一种具有降脂活性的小肽、制备方法及其应用

摘要

本发明提供一种具有降脂活性的小肽、制备方法及其应用，属于生物技术领域。该具有降脂活性的小肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供所述小肽的制备方法，包括如下步骤：（1）将泥鳅蛋白采用蛋白酶酶解，得到酶解产物；（2）取所述酶解产物采用超滤膜分离，取分子量小于3 kDa的组分；（3）将所述分子量小于3 kDa的组分经葡聚糖凝胶Sephadex G‑15过滤分离，得到所述小肽。本发明小肽，来源于泥鳅蛋(56)对比文件Lijun You 等.Changes in theantioxidant activity of loach (Misgurnusanguillicaudatus) protein hydrolysatesduring a simulated gastrointestinaldigestion《.Food Chemistry》.2010,第120卷(第3期),第810-816页.翁泽斌等.酶法制备大豆蛋白成骨活性肽.《中国农业科学》.2021,第54卷(第13期),第2885-2894页.

权利要求

1.一种具有降脂活性的小肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述小肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）将泥鳅蛋白采用蛋白酶酶解，得到酶解产物；（2）取所述酶解产物采用超滤膜分离，取分子量小于3 kDa的组分；（3）将所述分子量小于3 kDa的组分经葡聚糖凝胶Sephadex G‑15过滤分离，得到所述小肽；步骤（1）中将泥鳅蛋白依次采用菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶酶解；步骤（1）所述菠萝蛋白酶酶解时间为4‑6 h，碱性蛋白酶酶解时间为0.5‑1.5 h。

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于步骤（2）中所述超滤膜的截留分子量为3 kDa。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于步骤（3）采用葡聚糖凝胶Sephadex G‑15过滤分离中，采用去离子水进行洗脱，洗脱流速为0.8 ml/min，取保留时间为125‑155 min的洗脱液，得到所述小肽。

5.权利要求1所述小肽在制备具有降脂活性的药物、化妆品中的应用。

6.含有权利要求1所述小肽的药物、化妆品。

说明书

一种具有降脂活性的小肽、制备方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有降脂活性的小肽、制备方法及其应用。

背景技术

[0002] 肥胖是一种代谢性疾病，它是由于摄入过多的能量或者身体的新陈代谢发生了变化，导致身体的脂肪特别是甘油三酯的积累，同时伴随着II型糖尿病、非酒精性脂肪肝和心血管病等疾病的发生，危害超过全球1/3的人口。长期以来，人们热衷于寻找治疗或预防肥胖的药物，如奥利司他、西布曲明、二甲双胍及他汀类药物等，但临床使用仍伴随多种副反应发生。随着医学和生物技术的发展，多肽和蛋白类药物开始不断涌现，它具有高药效、易代谢、不易蓄积、毒性低、副作用小等诸多优势，因此开发多肽和蛋白类药物成为研究的热点。

[0003] 现有技术中，缺乏天然来源、高效、安全的、具有降脂活性的小肽。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种具有降脂活性的小肽，来源于泥鳅蛋白，具有安全性高、高效、来源广泛的特点。

[0005] 本发明的另一目的是提供上述小肽的制备方法，该方法简单，安全，高效，重复性好。

[0006] 本发明的又一目的是提供该小肽在制备具有降脂活性的药物、化妆品或功能性食品中的应用。

[0007] 本发明的目的采用如下技术方案实现：

[0008] 一种具有降脂活性的小肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

[0009] 本发明还提供所述小肽的制备方法，包括如下步骤：(1)将泥鳅蛋白采用蛋白酶酶解，得到酶解产物；(2)取所述酶解产物采用超滤膜分离，取分子量小于3kDa的组分；(3)将所述分子量小于3kDa的组分经葡聚糖凝胶Sephadex G‑15过滤分离，得到所述小肽。

[0010] 在本发明中，步骤(1)中所述蛋白酶为菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶。

[0011] 在本发明中，步骤(1)中将泥鳅蛋白依次采用菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶酶解。

[0012] 在本发明中，步骤(1)所述菠萝蛋白酶酶解时间为4‑6h，碱性蛋白酶酶解时间为0.5‑1.5h。

[0013] 在本发明中，步骤(2)中所述超滤膜的截留分子量为3kDa。

[0014] 在本发明中，步骤(3)采用葡聚糖凝胶Sephadex G‑15过滤分离中，采用去离子水进行洗脱，洗脱流速为0.8ml/min，取保留时间为125‑155min的洗脱液，得到所述小肽。

[0015] 本发明还提供所述小肽在制备具有降脂活性的药物、化妆品或功能性食品中的应用。

[0016] 本发明还提供含有所述小肽的药物、化妆品或功能性食品。

[0017] 本发明小肽从泥鳅蛋白中分离，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，通过体外PA诱导的Hep G2细胞脂滴分泌量以及胞内甘油三酯含量测定，发现具较强降脂活性，可以应用于制备具有降脂活性的药物、化妆品或功能性产品中，在食品、医药及化妆品领域具有广阔的前景。本发明小肽，来源于泥鳅蛋白，因此安全性较高，其制备方法简单，容易操作，来源广泛。

附图说明

[0018] 图1超滤组分对PA诱导的Hep G2细胞脂质累积的影响。其中(A)为各组分对Hep G2细胞增殖活力的影响，对照组是指对照孔，LPH‑Ⅰ、LPH‑Ⅱ、LPH‑Ⅲ分别指加入LPH‑Ⅰ、LPH‑Ⅱ或LPH‑Ⅲ(150μg/ml)的样品孔；(B)显示了各组分对PA诱导的Hep G2细胞脂滴分泌的影响，其中Control为空白对照，PA是采用基础培养液干预的孔，PA/LPH‑Ⅰ表示采用采用添加了150μg/ml LPH‑Ⅰ的基础培养液干预的孔，PA/LPH‑Ⅱ和PA/LPH‑Ⅲ按照相同方法类推；(C)为各组分对PA诱导的Hep G2细胞脂质含量的影响，其中下方PA、样品表示干预过程中添加的该物质，+表示添加有对应物质，‑表示未添加对应物质。(D)为各组分对PA诱导的Hep G2细胞内甘油三酯(TG)含量的影响，其中下方PA、样品表示干预过程中添加的物质，+表示添加有对应物质，‑表示未添加对应物质，纵坐标为甘油三酯含量，单位为微摩尔每克蛋白(μmol/gprot)。##表示与空白孔相比有极显著差异(p<0.01)，**表示与模型孔相比具有极显著差异(p<0.01)下同。

[0019] 图2显示LPH‑Ⅲ经Sephadex G‑15凝胶过滤分离色谱图。其中横坐标为保留时间(min)，纵坐标是220nm处的信号响应值(mV)。

[0020] 图3凝胶过滤分离组分对PA诱导的Hep G2细胞脂质累积的影响。(A)为G1、G2、G3、G4、G5、G6和G7(100μg/ml)对Hep G2细胞增殖活力的影响。其中对照组是指对照孔，G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7分别指加入G1、G2、G3、G4、G5、G6或G7的样品孔；(B)为G1‑G7(100μg/ml)对PA诱导的Hep G2细胞脂滴分泌影响，其中Control为空白对照，PA是采用基础培养液干预的孔，PA/G1表示采用添加了G1的基础培养液干预的孔；PA/G2、PA/G3、PA/G4、PA/G5、PA/G6、PA/G7按照上述方法类推。(C)为100μg/ml的G1‑G7对PA诱导的Hep G2细胞脂滴分泌的影响，下方PA、样品表示干预过程中添加的该物质，+表示添加有对应物质，‑表示未添加对应物质。(D)为G1‑G7(100μg/ml)对PA诱导的Hep G2细胞内甘油三酯(TG)含量的影响，下方PA、样品表示干预过程中添加的物质，+表示添加有对应物质，‑表示未添加对应物质，纵坐标为甘油三酯含量，单位为微摩尔每克蛋白(μmol/gprot)。

[0021] 图4AYPF的二级质谱图。横坐标表示离子的质荷比(m/z)值，纵坐标表示离子流的强度。

[0022] 图5小肽AYPF对PA诱导的Hep G2细胞脂质累积的影响。其中(A)为不同浓度小肽AYPF对Hep G2细胞增殖活力的影响，对照组是指对照孔，16、32、64、128、256和512分别指加入16、32、64、128、256、512μM小肽AYPF的样品孔；(B)为小肽AYPF对PA诱导的Hep G2细胞脂滴分泌的影响，其中Control为空白对照，PA是采用基础培养液干预的孔，PA/64μMAYPF表示采用添加了64μMAYPF的基础培养液干预的孔；PA/128μMAYPF表示采用添加了128μMAYPF的基础培养液干预的孔。(C)为不同浓度小肽AYPF对PA诱导的Hep G2细胞脂滴分泌的影响，下方PA、AYPF表示干预过程中添加的物质，+表示添加有对应物质，‑表示未添加对应物质。(D)为不同浓度小肽AYPF对PA诱导的Hep G2细胞内甘油三酯(TG)含量的影响，下方PA、AYPF表示干预过程中添加的物质，+表示添加有对应物质，‑表示未添加对应物质，纵坐标为甘油三酯含量，单位为微摩尔每克蛋白(μmol/gprot)。

具体实施方式

[0023] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0024] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0025] 1.材料：菠萝蛋白酶(300U/mg)，源叶生物科技有限公司；碱性蛋白酶(200U/mg)，源叶生物科技有限公司；超滤膜(10kDa、3kDa)，美国millipore公司；Sephadex G‑15，(中国)医疗集团；Hep G2细胞株，上海中科院细胞库；胎牛血清(FBS)、High Glucose DMEM培养液、Penicillin‑Streptomycin(100×)、Trypsin EDTA(0.05％)、PBS磷酸盐缓冲液(1×，pH 7.2)，美国Gibco公司；二甲基亚砜(DMSO)，美国Sigma公司；油红O染料，源叶生物科技有限公司；钠棕榈酸酯(PA，规格：99％)，上海麦克林生化科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA)，美国Sigma公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，碧云天生物技术有限公司；组织细胞甘油三酯酶法测定试剂盒E1013，北京普利莱基因技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

[0026] 2.主要仪器与设备：生物安全柜，Thermo Fisher(中国)公司；MZE多功能酶标仪，Molecular Devices(美国)公司；SL16R台式离心机，Thermo Fisher(中国)公司；二氧化碳培养箱，Thermo Fisher(中国)公司；倒置荧光显微镜，德国卡尔蔡司有限公司。

[0027] 实施例1制备具有降脂活性的小肽

[0028] (1)泥鳅前处理：试验前，泥鳅置于干净的水中喂养一星期，吐脏。宰杀，去除头、尾、内脏及血，收集肉置于绞肉机中搅打两次，得到的肉糜置于聚乙烯袋中，‑20℃冻藏，备用。

[0029] (2)泥鳅蛋白的酶解：称取100g泥鳅肉糜并加入200ml去离子水，搅拌均匀，可得pH值为6.5的浊液。无需调节pH，接着加入含有300mg菠萝蛋白酶(300U/mg，源叶生物科技有限公司，CAS号：37189‑34‑7)的水溶液1ml，55℃条件下酶解5h，沸水浴条件下灭酶10min。然后，用0.1M的氢氧化钠水溶液将pH值调为8.0，加入含有450mg碱性蛋白酶(200U/mg，源叶生物科技有限公司，CAS号：9014‑01‑1)的水溶液1ml，50℃条件下酶解1h，沸水浴条件下灭酶10min。将酶解后的溶液冷却至室温，以5000r/min离心20min，收集上清液，透析脱盐，真空冷冻干燥后，得到泥鳅蛋白酶解产物(Loach Protein Hydrolysate，记为LPH)。

[0030] (3)泥鳅蛋白酶解产物的超滤分离：选用截流分子量为10kDa和3kDa的超滤膜。用去离子水将泥鳅蛋白酶解产物配成质量百分浓度为1％的溶液，用0.45μm的纤维素膜过滤除去不溶物，然后采用Labscale小型切向流超滤系统进行分离，首先选用截流分子量为10kDa的超滤膜进行分离，得到分子量大于10kDa的组分(记为组分LPH‑Ⅰ)和分子量小于等于10kDa的组分；然后将分子量小于等于10kDa的组分继续用截流分子量为3kDa的超滤膜进行分离，得到分子量大于等于3kDa小于等于10kDa的组分(记为组分LPH‑II)和分子量小于
3kDa的组分(记为组分LPH‑III)。超滤时，调节泵的压力为0.2MPa，超滤温度为4℃。

[0031] 将超滤后获得的不同分子量的组分LPH‑Ⅰ(>10kDa)、LPH‑II(3～10kDa)和LPH‑III(<3kDa)分别脱盐、冷冻干燥，采用MTT法检测各组分对正常Hep G2细胞增殖活力的影响；另外，通过检测各组分LPH‑Ⅰ(>10kDa)、LPH‑II(3～10kDa)和LPH‑III(<3kDa)对钠棕榈酸酯(PA)诱导的Hep G2细胞脂质累积(脂滴分泌、胞内甘油三酯(TG)含量)产生的影响，来评价小肽的降脂活性。

[0032] ①MTT(噻唑蓝)法检测各组分(LPH‑Ⅰ、LPH‑II和LPH‑III)对正常Hep G2细胞增殖活力的影响：取对数生长期的Hep G2细胞，用含10％FBS的High Glucose DMEM培养液配置5
成4×10个/mL的细胞悬浮液。在96孔板中设置样品孔，每个样品孔中加入100μl细胞悬浮液，在细胞培养箱中培养24h使细胞贴壁。除去样品孔中的培养液后，将组分LPH‑Ⅰ(>
10kDa)、LPH‑II(3～10kDa)和LPH‑III(<3kDa)分别溶解于含10％FBS的High Glucose DMEM培养液中，制成浓度为150μg/ml的小肽培养液，再加入各样品孔中，每孔100μl体积；设空白孔，与样品孔相比，无细胞，以100μl的PBS磷酸盐缓冲液(1×，pH 7.2)替代小肽培养液；设置对照孔，与样品孔相比，有细胞，但是以100μl的PBS磷酸盐缓冲液(1×，pH 7.2)替代小肽培养液。将96孔板在37℃培养箱中培养24h后，每孔加入10μl的MTT溶液(5mg/mL)，培养4h后，除去96孔板中的溶液，每孔加入150μl的DMSO，37℃恒温振荡箱中振荡20min，在酶标仪中570nm波长下测吸光度。

[0033] 细胞增殖活力＝(OD样品孔‑OD空白孔)/(OD对照孔‑OD空白孔)×100％。

[0034] 结果如图1(A)所示，在各组分处理24h后，吸光度没有显著性差异，表明不同组分LPH‑Ⅰ(>10kDa)、LPH‑II(3～10kDa)和LPH‑III(<3kDa)对Hep G2细胞的活性并无影响，说明组分LPH‑Ⅰ(>10kDa)、LPH‑II(3～10kDa)和LPH‑III(<3kDa)安全性较好。

[0035] ②油红O染色：取对数生长期Hep G2细胞，以5×104个/孔接种于24孔板，每孔加入500μl含有10％FBS的High Glucose DMEM培养液进行培养，待细胞生长至90％融合度后，去除培养液，每孔加入500μl无FBS的High Glucose DMEM培养液饥饿处理16h，之后每孔分别加入500μl含150uM PA和1％BSA的High Glucose DMEM新鲜培养液(记为基础培养液)、含有
150μg/ml的LPH‑Ⅰ的基础培养液、含有150μg/ml的LPH‑II的基础培养液、含有150μg/ml的LPH‑III的基础培养液，每组设4个平行/孔，诱导24h，以含1％BSA的High Glucose DMEM培养液培育的细胞为空白对照。诱导结束后，吸弃上清，以PBS磷酸盐缓冲液小心润洗3次，加入10％中性福尔马林溶液固定30min，PBS磷酸盐缓冲液润洗3次，每次3min，稍晾干，以60％异丙醇水溶液分化后，加入含油红O染料的染色液(0.3g油红O染料加入到100ml的60％异丙醇水溶液所得)，37℃摇床上避光染色20min。弃去染色液，以60％异丙醇水溶液分化至背景清晰，再以PBS磷酸盐缓冲液洗涤3次，即可置于莱卡倒置显微镜下(200×)进行拍照分析。

[0036] 拍照结束后，每孔加入200ul异丙醇，置于37℃摇床上复溶油红O染料，测定其在510nm处吸光度值，以空白对照的脂质含量为百分百，计算各组分小肽处理后脂质含量相对于空白对照的百分比，可测得泥鳅多肽的体外降脂效果。

[0037] 结果如图1(B)和(C)所示，通过油红O染色观察到，空白对照组的细胞形态清楚，红色的微滴数目很少，而PA刺激后细胞的脂滴数目和体积都有显著的提高。而加入了LPH‑Ⅰ、LPH‑II和LPH‑III组分的组别与模型(PA)组相比红色液滴数目明显降低；且复溶油红O染料后，测定其在510nm处吸光度值，发现加入LPH‑Ⅰ、LPH‑II和LPH‑III组分后可以明显降低细胞的脂滴分泌量。

[0038] ③细胞甘油三酯(TG)含量的测定：取对数生长期Hep G2细胞，以5×104个/孔接种于24孔板，每孔加入500μl含有10％FBS的High Glucose DMEM培养液进行培养，待细胞生长至90％融合度后，去除培养液，以每孔500μl无FBS的High Glucose DMEM培养液饥饿处理16h，之后每孔分别加入500μl含150μM PA和1％BSA的High Glucose DMEM新鲜培养液(记为基础培养液)、含有150μg/ml的LPH‑Ⅰ的基础培养液、含有150μg/ml的LPH‑II的基础培养液、含有150μg/ml的LPH‑III的基础培养液，每组设4个平行孔，诱导24h，以含1％BSA的High Glucose DMEM培养液培育的细胞为空白对照。诱导结束后，将细胞以预冷的PBS缓冲液润洗
3次后，加入裂解液置于冰上裂解15min，结合细胞刮棒将其收集至EP管中后，4℃条件下
12000rpm/min离心15min，取上清采用组织细胞甘油三酯酶法测定试剂盒E1013测定细胞甘油三酯(TG)含量。

[0039] 结果如图1(D)所示，经PA刺激后细胞内甘油三脂含量较对照组相比明显升高，而在加入了LPH‑Ⅰ、LPH‑II和LPH‑III组分后这种情况得到了缓解，其中LPH‑III组分具最佳缓解效果。

[0040] 上述实验结果表明，泥鳅蛋白酶解液经超滤分离后，LPH‑Ⅰ、LPH‑II和LPH‑III组分均具备一定体外降脂效果，其中LPH‑III组分具有最佳降脂效果。因此，对LPH‑III组分进行冻干，并进行凝胶过滤分离，以便得到更加确切的降脂成分。

[0041] (4)凝胶过滤分离：采用的葡聚糖凝胶填料型号为Sephadex G‑15。层析柱规格为：1.6×75cm。首先，根据层析柱体积及所需凝胶体积准备一定量凝胶填料，将干胶浸泡于洗脱液或去离子水中一段时间，之后可煮沸5‑10min使充分溶胀，将填料进行装柱，注意千万不要出现断层或大气泡，装填高度为65cm左右(可根据层析柱规格进行调整)。

[0042] 将凝胶柱、恒流泵、紫外检测系统与自动收集器按特定顺序进行连接。调整恒流泵至流速为0.8ml/min，以去离子水进行平衡洗脱(排除系统气泡以及冲压填料使之稳定)。将LPH‑III组分的冻干样品重新溶解于去离子水中，配制成浓度为30mg/ml的样品，采用0.45μm水系滤膜过滤以去除不溶性杂质，取过滤后的样品(LPH‑III组分浓度为30mg/ml)8ml上柱，以去离子水进行洗脱，洗脱速度为0.8ml/min。收集洗脱液，每管4ml，其中紫外检测波长为220nm。

[0043] 如图2所示，LPH‑III组分经Sephadex G‑15凝胶过滤分离后被分为7个峰组分，我们将这7个峰组分命名为G1、G2、G3、G4、G5、G6和G7。

[0044] 合并各峰组分液体悬蒸浓缩后冻干，采用本实施例标题①方法分别测定浓度为100μg/ml的G1‑G7对Hep G2细胞增殖活力的影响；采用本实施例标题②和③中方法测定100μg/ml的G1‑G7体外降脂效果，活性最高的组分用于肽序列分析。

[0045] 如图3所示，G1、G2、G3、G4、G5、G6和G7在浓度为100μg/ml时对Hep G2细胞的增殖活力没有影响(见图3(A))，且能够显著降低PA诱导所致的脂滴分泌增加(见图3(B)和(C))以及缓解胞内甘油三酯含量的升高(见图3(D))。其中，又以G4峰组分(对应的保留时间为125‑155min)具最佳体外降脂效果。因此，对G4峰组分的氨基酸序列进行分析。

[0046] (5)结构鉴定：采用LC‑MS/MS检测G4峰中的活性组分纯度及氨基酸序列。将G4峰组分冷冻干燥，得到G4峰组分的冻干粉。将G4峰组分的冻干粉溶于去离子水，配制成浓度为20μg/ml的蛋白溶液。流动相A是质量百分浓度为0.1％的甲酸水溶液，B是质量百分浓度为0.1％的甲酸的乙腈溶液，选用BEH C18色谱柱。洗脱程序为：0‑5min，流动相A 100～85％线性降低，流动相B 0～15％线性升高；5‑10min，流动相A 85～100％线性升高，流动相B15～
0％线性降低。洗脱程序中的百分数为体积百分浓度。样品经过液相色谱分离系统后，再由质谱系统将肽段打成不同分子量的碎片，并由质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器检测得到质谱图，如图4。分析质谱图，发现G4峰中的活性组分为氨基酸序列为AYPF的小肽，分子量为496.56Da，质量百分数大于等于98％。

[0047] 实施例2小肽AYPF的降脂活性

[0048] 由金斯瑞生物科技有限公司利用FlexPeptideTM多肽合成技术合成小肽AYPF(SEQ ID NO:1)。采用实施例1标题①方法测定小肽AYPF浓度在16、32、64、128、256、512μM时对Hep G2细胞增殖活力的影响。结果如图5(A)所示，在浓度为256μM时，小肽对细胞活力产生了一定影响，故而，实验采用64μM和128μM为研究浓度进行后续实验。

[0049] 采用实施例1中标题②和③中方法测定64μM和128μM小肽AYPF体外降脂效果。结果表明，小肽AYPF可以显著降低PA诱导所致的脂滴分泌增加(见图5(B)和(C))，采用PA诱导的Hep G2细胞中脂质含量达到了198.89±3.37％(以空白对照为100％计算)，采用64μM和128μM小肽AYPF干预的情况下，细胞中脂质含量仅为138.91±1.54％和117.84±1.60％。由图5(D)可见，正常Hep G2细胞中甘油三酯含量为38.04±3.18μmol/gprot，采用PA诱导的Hep G2细胞中甘油三酯含量为117.89±11.78μmol/gprot，采用64μM和128μM小肽AYPF干预的情况下，细胞中甘油三酯含量仅为73.25±7.12μmol/gprot和62.83±4.51μmol/gprot，说明了小肽AYPF可以显著缓解胞内甘油三酯含量的升高，且呈现剂量依赖，可以认为该小肽具备较好体外降脂效果。

[0050] 综上所述，本发明小肽AYPF具有良好的降脂活性，能够显著缓解由PA诱导的Hep G2细胞的脂质累积，降低细胞内甘油三酯(TG)含量，可以应用于制备具有降脂活性的药物、化妆品或功能性产品中。