一种稳定同位素标记嘧霉胺内标试剂的制备方法

摘要

本发明涉及一种食品安全检测用稳定同位素标记嘧霉胺内标试剂的制备方法，属于食品安全检测用标准物质研发领域。本发明的稳定同位素标记嘧霉胺内标试剂的制备方法，采用市售可得的中间体及稳定同位素标记卤代苯为原料，经一步Buchwald‑Hartwig交叉偶联反应直接得到稳定同位素标记嘧霉胺。本发明方法所使用的原料简单易得且价格低廉、避免使用有毒刺激性原料、合成步骤短、反应条件温和、反应收率高；最终产品副产物少、易于分离提纯、化学纯度高、同位素丰度不稀释。最终产物稳定同位素标记嘧霉胺化学纯度大于98％，同位素丰度大于98％。本制备方法制得的稳定同位素标记嘧霉胺内标试剂能满足食品安全检测用液相色谱串联质谱法所需稳定同位素标记内标试剂的技术要求。

权利要求

1.一种稳定同位素标记嘧霉胺内标试剂的制备方法，该稳定同位素标记嘧霉胺内标试剂的化学结构如式(稳定同位素标记嘧霉胺)所示：(稳定同位素标记嘧霉胺)

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其中*为 C或 C，X为H或D，其特征在于，其制备路线为：

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其中*为 C或 C，X为H或D，Y为Cl、Br或I，制备步骤如下：

在氮气保护、加入稳定同位素标记卤代苯(I)，然后加入2‑氨基‑4，6‑二甲基嘧啶、催化剂、配体、有机溶剂、碱存在条件下，在30℃～150℃条件下，反应6～48小时；TLC跟踪反应原料反应完全后，反应混合溶液用水淬灭，过滤，滤液用有机溶剂萃取，合并有机相，依次用水洗涤、饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入干燥剂干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记嘧霉胺。

2.根据权利要求1所述的一种稳定同位素标记嘧霉胺内标试剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，催化剂为三(二亚苄基丙酮)二钯、双二亚苄基丙酮钯、醋酸钯、氯化钯、四(三苯基膦)钯、双(二苯基膦二茂铁)二氯化钯、双(三环己基膦)二氯化钯、双(三苯基膦)二氯化钯中的任意一种或几种；配体为三(邻甲基苯基)磷、三(环己基)磷、三(2‑呋喃基)膦、三(异丙基)磷、三(叔丁基)磷、二叔丁基新戊基膦、2‑二环己基磷‑2’‑甲基联苯、2‑二环己基磷‑2’，6’‑二甲基联苯、2‑二环己基膦‑2’，4’，6’‑三异丙基联苯、2‑二环己基膦‑2’，

6’‑二甲氧基‑联苯、2‑二‑叔丁膦基‑2’，4’，6’‑三异丙基联苯、正丁基二(1‑金刚烷基)膦、

1，1’‑联萘‑2，2’‑双二苯膦、4，5‑双二苯基膦‑9，9‑二甲基氧杂蒽、双(2‑二苯基磷苯基)醚、

2‑二环己膦基‑2’‑(N，N‑二甲胺)‑联苯、1，2‑双(二苯基膦)乙烷、1，3‑双(二苯基膦)丙烷、

1，2，3，4，5‑戊苯基‑1’‑(二叔丁基磷基)二茂铁、1，1’‑双(二苯基膦)二茂铁、1，1’‑双(二叔丁基膦)二茂铁、N，N‑二甲基‑1‑(2‑联苯膦基)二茂铁乙胺中的任意一种或几种；溶剂为四氢呋喃、二氧六环、甲苯、二甲苯、2‑甲基四氢呋喃、N，N‑二甲基甲酰胺、N，N‑二甲基乙酰胺、二甲亚砜中的任意一种或几种；碱为碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、碳酸氢钠、碳酸氢钾、叔丁醇钠、叔丁醇钾、氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸钾中的任意一种或几种；稳定同位素标记的

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卤代苯为氘标记、C标记的氯苯、溴苯、碘苯中的任意一种；反应温度为30℃～150℃；反应时间为12～48小时。

3.根据权利要求1或2任意一项所述的一种稳定同位素标记嘧霉胺内标试剂的制备方法，其特征在于：所述化合物(I)与催化剂的摩尔比为(1：0.001)～(1：0.05)；所述化合物(I)与配体的摩尔比为(1：0.005)～(1：0.1)；所述化合物(I)与碱的摩尔比为(1：1)～(1：

3)；所述化合物(I)与2‑氨基‑4，6‑二甲基嘧啶的摩尔比为(1：1～1：1.5)；反应温度为80℃～120℃；反应时间为12～24小时。

说明书

一种稳定同位素标记嘧霉胺内标试剂的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种食品安全检测用稳定同位素标记嘧霉胺内标试剂的制备方法，属于食品安全检测用标准物质研发领域。

背景技术

[0002] 嘧霉胺(Pyrimethanil，Cas No.:53112‑28‑0)是由法国安万特公司研发，20世纪末投入使用的一种苯氨基嘧啶类新型内吸性杀菌剂，其作用机理独特，能通过抑制病菌浸染酶的产生从而阻止病菌的侵染并杀死病菌,具有叶片穿透、根部内吸活性，对葡萄、草莓、番茄、黄瓜、洋葱、茄子及观赏植物等的灰霉病具有优异防治效果。近年来，嘧霉胺在蔬菜、茶叶等植物源性食品生产中使用量不断增加，由于其直接喷洒在农作物上，通过食用进入人体，其残留量过大不可避免的对人体健康造成危害。美国、日本和欧盟等已相继对蔬菜中嘧霉胺的最高残留量做了限量规定，欧盟也于2014年起对进口茶叶正式实施新农残限量标准，其中把嘧霉胺的残留限量规定为0.05ppm。我国也在《GB 2763‑2021食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中规定了嘧霉胺在各类食品中最高残留限量。同时，我国检测该物质的相关标准有《GB 23200.121‑2021食品安全国家标准植物源性食品中331种农药及其代谢物残留量的测定液相色谱‑质谱联用法》、《GB 23200.13‑2016食品安全国家标准茶叶中448种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱‑质谱法》等。

[0003] 因国内无相对应的稳定同位素标记内标化合物供应，而国外产品进口价格昂贵、供货周期长且供应不稳定，目前上述检测标准都采用外标法来进行定量检测。稳定同位素稀释质谱法是国际上公认的痕量检测的“金标准”，能够显著的降低基质效应，提高检测结果的精确度，使用该化合物对应的稳定同位素标记的化合物作为内标使用内标法来进行检测定量会显著提高检测结果的准确性，降低该化合物的检出限。因此，研制稳定同位素标记嘧霉胺内标试剂对于我国食品安全监督检测工作相关领域具有重要意义。

[0004] 目前，现有技术中该天然丰度的化合物合成文献有很多，例如路线一：授权中国发明专利“一种嘧霉胺的制备方法”(CN 102816122 B)、“一种高纯度嘧霉胺的制备方法及用于制备高纯度嘧霉胺的设备”(CN 10461016 B)、国际专利“METHOD FOR PRODUCING(4,6‑DIMETHYLPYRIMIDINE‑2‑YL)‑PHENYLAMINE(PYRIMETHANIL)”(WO2011067362(A1))中均是以苯胺、盐酸、单氰胺、碳酸钠为原料进行加成成盐反应，合成苯基胍碳酸盐，最后与乙酰丙酮进行环合反应制得嘧霉胺。

[0005] 路线二：周艳丽，薛超.杀菌剂嘧霉胺的合成研究[J].农药科学与管理，2005，26(9)：24‑25.中报道的嘧霉胺的合成方法是以硝酸胍、乙酰丙酮、碳酸钾为原料先合成2‑氨基‑4，6‑二甲基嘧啶，然后再与亚硝酸钠和稀盐酸进行重氮化反应得到2‑氯‑4，6‑二甲基嘧啶，最后与苯胺加成得到嘧霉胺。

[0006] 上述路线一中采用的原料单氰胺有毒，极刺激腐蚀皮肤、呼吸道、粘膜；路线二中苯胺的化学当量接近2当量，此两条路线均不适合用来合成稳定同位素标记嘧霉胺内标试剂。

[0007] 截至目前，稳定同位素标记的嘧霉胺内标试剂的合成路线及工艺均无文献报道。

[0008] 因此，亟需开发一种原料易得、操作简单、避免使用有毒刺激性原料、反应条件温和、反应路线短、最终产品总收率高且易分离提纯、同位素丰度不稀释的稳定同位素标记嘧霉胺内标试剂的制备方法，以满足该化合物在国内食品安全监督监管方面日益增长的应用需求。

发明内容

[0009] 本发明的目的是提供一种适用于食品安全检测用稳定同位素标记嘧霉胺内标试剂的制备路线方法。该制备路线方法原料易得、操作简单、避免使用有毒刺激性原料、反应条件温和、反应路线短、最终产品总收率高且易分离提纯、同位素丰度不稀释。

[0010] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：1.一种稳定同位素标记嘧霉胺内标试剂的制备方法，该稳定同位素标记嘧霉胺内标试剂的化学结构如式(稳定同位素标记嘧霉胺)所示：

[0011] 其中*为12C或13C，X为H或D，其特征在于，其制备路线为：

[0012]

[0013] 其中*为12C或13C，X为H或D，Y为Cl、Br或I，制备步骤如下：

[0014] (1)在氮气保护、加入稳定同位素标记卤代苯(I)，然后加入2‑氨基‑4，6‑二甲基嘧啶、催化剂、配体、有机溶剂、碱存在条件下，在30℃～150℃条件下，反应6～48小时；TLC跟踪反应原料反应完全后，反应混合溶液用水淬灭，过滤，滤液用有机溶剂萃取，合并有机相，依次用水洗涤、饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入干燥剂干燥，减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记嘧霉胺。

[0015] 所述步骤(1)中，催化剂为三(二亚苄基丙酮)二钯、双二亚苄基丙酮钯、醋酸钯、氯化钯、四(三苯基膦)钯、双(二苯基膦二茂铁)二氯化钯、双(三环己基膦)二氯化钯、双(三苯基膦)二氯化钯中的任意一种或几种；配体为三(邻甲基苯基)磷、三(环己基)磷、三(2‑呋喃基)膦、三(异丙基)磷、三(叔丁基)磷、二叔丁基新戊基膦、2‑二环己基磷‑2’‑甲基联苯、2‑二环己基磷‑2’，6’‑二甲基联苯、2‑二环己基膦‑2’，4’，6’‑三异丙基联苯、2‑二环己基膦‑2’，6’‑二甲氧基‑联苯、2‑二‑叔丁膦基‑2’，4’，6’‑三异丙基联苯、正丁基二(1‑金刚烷基)膦、1，1’‑联萘‑2，2’‑双二苯膦、4，5‑双二苯基膦‑9，9‑二甲基氧杂蒽、双(2‑二苯基磷苯基)醚、2‑二环己膦基‑2’‑(N，N‑二甲胺)‑联苯、1，2‑双(二苯基膦)乙烷、1，3‑双(二苯基膦)丙烷、1，2，3，4，5‑戊苯基‑1’‑(二叔丁基磷基)二茂铁、1，1’‑双(二苯基膦)二茂铁、1，1’‑双(二叔丁基膦)二茂铁、N，N‑二甲基‑1‑(2‑联苯膦基)二茂铁乙胺中的任意一种或几种；溶剂为四氢呋喃、二氧六环、甲苯、二甲苯、2‑甲基四氢呋喃、N，N‑二甲基甲酰胺、N，N‑二甲基乙酰胺、二甲亚砜中的任意一种或几种；碱为碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、碳酸氢钠、碳酸氢钾、叔丁醇钠、叔丁醇钾、氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸钾中的任意一种或几种；稳定同位素
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标记的卤代苯为氘标记、C标记的氯苯、溴苯、碘苯中的任意一种；反应温度为30℃～150℃；反应时间为12～48小时。

[0016] 优选地，所述步骤(1)中的催化剂为三(二亚苄基丙酮)二钯、双二亚苄基丙酮钯、醋酸钯中；所述化合物(I)与催化剂的摩尔比为(1：0.001)～(1：0.05)；

[0017] 优选的，所述步骤(1)中配体为三(叔丁基)磷、1，1’‑联萘‑2，2’‑双二苯膦、4，5‑双二苯基膦‑9，9‑二甲基氧杂蒽、2‑二环己基膦‑2’‑(N，N‑二甲胺)‑联苯、2‑二环己基膦‑2’，4’，6’‑三异丙基联苯、1，3‑双(二苯基膦)丙烷；所述化合物(I)与配体的摩尔比为(1：
0.005)～(1：0.1)；

[0018] 优选地，所述步骤(1)中的有机溶剂为N，N‑二甲基甲酰胺、二氧六环、甲苯中的任意一种；

[0019] 优选地，所述步骤(1)中的碱为碳酸钾、碳酸铯、磷酸钾、叔丁醇钠、叔丁醇钾中的一种；所述化合物(I)与碱的摩尔比为(1：1)～(1：3)；

[0020] 优选地，所述化合物(I)与2‑氨基‑4，6‑二甲基嘧啶的摩尔比为(1：1～1：1.5)。

[0021] 优选地，所述步骤(1)中的反应温度为80℃～120℃。

[0022] 优选地，所述步骤(1)中的反应时间为12～24小时。

[0023] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明的食品安全检测用稳定同位素标记嘧霉胺内标试剂的制备方法，采用市售可得的中间体及稳定同位素标记卤代苯为原料，经一步Buchwald‑Hartwig交叉偶联反应直接得到稳定同位素标记嘧霉胺。本发明方法所使用的原料简单易得且价格低廉、避免使用有毒刺激性原料、合成步骤仅需一步、反应条件温和、反应收率高；同时具有最终产品副产物少、易于分离提纯、化学纯度高、同位素丰度不稀释等优点。该稳定同位素标记嘧霉胺内标试剂的制备路线及方法未有文献报道，该方法制备所得的稳定同位素标记嘧霉胺化学纯度大于98％，同位素丰度大于98％。本制备方法所制得的食品安全检测用稳定同位素标记嘧霉胺内标试剂对我国相关的食品安全监督检测领域的发展具有重要意义。附图说明：

[0024] 图1：嘧霉胺(苯基‑D5)的1HNMR图

[0025] 图2：嘧霉胺(苯基‑D5)的HRMS图

[0026] 图3：嘧霉胺(苯基‑D5)的HPLC图

具体实施方式

[0027] 下面结合实施例及其附图进一步叙述本发明，但它并不是对本发明的范围的任何限制。

[0028]

[0029] 实施例1：

[0030] 在25mL三口瓶中，在氮气保护下，加入氘代溴苯(810mg，5mmol)、醋酸钯(16.8mg，0.075mmol)、三(叔丁基)磷(60.7mg，0.3mmol)、磷酸钾(1.59g，7.5mmol)、2‑氨基‑4，6‑二甲基嘧啶(647mg，5.25mmol)、甲苯(10mL)；在100℃下反应24小时，TLC跟踪反应原料反应完全后，反应液冷却至室温，加入20mL水，用乙酸乙酯(3×20mL)萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入无水硫酸钠干燥，抽滤除去干燥剂，减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记嘧霉胺(苯基‑D5)(847mg，收率83％)。

[0031] 实施例2：

[0032] 在25mL三口瓶中，在氮气保护下，加入氘代溴苯(810mg，5mmol)、双二亚苄基丙酮钯(86mg，0.15mmol)、1，1’‑联萘‑2，2’‑双二苯膦(187mg，0.3mmol)、叔丁醇钠(671mg，7mmol)、2‑氨基‑4，6‑二甲基嘧啶(677mg，5.5mmol)、甲苯(10mL)；在110℃下反应16小时；
TLC跟踪反应原料反应完全后，反应液冷却至室温，加入20mL水，用乙醚(3×20mL)萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入无水硫酸钠干燥，抽滤除去干燥剂，减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记嘧霉胺(苯基‑D5)(950mg，收率93％)。

[0033] 实施例3：

[0034] 在25mL三口瓶中，在氮气保护下，加入氘代溴苯(810mg，5mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(92mg，0.1mmol)、4，5‑双二苯基膦‑9，9‑二甲基氧杂蒽(87mg，0.15mmol)、碳酸铯(2.6g，8mmol)、2‑氨基‑4，6‑二甲基嘧啶(739mg，6mmol)、二氧六环(10mL)；在80℃下反应20小时，TLC跟踪反应原料反应完全后，反应液冷却至室温，加入20mL水，用乙酸乙酯(3×20mL)萃取，合并有机相，依次用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，饱和氯化钠溶液洗涤，加入无水硫酸钠干燥，抽滤除去干燥剂，减压蒸馏除去溶剂，残留物经柱层析得到稳定同位素标记嘧霉
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胺(苯基‑D5)(990mg，收率97％)。H NMR(CDCl3，300MHz)：δ7.29(brs，1H)，6.50(s，1H)，2.39+
(s，6H)，参见附图1；HRMS(ESI+)205.14879[M+H] ，参见附图2；HPLC测得化学纯度＝
99.55％，参见附图3；同位素丰度＝98.76％，参见表1。

[0035] 表1嘧霉胺(苯基‑D5)的同位素丰度

[0036]

[0037] 质量标准满足食品安全检测用液相色谱串联质谱法所需稳定同位素标记内标试剂质量要求。

[0038] 13C标记的稳定同位素标记嘧霉胺合成路线工艺同上述实施例中稳定同位素标记嘧霉胺的合成路线工艺。

[0039] 以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。