵工艺对羽毛进行降解，回收得到可溶性的氨基酸和多肽。具有绿色高效等优势，实现廉价废弃羽毛的高值转化。

[0097] (4)本发明制备的发酵羽毛粉可作为动物饲料、植物有机肥等产品的优质原料，在农业生产中得到应用。

附图说明

[0098] 图1是重组载体pSET152‑scutP1‑sep39‑scutP1‑sep40图。

[0099] 图2是重组载体pSET152‑ermE*‑sep39‑ermE*‑sep40图。

[0100] 图3是出发菌株链霉菌SCUT‑1、重组菌SCUT‑Esep39‑Esep40、重组菌SCUT‑Osep39‑Osep40发酵羽毛的氨基酸回收量对比图。

[0101] 图4是出发菌株链霉菌SCUT‑1、重组菌SCUT‑Esep39‑Esep40、重组菌SCUT‑Osep39‑Osep40发酵羽毛的可溶性多肽回收量对比图。

[0102] 图5是出发菌株链霉菌SCUT‑1、重组菌SCUT‑Esep39‑Esep40、重组菌SCUT‑Osep39‑Osep40发酵羽毛时的蛋白酶酶活对比图。

具体实施方式

[0103] 下面结合实施例和附图说明对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。

[0104] 实施例1

[0105] 蛋白酶Sep39和蛋白酶Sep40过表达的链霉菌重组菌的构建

[0106] 1.链霉菌SCUT‑1的培养

[0107] 链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT‑1取适量接种于固体高氏1号培养基平板(固体高氏1号培养基由以下组分组成：可溶性淀粉20g、硝酸钾1g、磷酸氢二钾0.5g、七水硫酸镁0.5g、氯化钠0.5g、七水硫酸亚铁0.01g、琼脂粉20g和蒸馏水1L)，于37℃培养5～7天至产生灰绿色孢子。所述的链霉菌(Streptomyces sp.)SCUT‑1，保藏编号为GDMCC No：60612，该菌株于2019年3月20日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼的广东省微生物菌种保藏中心，已于中国发明专利申请CN201910491700.8中公开。

[0108] 2.链霉菌SCUT‑1基因组DNA的提取

[0109] (1)用接种环挑取步骤1得到的链霉菌SCUT‑1的孢子接种至种子液培养基(所述的种子培养基由以下组分组成：胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g和蒸馏水1L)，于37℃，220rpm条件下震荡培养24h，得到链霉菌SCUT‑1种子液。

[0110] (2)取1mL链霉菌SCUT‑1种子液，使用土壤基因组DNA快速抽提试剂盒(购自生工生物工程股份有限公司)提取基因组DNA，提取步骤按该试剂盒说明书的标准程序进行实验操作。

[0111] 3.链霉菌SCUT‑1孢子保藏液的制备

[0112] 用接种环挑取步骤1得到的链霉菌SCUT‑1的孢子接种至孢子保藏培养基(所述的孢子保藏培养基由以下组分组成：胰蛋白胨16g、酵母提取物10g、氯化钠5g和蒸馏水1L)，于4℃静置保藏5～7天，得到SCUT‑1孢子保藏液。

[0113] 4.载体的构建

[0114] (1)重组载体pSET152‑scutP1的构建

[0115] 以pSET152‑ermE*质粒(NTCC典型培养物保藏中心的pSET152质粒为带有启动子ermE*的pSET152‑ermE*质粒)为模板，设计引物pET152ProLineFw(5’‑catatgttggggatcctctagaggatccg‑3’)和pET152ProLineRv(5’‑agtcgacctgcagcccaagc‑
3’)，通过PCR扩增得到不含启动子ermE*的pSET152质粒骨架。

[0116] 以链霉菌SCUT‑1基因组DNA为模板，设计引物scutP1‑Fw(5’‑gcttgggctgcaggtcgactCGGCCCCTGAGCACGAA‑3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)和scutP1‑Rv(5’‑tagaggatccccaacatatgGACGGTCCTTCCGGG‑3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)，通过PCR扩增得到启动子scutP1片段。

[0117] 将pSET152质粒骨架和启动子scutP1片段纯化回收后于50℃反应30min进行无缝克隆连接，所使用的连接试剂为TSINGKE TSV‑S1 TreliefSoSoo Cloning Kit(购自北京擎科生物科技有限公司)，连接反应体系如表1所示：

[0118] 表1.连接反应体系

[0119]

[0120] 将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，在含有安普霉素(Apramycin)的LB培养基平板(含有安普霉素的LB培养基平板由以下组分组成：胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g、安普霉素50mg、琼脂粉20g和蒸馏水1L)上挑取单菌落，提取质粒并进行测序验证，获得重组载体pSET152‑scutP1。

[0121] (2)重组载体pSET152‑scutP1‑sep39和pSET152‑scutP1‑sep40的构建

[0122] 使用NdeI限制性核酸内切酶处理pSET152‑scutP1质粒并纯化回收，获得pSET152‑scutP1线性化载体。

[0123] 以链霉菌SCUT‑1基因组为模板，设计引物sep39‑Fw(5’‑cggaaggaccgtccaATGAAGCGTTTCCGGATCG‑3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)和sep39‑Rv(5’‑ctagaggatccccaacatatgTCAGAGGCCGGACTTGAACA‑3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)，通过PCR扩增并纯化回收得到sep39片段。

[0124] 以链霉菌SCUT‑1基因组为模板，设计引物sep40‑Fw(5’‑ccggaaggaccgtccaATGGCAGTGATGCGTCA‑3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)和sep40‑Rv(5’‑gccgcggatcctctagaTCAGGGGACGAGCCTGA‑3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)，通过PCR扩增并纯化回收得到sep40片段。

[0125] 将pSET152‑scutP1线性化载体分别与sep39片段和sep40片段进行无缝克隆连接，所使用的连接试剂为TSINGKE TSV‑S1 TreliefSoSoo Cloning Kit(购自北京擎科生物科技有限公司)，连接反应体系如表2所示：

[0126] 表2.连接反应体系

[0127]

[0128] 将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，在含有安普霉素(Apramycin)的LB培养基平板(含有安普霉素的LB培养基平板由以下组分组成：胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g、安普霉素50mg、琼脂粉20g和蒸馏水1L)上挑取单菌落，提取质粒并进行测序验证，获得重组载体pSET152‑scutP1‑sep39和pSET152‑scutP1‑sep40。

[0129] (3)重组载体pSET152‑scutP1‑sep39‑scutP1‑sep40的构建

[0130] 使用NdeI限制性核酸内切酶处理pSET152‑scutP1‑sep39质粒并纯化回收，获得pSET152‑scutP1‑sep39线性化载体。

[0131] 以pSET152‑scutP1‑sep40质粒为模板，设计引物scutP1‑sep40‑Fw(5’‑gtccggcctctgacaCGGCCCCTGAGCACGAA‑3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)和scutP1‑sep40‑Rv(5’‑ctagaggatccccaacaTCAGGGGACGAGCCTGAGCAGC‑3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)，通过PCR扩增并纯化回收后得到scutP1‑sep40片段。将pSET152‑scutP1‑sep39线性化载体和scutP1‑sep40片段进行无缝克隆连接，所使用的连接试剂为TSINGKE TSV‑S1 TreliefSoSoo Cloning Kit(购自北京擎科生物科技有限公司)，连接反应体系如表3所示：

[0132] 表3.连接反应体系

[0133]

[0134] 将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，在含有安普霉素(Apramycin)的LB培养基平板(含有安普霉素的LB培养基平板由以下组分组成：胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g、安普霉素50mg、琼脂粉20g和蒸馏水1L)上挑取单菌落，提取质粒并进行测序验证，获得重组载体pSET152‑scutP1‑sep39‑scutP1‑sep40，载体图谱如图1所示。

[0135] 5.链霉菌重组菌的构建

[0136] 将步骤4(3)所得重组载体pSET152‑scutP1‑sep39‑scutP1‑sep40通过电转化进入大肠杆菌ET12567/pUZ8002宿主中，获得大肠杆菌转化菌株ET/pSET152‑scutP1‑sep39‑scutP1‑sep40。将上述大肠杆菌接种至含有安普霉素(Apramycin)、氯霉素(Chloramphenicol)和卡那霉素(Kanamycin)的LB培养基(所述含有安普霉素、氯霉素和卡那霉素的LB培养基由以下组分组成：胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g、安普霉素
50mg、氯霉素25mg、卡那霉素50mg和蒸馏水1L)中，于37℃，220rpm条件下震荡培养16h。取
4mL培养后得到的ET/pSET152‑scutP1‑sep39‑scutP1‑sep40菌液，于6000×g条件下离心
2min，去除上清。用2mL新鲜的LB培养基重悬菌体，于6000×g条件下离心2min，去除上清，以去除培养物中的抗生素。

[0137] 取100μL于4℃保存的步骤3制得的链霉菌SCUT‑1的孢子保藏液，于50℃中孵育10min后，与收集的大肠杆菌ET/pSET152‑scutP1‑sep39‑scutP1‑sep40菌体混合均匀后，涂布于固体MS培养基平板(所述的固体MS培养基由以下组分组成：甘露醇20g、黄豆粉20g、氯化镁0.9521g、琼脂粉20g和蒸馏水1L)，并在30℃条件下倒置培养16h。

[0138] 取出培养后的MS培养基平板。另取1mL含有安普霉素和萘啶酮酸的水溶液(所述含有安普霉素和萘啶酮酸的水溶液由以下组分组成：安普霉素1mg、萘啶酮酸0.5mg和蒸馏水1mL)均匀覆盖在MS培养基平板上。平板充分晾干后置于37℃条件下培养3～5天。待MS培养基平板上长出明显单菌落后，用接种针挑取单菌落至含有安普霉素和萘啶酮酸的种子液培养基中(所述含有安普霉素和萘啶酮酸的种子培养基由以下组分组成:胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g、安普霉素50mg、萘啶酮酸25mg和蒸馏水1L)，于37℃，220rpm条件下震荡培养48h，取1mL培养得到的菌液，使用土壤基因组DNA快速抽提试剂盒(购自生工生物工程股份有限公司)提取基因组DNA，提取步骤按该试剂盒说明书的标准程序进行实验操作。
使用通用引物M13‑47(5’‑CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC‑3’)和M13‑48(5’‑
AGCGGATAACAATTTCACACAGGA‑3’)，以所提取的基因组DNA为模板进行PCR验证，得到链霉菌重组菌，命名为SCUT‑Osep39‑Osep40。SCUT‑Osep39‑Osep40为大肠杆菌转化菌株ET/pSET152‑scutP1‑sep39‑scutP1‑sep40与链霉菌SCUT‑1接合所得。

[0139] 对比例1

[0140] 步骤1、2和3和实施例1相同。

[0141] 4.载体的构建

[0142] (1)重组载体pSET152‑ermE*‑sep39和pSET152‑ermE*‑sep40的构建

[0143] 使用NdeI限制性核酸内切酶处理pSET152‑ermE*质粒(NTCC典型培养物保藏中心)并纯化回收，获得pSET152‑ermE*线性化载体。

[0144] 以链霉菌SCUT‑1基因组DNA为模板，设计引物sep39‑E‑Fw(5’‑caaaggaggcggacatATGAAGCGTTTCCGGATCG‑3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)和sep39‑E‑Rv(5’‑ctagaggatccccaacaTCAGAGGCCGGACTTGAAC‑3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)，通过PCR扩增并纯化回收得到sep39‑E片段。

[0145] 以链霉菌SCUT‑1基因组DNA为模板，设计引物sep40‑E‑Fw(5’‑caaaggaggcggacaATGGCAGTGATGCGTCAC‑3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)和sep40‑E‑Rv(5’‑ctagaggatccccaacaTCAGGGGACGAGCCTGAGCAGC‑3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)，通过PCR扩增并纯化回收得到sep40‑E片段。

[0146] 将pSET152‑ermE*线性化载体分别与sep39‑E片段和sep40‑E片段进行无缝克隆连接，所使用的连接试剂为TSINGKE TSV‑S1 TreliefSoSoo Cloning Kit(购自北京擎科生物科技有限公司)，连接反应体系如表4所示：

[0147] 表4.连接反应体系

[0148]

[0149] 将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，在含有安普霉素(Apramycin)的LB培养基平板(含有安普霉素的LB培养基平板由以下组分组成：胰蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母提取物5g，安普霉素50mg，琼脂粉20g，蒸馏水1L)上挑取单菌落，提取质粒并进行测序验证，获得重组载体pSET152‑ermE*‑sep39和pSET152‑ermE*‑sep40。

[0150] (2)重组载体pSET152‑ermE*‑sep39‑ermE*‑sep40的构建

[0151] 以pSET152‑ermE*‑sep39为模板，设计引物SETsep39LineFw(5’‑tgttggggatcctctaga‑3’)和SETsep39LineRv(5’‑tcagaggccggacttgaac‑3’)，通过PCR扩增并纯化回收，获得pSET152‑ermE*‑sep39线性化载体。

[0152] 以pSET152‑ermE*‑sep40质粒为模板，设计引物ermE*‑sep40‑Fw(5’‑tcaagtccggcctctgaCTAGTATGCATGCGAGTGTCCG‑3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)和ermE*‑sep40‑Rv(5’‑ctagaggatccccaacaaTCAGGGGACGAGCCTGAGCAGC‑3’)(下划线部分表示无缝克隆连接所需的同源片段)，通过PCR扩增并纯化回收后得到ermE*‑sep40片段。将pSET152‑ermE*‑sep39线性化载体和ermE*‑sep40片段进行无缝克隆连接，所使用的连接试剂为TSINGKE TSV‑S1 TreliefSoSoo Cloning Kit(购自北京擎科生物科技有限公司)，连接反应体系如表5所示：

[0153] 表5.连接反应体系

[0154]

[0155]

[0156] 将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，在含有安普霉素(Apramycin)的LB培养基平板上挑取单菌落，提取质粒并进行测序验证，获得重组载体pSET152‑ermE*‑sep39‑ermE*‑sep40，载体图谱如图2所示。

[0157] 5.链霉菌重组菌的构建

[0158] 将步骤4(2)所得的重组载体pSET152‑ermE*‑sep39‑ermE*‑sep40通过电转化进入大肠杆菌ET12567/pUZ8002宿主中，获得大肠杆菌转化菌株ET/pSET152‑ermE*‑sep39‑ermE*‑sep40。将上述大肠杆菌接种至含有安普霉素(Apramycin)、氯霉素(Chloramphenicol)和卡那霉素(Kanamycin)的LB培养基(所述含有安普霉素、氯霉素和卡那霉素的LB培养基由以下组分组成：胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g、安普霉素
50mg、氯霉素25mg、卡那霉素50mg和蒸馏水1L)中，于37℃，220rpm条件下震荡培养16h。取
4mL培养后得到的ET/pSET152‑ermE*‑sep39‑ermE*‑sep40菌液，于6000×g条件下离心
2min，去除上清。用2mL新鲜的LB培养基重悬菌体，于6000×g条件下离心2min，去除上清，以去除培养物中的抗生素。

[0159] 取100μL于4℃保存的步骤3制得的链霉菌SCUT‑1的孢子保藏液，于50℃中孵育10min后，与收集的大肠杆菌ET/pSET152‑ermE*‑sep39‑ermE*‑sep40菌体混合均匀后，涂布于固体MS培养基平板(所述的固体MS培养基由以下组分组成：甘露醇20g、黄豆粉20g、氯化镁0.9521g、琼脂粉20g和蒸馏水1L)，并在30℃条件下倒置培养16h。

[0160] 取出培养后的MS培养基平板。另取1mL含有安普霉素和萘啶酮酸的水溶液(所述含有安普霉素和萘啶酮酸的水溶液由以下组分组成：安普霉素1mg、萘啶酮酸0.5mg和蒸馏水1mL)均匀覆盖在MS培养基平板上。平板充分晾干后置于37℃条件下培养3～5天。待MS培养基平板上长出明显单菌落后，用接种针挑取单菌落至含有安普霉素和萘啶酮酸的种子液培养基中(所述含有安普霉素和萘啶酮酸的种子培养基由以下组分组成:胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g、安普霉素50mg、萘啶酮酸25mg和蒸馏水1L)，于37℃，220rpm条件下震荡培养48h，取1mL培养得到的菌液，使用土壤基因组DNA快速抽提试剂盒(购自生工生物工程股份有限公司)提取基因组DNA，提取步骤按该试剂盒说明书的标准程序进行实验操作。
使用通用引物M13‑47(5’‑CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC‑3’)和M13‑48(5’‑
AGCGGATAACAATTTCACACAGGA‑3’)，以所提取的基因组DNA为模板进行PCR验证，得到链霉菌重组菌，分别命名为SCUT‑Esep39‑Esep40。SCUT‑Esep39‑Esep40为大肠杆菌转化菌株ET/pSET152‑ermE*‑sep39‑ermE*‑sep40与链霉菌SCUT‑1接合所得。

[0161] 实施例2

[0162] 链霉菌重组菌SCUT‑Osep39‑Osep40和SCUT‑Esep39‑Esep40固态发酵降解羽毛的能力评估

[0163] (1)将出发菌株链霉菌SCUT‑1、实施例1中所得的重组菌SCUT‑Osep39‑Osep40、对比例1中所得的重组菌SCUT‑Esep39‑Esep40分别接种于种子液培养基(所述种子培养基由以下组分组成:胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g和蒸馏水1L)，于37℃，220rpm条件下震荡培养24h，得到链霉菌SCUT‑1种子液、重组菌SCUT‑Osep39‑Osep40种子液、重组菌SCUT‑Esep39‑Esep40种子液。

[0164] (2)将链霉菌SCUT‑1种子液、重组菌SCUT‑Osep39‑Osep40种子液、重组菌SCUT‑Esep39‑Esep40种子液分别按羽毛质量的10％(10g)的接种量接种至发酵培养基中(所述发酵培养基由以下组分组成：干羽毛100g和蒸馏水150mL)，混合均匀后于40℃条件下静置培养60h。将培养物于12000×g，4℃条件下离心20min，收集上清发酵液进行氨基酸、可溶性多肽含量测定和蛋白酶酶活测定。

[0165] (3)氨基酸含量的测定，具体步骤如下：

[0166] 取200μL上清发酵液于离心管中，加入50μL的A液，再加入50μL的B液，混匀后于90℃条件下反应30min。反应结束后用25℃水浴锅冷却，再加入950μL的蒸馏水，混匀后静置5min。随后取200μL，用96孔酶标板，在酶标仪570nm波长处测定吸光值。将所测得OD570代入标准曲线，计算得到氨基酸的含量。标准曲线是将异亮氨酸粉末溶解于蒸馏水中，配制成0、
25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350μg/mL的标准溶液，采用与待测样品相同的测定方法进行构建。

[0167] A液的制备步骤如下：称取0.0907g三水合磷酸二氢钾和4.5364g十二水合磷酸氢二钠并添加至200mL容量瓶，加入蒸馏水定容至200mL。

[0168] B液的制备步骤如下：称1g取茚三酮于盛有70mL热水的烧杯中使其溶解，加入80mg氯化亚锡，过滤，取滤液至100mL容量瓶并加入蒸馏水定容至100mL。

[0169] (4)可溶性多肽含量的测定，具体步骤如下：

[0170] 使用TaKaRa BCAProtein Assay Kit(购自宝日医生物技术有限公司)试剂盒进行测定，测定步骤按该试剂盒说明书的标准程序进行实验操作。

[0171] (5)蛋白酶活性的测定，具体步骤如下：

[0172] 取100μL上清发酵液于离心管中作为实验组，取100μL上清发酵液于另一离心管中并加入200μL的C液混匀作为对照组。向两根离心管中加入100μL的1％的角蛋白溶液，混匀后于50℃条件下反应20min。通过向实验组离心管中加入200μL的C液终止其反应，得到实验组反应液和对照组反应液。将离心管于14000×g条件下离心5min，取100μL反应液上清于另一干净离心管中，再加入500μL的D液和100μL的福林酚试剂(购自北京索莱宝科技有限公司)，混匀后于40℃条件下反应20min。随后取200μL，用96孔酶标板，在酶标仪660nm波长处测定吸光值。将所测得OD660代入标准曲线，计算得到酪氨酸的含量。标准曲线是将酪氨酸粉末溶解于蒸馏水中，配制成0、20、40、60、80、100μg/mL的标准溶液，采用与待测样品相同的测定方法进行构建。以单位时间内、单位体积发酵液水解角蛋白所能释放的酪氨酸含量计算得到蛋白酶酶活。

[0173] C液的制备步骤如下：称取65.3548g三氯乙酸并添加至1L容量瓶，加入蒸馏水定容至1L。

[0174] D液的制备步骤如下：称取42.396g碳酸钠并添加至1L容量瓶，加入蒸馏水定容至1L。

[0175] 出发菌株SCUT‑1、重组菌SCUT‑Esep39‑Esep40、重组菌SCUT‑Osep39‑Osep40固态发酵羽毛的氨基酸回收量如图3所示，多肽回收量如图4所示。测定结果表明，出发菌株SCUT‑1的氨基酸回收量为0.07g/g，可溶性多肽回收量为0.16g/g，氨基酸和可溶性多肽总回收量为0.23g/g；重组菌SCUT‑Esep39‑Esep40的氨基酸回收量为0.10g/g，可溶性多肽回收量为0.23g/g，氨基酸和可溶性多肽总回收量为0.33g/g，总回收量是出发菌株SCUT‑1的1.43倍；重组菌SCUT‑Osep39‑Osep40的氨基酸回收量为0.14g/g，可溶性多肽回收量为
0.41g/g，氨基酸和可溶性多肽总回收量为0.55g/g，总回收量是出发菌株SCUT‑1的2.39倍，是重组菌SCUT‑Esep39‑Esep40的1.67倍。

[0176] 出发菌株SCUT‑1、重组菌SCUT‑Esep39‑Esep40、重组菌SCUT‑Osep39‑Osep40固态发酵羽毛的蛋白酶活性如图5所示。测定结果表明，重组菌SCUT‑Esep39‑Esep40的蛋白酶活性是出发菌株SCUT‑1的1.72倍；重组菌SCUT‑Osep39‑Osep40的蛋白酶活性是出发菌株SCUT‑1的3.61倍，是重组菌SCUT‑Esep39‑Esep40的2.10倍。

[0177] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。