一类GLP-1/glucagon/Y2受体三重激动剂及其应用

摘要

本发明提供了一类GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂及其应用，所述的三重激动剂对人GLP‑1、glucagon和Y2受体具有三重激动活性。本发明的GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂在有效降低血糖的同时具有显著减轻减重和治疗NAFLD的有益作用。本发明提供的GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂的化学性质稳定，具有支持一天一次给药的药代动力学特征，适合作为治疗代谢性疾病(如糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪肝病、血脂障碍等)等药物的活性成分。

权利要求

1.一类GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂，其特征在于，所述GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂的氨基酸序列为下列序列之一：dS表示右旋丝氨酸。

2.一类GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂药学上可接受的盐，其特征在于：所述的GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂的氨基酸序列为权利要求1中所述的氨基酸序列之一。

3.根据权利要求2所述的一类GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂药学上可接受的盐，其特在于，所述盐为GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂与下述化合物中的一种所形成的盐：盐酸、乙酸、水杨酸、月桂酸、肉桂酸、柠檬酸、草酸、乳酸、琥珀酸。

4.权利要求1所述的一类GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂所制备的药剂，其特征在于，所述药剂是任何一种药剂学上所述的片剂、胶囊、吸入剂、喷雾剂、注射剂、膜剂、贴剂、乳剂、栓剂或者复方制剂，药剂由一类GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂和药学上可接受的药用辅料组成。

5.含有一类GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂的药物组合物，其特征在于，该药物组合物以权利要求1所述的GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂为有效原料，或者以权利要求

2或3所述的GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂药学上可接受的盐为有效原料，再加上药学上可接受的载体组成。

6.权利要求1‑5项中任意一项所述的GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂或其药学上可接受的盐、或其药物组合物或其药剂在制备用于治疗代谢性疾病或病症的药物中的用途；

所述代谢性疾病或病症为糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪肝病和血脂障碍。

说明书

一类GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一类GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂及其应用。

背景技术

[0002] 肥胖及其相关代谢综合征已成为全球性的公众健康问题，许多代谢综合征如2型糖尿病(T2DM)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、血脂代谢异常的发病率与病程发展都与肥胖密切相关。GLP‑1是由小肠L细胞所分泌的一种葡萄糖依赖性降血糖多肽激素，其最主要的功能就是促进胰岛素的分泌。胰高血糖素糖肽‑1(GLP‑1)可以抑制食欲、延缓胃排空实现降低体重的作用。虽然GLP‑1具有优异的降糖作用和一定的减重效果，但是如果需要实现较好的体重减轻作用，一般需要加大给药剂量，而大剂量给予GLP‑1类药物容易产生胃肠道副作用、耐受性差而导致治疗窗较窄。因此，仍然需要更为安全耐受的，可有效减轻体重和控制血糖的治疗剂。

[0003] 胰高血糖素(glucagon)是在胰脏的α细胞中生成的激素，在机体寒冷、饥饿等应激状态下作用于肝脏，将肝脏中的糖原进行分解而提高血糖。另外，glucagon在体内还具有促进脂解、脂肪氧化、发热等作用(Diabetologia,2017,60,1851–1861)，长期给药可以通过增加能量代谢量而呈现出体重减轻药效，但glucagon这些对能量代谢的有益作用因其固有的升血糖作用而未能得以应用。在动物和人体内外周给予GLP‑1和glucagon可同时实现降血糖和减轻体重的效果，目前已有多种GLP‑1/glucagon受体双重激动剂在临床研究阶段，但是GLP‑1/glucagon受体双重激动剂存在胃肠道副作用较大的缺陷。

[0004] 神经肽Y(NPY)是一种36个氨基酸肽的神经递质，是已经显示存在于外周和中枢神经系统两者中的神经递质/神经激素的胰腺多肽类别的成员。NPY是已知的最有效的开胃剂之一，并且显示在调节包括人的动物的食物摄取上具有重要作用。NPY受体共有4种亚型，Y1、Y2、Y4和Y5，其中神经肽‑2(Y2)受体广泛分布在啮齿动物和人的中枢神经系统中。在下丘脑中，Y2mRNA定位在弓状核、视前核和背内侧核中。在人脑中，Y2受体是主要的NPY受体亚型。在弓状核中，超过80％的NPY神经元共表达Y2受体mRNA。选择激动Y2受体可以抑制摄食，具有减重的效果。

[0005] 肽YY3‑36(PYY3‑36)是34个氨基酸的线性肽，其具有Y2受体的激动活性，在动物和人体内联合注射GLP‑1和PYY3‑36，具有很好的降糖和减重作用，说明同时激动GLP‑1和Y2受体，能够在保持GLP‑1降糖作用的前提下，进一步利用激动Y2受体所带来的食欲抑制效果产生更好的减重作用。Novo Nordisk在2021年报道了一类具有GLP‑1和Y2受体双重激动活性的GLP‑1和短链PYY3‑36类似物的杂合肽。但是，该类化合物没有经过长效化修饰，其体内稳定性较为有限，无法实现长效给药(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,2021,6；60(15):8268‑8275)。Brandon等揭示了一类exendin‑4与短链PYY3‑36类似物的杂合肽，具有较好的GLP‑1和Y2受体双重激动活性，与Novo Nordisk所报道的化合物类似，该类化合物也没有经过任何长效化修饰，稳定性较差(J.Med.Chem.,202,28；64(2):1127‑1138)。

[0006] 目前，还缺乏能同时整合GLP‑1、glucagon和PYY3‑36对于血糖、摄食和能量代谢的有益作用的GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂，以此开发出活性更为优异的抗代谢性疾病的药物。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一类具有GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂及其应用，该激动剂可对人GLP‑1受体、glucagon和Y2受体具有三重激动活性且稳定性高，具有一天一次给药的药代动力学特征；将其应用于制备治疗代谢综合征，诸如糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪肝病、血脂障碍等疾病药物方面具有更大的潜力。

[0008] 为实现上述发明目的，本发明的技术方案具体如下：

[0009] 一类GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂，所述GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂的氨基酸序列为下列序列之一：

[0010] (1)SEQ ID NO:1

[0011]

[0012] (2)SEQ ID NO:2

[0013]

[0014] (3)SEQ ID NO:3

[0015]

[0016] (4)SEQ ID NO:4

[0017]

[0018] (5)SEQ ID NO:5

[0019]

[0020] (6)SEQ ID NO:6

[0021]

[0022] (7)SEQ ID NO:7

[0023]

[0024] (8)SEQ ID NO:8

[0025]

[0026] (9)SEQ ID NO:9

[0027]

[0028] 本发明还提供了一类GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂药学上可接受的盐。

[0029] 优选的，所述盐为GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂与下述化合物中的一种所形成的盐：盐酸、乙酸、水杨酸、月桂酸、肉桂酸、柠檬酸草酸、乳酸、琥珀酸。

[0030] 本发明还提供了GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂所制备的药剂，所述的药剂是任何一种药剂学上所说的片剂、胶囊、吸入剂、喷雾剂、注射剂、膜剂、贴剂、乳剂、栓剂或者复方制剂，药剂由一类GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂和药学上可接受的药用辅料、载体或稀释剂组成。

[0031] 本发明还提供了含有一类GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂的药物组合物，该药物组合物以上述GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂为有效原料，或者其药学上可接受的盐为有效原料，再加上药学上可接受的载体或稀释剂组成。

[0032] 本发明还提供了本发明所述的GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂或其药学上可接受的盐、或其药物组合物或其药剂在制备用于治疗代谢性疾病或病症的药物中的用途。在特定方面，代谢性疾病或病症为糖尿病、肥胖症、NAFLD、血脂障碍。在特定方面，糖尿病为T1DM、T2DM或妊娠糖尿病。在特定方面，所述药物用于治疗超过一种代谢疾病或病症，例如，糖尿病和肥胖；糖尿病和NAFLD；糖尿病和血脂障碍；糖尿病、血脂障碍和肥胖。

[0033] 与现有技术相比，本发明的有益效果：

[0034] 本发明提供一类基于GLP‑1类似物、glucagon和PYY3‑36序列设计的变体，保留GLP‑1类似物对糖尿病的治疗作用同时具有glucagon对代谢的有益作用和PYY3‑36对食欲抑制的有益作用，从而对糖、脂、能量代谢产生协同影响，在有效降低血糖的同时具有显著减轻减重和治疗NAFLD的有益作用。另外，本发明提供的GLP‑1/glucagon/Y2受体三重激动剂化学性质稳定，具有支持一天一次给药的药代动力学特征。本发明提供的三重激动剂对T2DM、肥胖、NAFLD、血脂障碍等代谢性疾病的治疗作用优于现有上市药物。因此，本发明提供的三重激动剂适合作为治疗代谢性疾病(如糖尿病、肥胖症、NAFLD、血脂障碍等)药物的活性成分。

附图说明

[0035] 图1显示的是各受试物单次给药在ICR小鼠上的摄食抑制作用结果示意图；

[0036] 图2显示的是各受试物单次给药在ICR小鼠上的急性降血糖作用结果示意图；

[0037] 图3显示的是各受试物在DIO小鼠长期给药21天的体重变化百分比结果示意图。

具体实施方式

[0038] 以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

[0039] 除非本文另有定义，否则本申请书中所使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。通常，本文所述的与化学、生物学、药理学关联使用的术语和方法是本领域中公知和常用的。

[0040] 另外，本发明涉及的氨基酸根据IUPAC‑IUB的命名规则缩写如下：

[0041] 丙氨酸(Ala，A)；精氨酸(Arg，R)；天冬酰胺(Asn，N)；天冬氨酸(Asp，D)；半胱氨酸(Cys，C)；谷氨酸(Glu，E)；谷氨酰胺(Gln，Q)；甘氨酸(Gly，G)；组氨酸(His，H)；异亮氨酸(Ile，I)；亮氨酸(Leu，L)；赖氨酸(Lys，K)；甲硫氨酸(Met，M)；苯丙氨酸(Phe，F)；脯氨酸(Pro，P)；丝氨酸(Ser，S)；苏氨酸(Thr，T)；色氨酸(Trp，W)；酪氨酸(Tyr，Y)；缬氨酸(Val，V)。

[0042] 另外，除非明确标明，本发明的多肽化合物中的所有氨基酸残基优选为L构型。

[0043] 另外，所述序列的C端上的“‑NH2”部分表明C端上的酰胺基(‑CONH2)。

[0044] 另外，本发明序列中除了天然氨基酸以外，还使用了非天然氨基酸右旋丝氨酸(dSer，dS)。

[0045] 实施例1

[0046] SEQ ID NO:1多肽化合物的合成

[0047]

[0048] (1)树脂的溶胀

[0049] 称取担载量为0.36mmol/g的Rink Amide MBHA树脂0.278g(0.1mmol当量)，放入25mL的反应器中，用7mL的DCM和甲醇交替清洗树脂1次，7mL的DCM清洗树脂2次，然后用7mL的DCM溶胀树脂1h，最后用7mL DMF清洗树脂3次。

[0050] (2)树脂Fmoc保护基的脱除

[0051] 将溶胀后的树脂转入PSI‑200多肽合成仪，加入7mL 20％哌啶/DMF(v/v)室温反应5min，滤去脱保护溶液，7mL DMF清洗树脂一次，再加入7mL 20％哌啶/DMF(v/v)脱保护溶剂与树脂反应15min，最后7mL DMF清洗树脂4次，每次2min，得到脱除Fmoc保护基的Rink树脂。

[0052] (3)Fmoc‑Tyr‑Rink amide‑MBHAResin的合成

[0053] 称Fmoc‑Tyr(tBu)‑OH(0.4mmol)，用2mL DMF溶解，加入3mL DIC/HOBt(0.4mmol/0.44mmol)缩合剂，加入反应器中，室温震荡反应2h，滤去反应液后用7mL DMF清洗树脂4次，使用Kaiser试剂检测反应耦合是否完全，如不完全则2次耦合。

[0054] (4)PYY部分(右侧部分)肽链的延长

[0055] 按照PYY部分肽链的序列(IKPEA PGEDA SPEEL NRYYA SLRHY LNLVT RQRY‑NH2)，重复上述脱保护和耦合的步骤依次连接上相应的氨基酸，直至肽链合成完毕。

[0056] (5)连接臂的合成

[0057] 在PYY部分肽链合成完毕后，继续合成连接臂部分，加入0.4mmol的Fmoc‑AEEA‑OH，0.4mmol的DIC及0.44mmol的HOBt，震荡缩合反应2h。脱除Fmoc保护基后，再次加入0.4mmol的Fmoc‑AEEA‑OH，0.4mmol的DIC及0.44mmol的HOBt，震荡缩合反应2h。脱除Fmoc保护基后，加入0.4mmol的3‑马来酰亚胺基丙酸，0.4mmol的DIC及0.44mmol的HOBt，震荡缩合反应2h。

[0058] (6)包含连接臂的PYY部分的裂解

[0059] 将上述得到的连有多肽的树脂转移至圆底瓶中，使用切割剂Reagent R(TFA/苯甲硫醚/苯酚/EDT，90:5:3:2，V/V)5mL切割树脂，在油浴中恒温30℃反应2h，切割液倾入40mL冰乙醚中，冷冻离心后粗品用15mL冰乙醚洗涤3次，最后用氮气吹干，得到包含连接臂的PYY部分的粗肽。

[0060] (7)GLP‑1/glucagon部分(左侧部分)序列的合成

[0061] 称取担载量为0.36mmol/g的Rink Amide MBHA树脂0.278g(0.1mmol当量)，放入25mL的反应器中，用10mL的DCM和甲醇交替清洗树脂1次，10mL的DCM清洗树脂2次，然后用
10mL的DCM溶胀树脂1h，最后用10mL DMF清洗树脂3次。将溶胀后的树脂转入PSI‑200多肽合成仪，加入10mL 20％哌啶/DMF(v/v)室温反应5min，滤去脱保护溶液，10mL DMF清洗树脂一次，再加入10mL 20％哌啶/DMF(v/v)脱保护溶剂与树脂反应15min，最后10mL DMF清洗树脂
4次，每次1.5min，得到脱除Fmoc保护基的Rink树脂。称Fmoc‑Cys(Trt)‑OH(0.4mmol)，用2mL 
10％DMF/DMSO(v/v)溶解，加入3mL DIC/HOBt(0.4mmol/0.44mmol)缩合剂，加入反应器中，室温震荡反应2h，滤去反应液后用10mLDMF清洗树脂4次，使用Kaiser试剂检测反应耦合是否完全，如不完全则2次耦合。

[0062] (8)GLP‑1/glucagon部分肽链的延长

[0063] 按照肽链的序列，重复上述脱保护和耦合的步骤依次连接上相应的氨基酸，直至肽链合成完毕。其中侧链修饰位点的Lys采用Fmoc‑Lys(Dde)‑OH保护策略，同时N末端的His使用的是Boc‑His(Boc)‑OH。

[0064] (9)GLP‑1/glucagon部分Lys侧链的修饰

[0065] 肽链合成完毕后，加入7mL 2％水合肼/DMF(v/v)选择性脱除Lys的Dde保护基，Dde保护基脱除后加入0.4mmol的Fmoc‑Glu‑OtBu，0.4mmol的DIC及0.44mmol的HOBt，震荡反应2h。脱除Fmoc保护基后，再次加入0.4mmol的Fmoc‑Glu‑OtBu、0.4mmol的DIC及0.44mmol的HOBt，震荡缩合反应2h。脱除Fmoc保护基后，加入0.4mmol的棕榈酸，0.4mmol的DIC及
0.44mmol的HOBt缩合反应2h，反应完全后用7mL DMF清洗树脂4次。

[0066] (10)GLP‑1/glucagon部分的裂解

[0067] 将上述得到的连有多肽的树脂转移至圆底瓶中，使用切割剂Reagent R(TFA/苯甲硫醚/苯酚/EDT，90:5:3:2，V/V)5mL切割树脂，在油浴中恒温30℃反应2h，切割液倾入40mL冰乙醚中，冷冻离心后粗品用15mL冰乙醚洗涤3次，最后用氮气吹干，得到GLP‑1/glucagon部分的粗肽。

[0068] (11)目标多肽的合成

[0069] 将0.05mmol的包含连接臂的PYY部分的粗肽与0.05mmol的GLP‑1/glucagon部分的粗肽溶解于2mL的NMP中，加入0.005mmol的DIPEA催化，反应20分钟后，加入5mL 50％的甲醇/水(0.1％TFA)停止反应，反应液用0.25μm微孔滤膜过滤后进岛津制备型反相HPLC系统纯化。色谱条件为C18反相制备柱(250mm×20mm，12μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：甲醇(V/V)；流速为8mL/min；检测波长为214nm。采用线性梯度(20％B～90％B/30min)洗脱，收集目标峰，除去甲醇后冻干得纯品0.012g，纯度大于98％，通过MS确认目标多肽的8+ 9+
分子量。理论相对分子质量为9242.3。ESI‑MS m/z:计算值[M+8H] 1156.3,[M+9H]
8+ 9+
1027.9；观察值[M+8H] 1156.0,[M+9H] 1027.7。

[0070] 实施例2

[0071] SEQ ID NO:2多肽化合物的合成

[0072]

[0073] 合成方法同实施例1，收集目标峰冻干得纯品0.014g，纯度大于98％，通过MS确认8+
目标多肽的分子量。理论相对分子质量为9532.7。ESI‑MS m/z:计算值[M+8H] 1192.6,[M+
9+ 8+ 9+
9H] 1060.2；观察值[M+8H] 1192.3,[M+9H] 1059.9。

[0074] 实施例3

[0075] SEQ ID NO:3多肽化合物的合成

[0076]

[0077] 合成方法同实施例1，收集目标峰冻干得纯品0.016g，纯度大于98％，通过MS确认9+
目标多肽的分子量。理论相对分子质量为10113.2。ESI‑MS m/z:计算值[M+9H] 1124.7,[M+
10+ 9+ 10+
10H] 1012.3；观察值[M+9H] 1124.6,[M+10H] 1012.2。

[0078] 实施例4

[0079] SEQ ID NO:4多肽化合物的合成

[0080]

[0081] 合成方法同实施例1，收集目标峰冻干得纯品0.011g，纯度大于98％，通过MS确认7+
目标多肽的分子量。理论相对分子质量为9413.4。ESI‑MS m/z:计算值[M+7H] 1345.8,[M+
8+ 7+ 8+
8H] 1177.7；观察值[M+7H] 1345.4,[M+8H] 1177.3。

[0082] 实施例5

[0083] SEQ ID NO:5多肽化合物的合成

[0084]

[0085] 合成方法同实施例1，收集目标峰冻干得纯品0.015g，纯度大于98％，通过MS确认10+
目标多肽的分子量。理论相对分子质量为9703.8。ESI‑MS m/z:计算值[M+10H] 971.4,[M+
11+ 10+ 11+
11H] 883.2；观察值[M+10H] 971.2,[M+11H] 882.9。

[0086] 实施例6

[0087] SEQ ID NO:6多肽化合物的合成

[0088]

[0089] 合成方法同实施例1，收集目标峰冻干得纯品0.013g，纯度大于98％，通过MS确认9+
目标多肽的分子量。理论相对分子质量为10284.4。ESI‑MS m/z:计算值[M+9H] 1143.7,[M+
11+ 9+ 11+
11H] 935.9；观察值[M+9H] 1143.5,[M+11H] 935.6。

[0090] 实施例7

[0091] SEQ ID NO:7多肽化合物的合成

[0092]

[0093] 合成方法同实施例1，收集目标峰冻干得纯品0.010g，纯度大于98％，通过MS确认9+
目标多肽的分子量。理论相对分子质量为9329.3。ESI‑MS m/z:计算值[M+9H] 1037.6,[M+
10+ 9+ 10+
10H] 933.9；观察值[M+9H] 1038.9,[M+10H] 933.7。

[0094] 实施例8

[0095] SEQ ID NO:8多肽化合物的合成

[0096]

[0097] 合成方法同实施例1，收集目标峰冻干得纯品0.014g，纯度大于98％，通过MS确认9+
目标多肽的分子量。理论相对分子质量为9619.7。ESI‑MS m/z:计算值[M+9H] 1069.9,[M+
10+ 9+ 10+
10H] 963.0；观察值[M+9H] 1069.8,[M+10H] 962.8。

[0098] 实施例9

[0099] SEQ ID NO:9多肽化合物的合成

[0100]

[0101] 合成方法同实施例1，收集目标峰冻干得纯品0.015g，纯度大于98％，通过MS确认9+
目标多肽的分子量。理论相对分子质量为10200.3。ESI‑MS m/z:计算值[M+9H] 1134.4,[M+
10+ 9+ 10+
10H] 1021.0；观察值[M+9H] 1133.9,[M+10H] 1020.7。

[0102] 实施例10

[0103] 多肽化合物对人GLP‑1受体、glucagon和Y2受体的激动活性测定

[0104] 通过功能测定法来确定多肽化合物对受体的激动作用，GLP‑1受体和glucagon受体激动活性通过测量稳定表达人GLP‑1受体或glucagon受体的HEK‑293细胞系的cAMP响应。将稳定表达GLP‑1受体或glucagon受体的细胞分入T175培养瓶并在培养基(DMEM/10％FBS)中过夜生长至接近汇合状态，然后除去培养基，并用无钙和镁的PBS洗涤细胞，然后用Accutase酶进行蛋白酶处理。洗涤脱离的细胞并将其重悬于测定缓冲液(20mM HEPES,
0.1％BSA,2mM IBMX,1×HBSS)中，并确定细胞密度，并将25μL的等分试样分装至96孔板的孔中。为了测量，将25μL的测试多肽化合物在测定缓冲液中的溶液添加到孔中，然后室温温育30分钟。用Cisbio的试剂盒，基于均相时间分辨荧光(HTRF)来确定细胞的cAMP含量。添加稀释于裂解缓冲液(试剂盒组分)中的HTRF试剂后，将平板温育30分钟，然后测量665/620nm处的荧光比。通过检测引起最大响应的50％激活的浓度(EC50)来对激动剂的体外效力进行量化。

[0105] 使用稳定表达人Y2受体和cAMP敏感的钙离子通道的HEK‑293细胞测定化合物对Y2受体的激动作用。首先，将细胞培养在培养基中(DMEM、10％FBS、遗传霉、遗传霉素、青霉/链霉素)，然后将每孔20μL的细胞悬液添加到384孔板中(20000个细胞/孔)。然后用钙敏感染料在37℃、5％CO2条件下预处理细胞50分钟，接着在25℃下预处理10分钟。将待测化合物按4倍量连续稀释10次，并将750nL的测试化合物转移到384孔板。然后从培养箱中取出384孔板并将其放入FLIPR Tetra System，测量荧光信号，测量荧光信号(激发494nm/发射
516nm)，通过检测引起最大响应的50％激活的浓度(EC50)来对激动剂的体外效力进行量化。

[0106] 将本专利申请实施例中的检测数据(nM)显示于下表1中，虽然用一定数量的有效数字来陈述检测数据，但不应该认为表示数据已确定精确为有效数字的数。

[0107] 表1：多肽化合物对人GLP‑1受体、Glucagon受体及Y2受体的激动活性[0108]

[0109]

[0110] 如表1所示，所有多肽化合物都显示出了对GLP‑1受体、glucagon受体和Y2受体的三重激动活性，说明这些多肽化合物均具有三重激动剂的特点。同时，部分多肽化合物显示出了与GLP‑1、glucagon和PYY3‑36接近或者更好的GLP‑1受体、glucagon受体和Y2受体的激动活性。

[0111] 实施例11

[0112] 多肽化合物对ICR小鼠进食的影响

[0113] 雄性ICR小鼠，随机分为5组，每组6只。实验前小鼠禁食12h，空白组皮下注射给予生理盐水(10mg/kg)，给药组分为4组，小鼠非空腹状态下分别皮下单次注射30nmol/kg的liraglutide、GEP 44(GLP‑1/Y2受体双重激动剂，J.Med.Chem.2021,64,2,1127–1138)、xGLP/GCG‑15(GLP‑1/glucagon受体双重激动剂，European Journal of Medicinal Chemistry,2021,212,113118)和SEQ ID NO:6。然后立即给予小鼠预先称重的鼠饲料，并在2h,4h,6h,12h和24h再次称饲料重量，计算小鼠在不同时间点的摄食量。

[0114] 如图1结果所示，在ICR小鼠体内的摄食实验结果表明，在24小时，SEQ ID NO:6多肽化合物显著的降低了小鼠的进食量，并且其抑制摄食作用明显优于liraglutide、GEP44和xGLP/GCG‑15，说明本发明的多肽化合物具有优异的抑制进食效果。

[0115] 实施例12

[0116] 多肽化合物在大鼠体内的药代动力学性质

[0117] SD大鼠给予50nmol/kg的liraglutide和SEQ ID NO:6皮下(s.c.)注射给药，在给药后0.25h，0.5h，1h，2h，4h，8h，16h和24h收集血样。使用乙腈沉淀蛋白质后，用LC‑MS分析血浆样品。用WinonLin 5.2.1(非房室模型)计算药代参数和半衰期(表2)。

[0118] 表2：多肽化合物在大鼠体内的药代动力学概貌

[0119] 样品 T1/2(h) Cmax(ng/mL)Liraglutide 2.3 489
SEQ ID NO:6 4.6 398

[0120] 如表2结果显示，本发明的多肽化合物的体内半衰期显著延长，优于liraglutide，具有支持每天一次给药的药代动力学特征。

[0121] 实施例13

[0122] 多肽化合物在小鼠体内急性降血糖活性

[0123] 雄性ICR小鼠，随机分组，每组6只。只给饮水，禁食过夜。空白组腹腔注射给予生理盐水(10mg/kg)，给药组分为4组，小鼠非空腹状态下分别腹腔单次注射30nmol/kg的liraglutide、GEP 44(GLP‑1/Y2受体双重激动剂，J.Med.Chem.2021,64,2,1127–1138)、xGLP/GCG‑15(GLP‑1/glucagon受体双重激动剂，European Journal of Medicinal Chemistry,2021,212,113118)和SEQ ID NO:6。30分钟后，各组小鼠腹腔给予3g/kg的葡萄糖溶液。在‑30min，0min，15min，30min，60min，120min用血糖仪测定血糖水平[0124] 如图2结果所示，在ICR小鼠体内的急性降糖实验表明，SEQ ID NO:6多肽化合物显著的提高了小鼠的糖耐量水平，具有优异的降血糖作用，其降血糖作用还优于liraglutide和GEP44。

[0125] 实施例14

[0126] 多肽化合物对饮食诱导肥胖(DIO)小鼠血酯和体重的影响

[0127] 雄性C57BL/6J小鼠，体重22g左右，模型组共18只，用Research Diets公司的D12492高脂饲料饲养18周造DIO小鼠模型。在给药开始前，各组DIO小鼠按照体重随机分组，共分为5组，每组6只，分别为生理盐水组(空白对照组)、阳性对照组(liraglutide、GEP44、xGLP/GCG‑15)和受试样品组(SEQ ID NO:6)。各组小鼠每天两次皮下注射生理盐水(10mg/kg)，liraglutide(30nmol/kg)，xGLP/GCG‑15(30nmol/kg)，SEQ ID NO:6(10nmol/kg)，每天三次皮下注射GEP44(30nmol/kg)，给药周期21天。每天记录小鼠体重变化。在实验结束后，各组小鼠处死，取血制血清，取肝脏制匀浆，并分别测量肝脏和血清的甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量。

[0128] 如图3结果显示，本发明的多肽化合物SEQ ID NO:6在10nmol/kg的剂量下，在DIO小鼠体内连续给药3周，可以降低36.2％的小鼠体重。而三个阳性对照化合物，在三倍于SEQ ID NO:6的剂量下(30nmol/kg)，liraglutide只能降低15.1％的小鼠体重，GEP44只能降低24.9％的小鼠体重，xGLP/GCG‑15只能降低27.0％的小鼠体重。以上结果表明SEQ ID NO:6在低剂量下就可以实现显著高于liraglutide、GEP44和xGLP/GCG‑15的减重效果，说明其具有优异的减重作用。

[0129] 表3：DIO小鼠治疗3周后的血清总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量

[0130]

[0131]

[0132] ***：与空白对照组相比P<0.001；###：与liraglutide、GEP44和xGLP/GCG‑15组比P<0.001(One‑WayANOVA,Tukey post hoc test)，结果表示为每组6只小鼠平均值±SD。

[0133] 表4：DIO小鼠治疗3周后的肝脏总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量

[0134]样品(剂量) 总胆固醇(mg/g) 甘油三酯(mg/g)
空白对照(生理盐水组) 14.26±1.59 94.28±6.71
* ***
Liraglutide(30nmol/kg) 12.11±1.25 73.07±4.78
** ***
GEP44(30nmol/kg) 11.65±0.86 77.72±6.62
*** ***
xGLP/GCG‑15(30nmol/kg) 10.15±0.75 61.65±6.98
***,### ***,###
SEQ ID NO:6(10nmol/kg) 7.15±0.50 40.93±4.39

[0135] *：与空白对照组相比P<0.05；**：与空白对照组相比P<0.01；***：与空白对照组相比###P<0.001； ：与liraglutide、GEP44和xGLP/GCG‑15组比P<0.001(One‑WayANOVA,Tukey post hoc test)，结果表示为每组6只小鼠平均值±SD。

[0136] 如表3和表4结果显示，本发明的多肽化合物SEQ ID NO:6在10nmol/kg剂量下在DIO小鼠体内连续给药3周，可以显著降低小鼠的血清和肝脏的甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量，并且SEQ ID NO:6的降低血清和肝脏血脂的作用显著强于高剂量下的阳性对照药liraglutide(30nmol/kg)、GEP44(30nmol/kg)和xGLP/GCG‑15(30nmol/kg)。以上结果表明低剂量下的SEQ ID NO:6即可实现显著优于liraglutide、GEP44和xGLP/GCG‑15的减重和降低肝脏和血清血脂的效果，说明本发明的多肽化合物具有异常优异的减重、调脂和治疗NAFLD的作用。