与鸡柔嫩艾美尔球虫抗性相关的lncRNA及其应用转让专利
申请号 : CN202210936636.1
文献号 : CN115961063B
文献日 : 2023-08-22
发明人 : 戴国俊 , 于海亮 , 王琪 , 糜长浩 , 汤建强 , 张跟喜 , 张涛 , 谢恺舟 , 赵振华 , 王金玉
申请人 : 扬州大学
摘要 :
本发明首次公开了与京海黄鸡柔嫩艾美尔球虫抗性相关的lncRNA BTN3A2。本发明还公开了用于检测所述的与鸡柔嫩艾美尔球虫抗性相关的lncRNA BTN3A2的表达量的特异性引物。本发明还公开了所述的lncRNA BTN3A2、特异性引物、检测试剂盒在开发鸡抵抗球虫病抗性性状的辅助选择标记中的应用。本发明最后公开了筛选或培育球虫抗性鸡的方法。本发明提供的检测试剂盒可用于检测lncRNA BTN3A2在鸡盲肠组织的表达量，检测方法简单快捷。本发明还可以利用该lncRNA BTN3A2的表达量筛选或培育柔嫩艾美尔球虫抗性的鸡群体。
权利要求 :
1.lncRNA BTN3A2的过表达载体在制备治疗鸡柔嫩艾美尔球虫感染的药物或试剂中的应用，其特征在于，所述lncRNA BTN3A2的过表达载体包括pcDNA3.1‑lncRNA，所述lncRNA BTN3A2的Genebank序列号为XM_025145936.1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述pcDNA3.1‑lncRNA构建方法包括：先通过PCR法扩增目的lncRNA全长序列并引入酶切位点，PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，用BamHI和EcoRI对片段进行酶切，37℃ 酶切2小时，酶切体系如下：10×Buffer：5μl，上述扩增得到的模板42μl，BamHI和EcoRI各1.5μl，用BamHI和EcoRI对载体pcDNA3.1(+)进行酶切，37℃ 酶切2小时，酶切体系如下：10×Buffer：5μl，pcDNA 3.1(+)：5μg，BamHI和EcoRI各1.5μl，ddH2O补足50μl，用 T4 DNA ligase 连接双酶切得到的lncRNA BTN3A2目的片段和线性化的载体，22℃连接2小时，将连接产物转化感受态细胞，摇菌，然后质粒抽提。
说明书 :
与鸡柔嫩艾美尔球虫抗性相关的lncRNA及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物工程领域，具体涉及与鸡柔嫩艾美尔(E.tenella)球虫抗性相关的lncRNA及其应用。
背景技术
[0002] 鸡肉是重要的禽产品，也是人类主要的动物食品和营养来源之一。在我国鸡的消费量仅次于猪肉，排在第二位。然而，鸡的产业化饲养却受到球虫病的威胁。家禽中，有7种艾美尔球虫危害鸡，柔嫩艾美尔球虫是致病力较强的虫种之一，寄生于盲肠。目前由于抗球虫药物的广泛使用，已经很少发生因球虫感染而导致鸡的大规模死亡，但隐性感染引起的鸡增重、饲料转化率和产蛋下降等仍然给家禽业带来严重的经济损失。因此，从分子水平探索球虫病抗性和易感的分子标记，对家禽球虫病的防治具有重要意义。
[0003] 长链非编码RNA是一类长度大于200个核苷酸的RNA，极少有编码蛋白质的功能。lncRNA通过与mRNA、miRNA、DNA和蛋白质等分子互作而广泛的参与细胞的增殖，分化和凋亡，调控各种免疫反应和病理过程。最近的研究表明lncRNA在宿主抵抗病原菌的感染过程中起重要作用。为了进一步揭示影响鸡对柔嫩艾美尔球虫(E.tenella)抗性的分子遗传调控机制，需对影响鸡该性状的非编码RNA进行挖掘。
[0004] RNA测序(RNA‑seq)作为一种高通量技术，已广泛用于挖掘与重要性状相关的关键lncRNAs，也用于鉴定新的lncRNAs，新的lncRNAs的发现将有利于阐明lncRNA在鸡宿主免疫反应中的调控机制。
[0005] 目前关于与鸡球虫抗性相关的lncRNAs报道很少，因此通过鉴定新的具有潜在作用的lncRNAs来研究鸡宿主免疫的过程尤为重要，用于开发鸡球虫抗性的辅助选择标记。
发明内容
[0006] 发明目的：本发明的第一目的是提供检测lncRNA BTN3A2表达量的试剂在制备治疗鸡球虫感染的药物或试剂中的应用。
[0007] 本发明的第二目的是提供用于检测与鸡球虫抗性相关的lncRNA BTN3A2表达量的特异性引物对、荧光定量检测试剂盒以及该引物对在制备检测lncRNA BTN3A2表达量的试剂或试剂盒中的应用。
[0008] 本发明的第三目的是提供一种检测lncRNA BTN3A2表达量的试剂、所述特异性引物对或荧光定量检测试剂盒在筛选或开发鸡球虫抗性的辅助选择标记中的应用。
[0009] 本发明的第四目的是提供一种筛选或培育带有球虫病抗性的鸡的方法。
[0010] 技术方案：为了实现上述目的，本发明提供了检测lncRNABTN3A2(Genebank序列号为：XM_025145936.1，种属：鸡；长度：1397bp)表达量的试剂在制备治疗鸡球虫感染的药物或试剂中的应用，所述lncRNA BTN3A2与鸡球虫感染相关，本发明中所述的鸡球虫指的是鸡柔嫩艾美尔球虫。
[0011] 本发明还提供了检测lncRNA BTN3A2表达量的试剂在制备治疗鸡球虫感染的药物或试剂中的应用。
[0012] 本发明还提供了一种用于检测所述的鸡柔嫩艾美尔(E.tenella)相关的lncRNA BTN3A2表达量的特异性引物对。
[0013] 其中，鸡球虫抗性的指标包括鸡盲肠病变记分、血便记分、体增重、死亡率、粪便卵囊产量或抗球虫病指数中的一种或多种。
[0014] 本发明还提供了所述特异性引物对在制备检测lncRNA BTN3A2表达量的试剂或试剂盒中的应用。
[0015] 其中，所述应用为通过荧光定量PCR检测鸡盲肠组织中的lncRNA BTN3A2的表达量。
[0016] 本发明还提供了一种含有所述特异性引物对的荧光定量检测试剂盒。
[0017] 其中，所述荧光定量检测试剂盒还包括SYBR Premix Ex Taq II、ROX Reference Dye、内参基因β‑actin引物对和无酶双蒸水。
[0018] 其中，所述内参基因β‑actin引物对序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0019] 本发明还提供了所述的检测lncRNA BTN3A2表达量的试剂、特异性引物对或荧光定量检测试剂盒在筛选或开发鸡球虫抗性的辅助选择标记中的应用。
[0020] 本发明还提供了一种筛选或培育带有球虫病抗性的鸡的方法，其方法包括提高lncRNA BTN3A2表达量。
[0021] 本发明的原理：本发明通过提取鸡盲肠组织总RNA进行反转录，得到cDNA。利用扩增lncRNA BTN3A2的特异性上游引物、下游引物等组成的试剂盒进行荧光定量PCR，PCR反应‑ΔΔCT体系和扩增程序同常规的荧光定量PCR。采用2 方法对该lncRNA在个体中的表达水平进行判定，确定其球虫抗性的高低，新lncRNAs的发现将有利于阐明lncRNA在鸡抗球虫免疫反应中的调控机制。
[0022] 有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：本发明首次研究获得了与鸡柔嫩艾美尔(E.tenella)抗性相关的lncRNA，本发明提供的lncRNA BTN3A2可用于开发与鸡球虫抗性相关的辅助选择标记，同时用于研究非编码RNA在鸡抵抗寄生虫感染中的调控机制；并且同时基于该lncRNA进一步研究获得了检测该lncRNA表达量的特异性引物对，并进一步研发获得了检测试剂盒。本发明提供的检测试剂盒可用于检测lncRNA BTN3A2在鸡盲肠组织的表达量，检测方法简单快捷。本发明还可以利用该lncRNA BTN3A2的表达量筛选或培育球虫抗性较强的鸡。
附图说明
[0023] 图1是抗性和易感家系盲肠解剖病变图；
[0024] 图2是lncRNA BTN3A2及其靶基因调控图；
[0025] 图3是lncRNA BTN3A2调控子孢子侵染DF‑1细胞免疫反应；
[0026] 图4是JR和JS的qPCR验证结果。
具体实施方式
[0027] 下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明。
[0028] 实施例1基于RNA‑seq和mRNA联合分析获得影响鸡球虫抗性的lncRNA：lncRNA BTN3A2
[0029] 1.测序样本的采集
[0030] 随机选择体重接近的健康1日龄京海黄鸡雏鸡(购自江苏省海门京海黄鸡资源场)150只，在动物房无球虫的环境中分开饲养，期间自由采食无抗饲料和饮水。在18日龄时，所
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有雏鸡随机均分为两组，处理组100只和对照组50只。处理组每只鸡经口灌饲3.5×10个柔嫩艾美尔球虫(E.tenella)孢子化卵囊，对照组饲喂等量的生理盐水。感染后第4.5天，通过形态学、盲肠病变记分、血便记分、体增重、死亡率和粪便卵囊产量，从处理组中筛选出抗性(JR)和易感(JS)的京海黄鸡(通过国家审定的黄羽肉鸡新品种)两个家系雏鸡各3只(盲肠病变情况见图1，图中JC为对照组，JR组为抗性群体，JS为易感群体)，用于后续RNA‑seq测序。
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有雏鸡随机均分为两组，处理组100只和对照组50只。处理组每只鸡经口灌饲3.5×10个柔嫩艾美尔球虫(E.tenella)孢子化卵囊，对照组饲喂等量的生理盐水。感染后第4.5天，通过形态学、盲肠病变记分、血便记分、体增重、死亡率和粪便卵囊产量，从处理组中筛选出抗性(JR)和易感(JS)的京海黄鸡(通过国家审定的黄羽肉鸡新品种)两个家系雏鸡各3只(盲肠病变情况见图1，图中JC为对照组，JR组为抗性群体，JS为易感群体)，用于后续RNA‑seq测序。
[0031] 2.差异表达lncRNA的筛选和临近基因预测
[0032] 在对RNA‑seq结果进行质量控制后，将抗性和易感家系lncRNA表达水平差异P≤0.05、Fold change≥1倍定义为差异表达lncRNA。结果表明，在抗性和易感家系中共获得
263个差异表达lncRNA，其中包括lncRNA BTN3A2、TCONS_00025088、TCONS_00009847、TCONS_00036436、TCONS_00023075、TCONS_00025083、TCONS_00025084和TCONS_00025085等。其中，lncRNA BTN3A2在抗性和易感组盲肠组织中差异表达倍数较大。得到差异表达lncRNA之后，对差异表达lncRNA的临近基因进行预测和统计，对获得的临近基因进行Pathway分析，描述其功能。显著富集的信号通路如表1所示，均为与宿主免疫相关的重要通路。
263个差异表达lncRNA，其中包括lncRNA BTN3A2、TCONS_00025088、TCONS_00009847、TCONS_00036436、TCONS_00023075、TCONS_00025083、TCONS_00025084和TCONS_00025085等。其中，lncRNA BTN3A2在抗性和易感组盲肠组织中差异表达倍数较大。得到差异表达lncRNA之后，对差异表达lncRNA的临近基因进行预测和统计，对获得的临近基因进行Pathway分析，描述其功能。显著富集的信号通路如表1所示，均为与宿主免疫相关的重要通路。
[0033] 表1差异lncRNA的临近基因显著富集的与宿主免疫相关的通路
[0034]
[0035] 3.lncRNA和靶基因调控网络构建
[0036] 使用皮尔斯相关系数计算差异lncRNAs和mRNAs的共表达网络关系，利用Cytoscape(3.6.1)软件构建了调控网络，发现这lncRNA BTN3A2与SPP1，RORC，CD101，BTN3A2等多个免疫相关的基因具有显著的共表达关系，进一步分析发现lncRNA BTN3A2的靶基因占的比例最高，并处于核心位置(图2)，提示lncRNA BTN3A2具有重要的功能。
[0037] 4.lncRNA BTN3A2参与鸡球虫免疫
[0038] 为了进一步证实lncRNA BTN3A2对鸡球虫感染的免疫调控作用，本研究构建了lncRNA BTN3A2的过表达和干扰载体(过表达载体构建：先通过PCR法扩增目的lncRNA全长序列并引入酶切位点，PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，用BamHI和EcoRI对片段进行酶切，37℃酶切2小时，酶切体系如下：10×Buffer：5ul，上述扩增得到的模板42ul，BamHI和EcoRI各1.5ul。用BamHI和EcoRI对载体pcDNA3.1(+)进行酶切，37℃酶切2小时，酶切体系如下：10×Buffer：5ul，pcDNA 3.1(+)：5ug，BamHI和EcoRI各1.5ul，ddH2O补足50ul，用T4 DNA ligase连接双酶切得到的lncRNA BTN3A2目的片段和线性化的载体，
22℃连接2小时。将连接产物转化感受态细胞，摇菌，然后质粒抽提。干扰载体构建：设计lncRNA BTN3A2目的序列的小干扰RNA如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，siRNA序列在结合部位切割mRNA序列，导致基因沉默)，将过表达载体和干扰载体体外转染DF‑1细胞(购自中科院上海细胞库)球虫仔孢子非侵染和侵染模型，24h后检测免疫相关细胞因子的表达。
结果如图3所示，其中pcDNA3.1：空载质粒对照组；lncRNA BTN3A2：lncRNA BTN3A2过表达组；Spo‑pcDNA3.1：仔孢子侵染空载质粒对照组(通过DF‑1细胞转染pcDNA3.1空载，然后用球虫仔孢子(sporozoite)侵染，Spo是球虫仔孢子sporozoite的缩写，下同)；Spo‑lncRNA BTN3A2：仔孢子侵染过表达组(lncRNA BTN3A2过表达组中加入球虫仔孢子侵染)；SiR‑NC：
干扰对照组(指不含干扰序列的阴性对照组，下同)；SiR‑lncRNA BTN3A2：lncRNA BTN3A2干扰组；Spo‑SiR‑NC：仔孢子侵染干扰对照组；Spo‑SiR‑lncRNA BTN3A2：仔孢子侵染干扰组。
结果显示，过表达lncRNA BTN3A2能够抑制仔孢子侵染的DF‑1的炎症反应，lncRNA BTN3A2的干扰促进了球虫的炎症反应。结果证明了lncRNABTN3A2的升高能够调控鸡球虫子孢子侵染的免疫反应。
22℃连接2小时。将连接产物转化感受态细胞，摇菌，然后质粒抽提。干扰载体构建：设计lncRNA BTN3A2目的序列的小干扰RNA如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，siRNA序列在结合部位切割mRNA序列，导致基因沉默)，将过表达载体和干扰载体体外转染DF‑1细胞(购自中科院上海细胞库)球虫仔孢子非侵染和侵染模型，24h后检测免疫相关细胞因子的表达。
结果如图3所示，其中pcDNA3.1：空载质粒对照组；lncRNA BTN3A2：lncRNA BTN3A2过表达组；Spo‑pcDNA3.1：仔孢子侵染空载质粒对照组(通过DF‑1细胞转染pcDNA3.1空载，然后用球虫仔孢子(sporozoite)侵染，Spo是球虫仔孢子sporozoite的缩写，下同)；Spo‑lncRNA BTN3A2：仔孢子侵染过表达组(lncRNA BTN3A2过表达组中加入球虫仔孢子侵染)；SiR‑NC：
干扰对照组(指不含干扰序列的阴性对照组，下同)；SiR‑lncRNA BTN3A2：lncRNA BTN3A2干扰组；Spo‑SiR‑NC：仔孢子侵染干扰对照组；Spo‑SiR‑lncRNA BTN3A2：仔孢子侵染干扰组。
结果显示，过表达lncRNA BTN3A2能够抑制仔孢子侵染的DF‑1的炎症反应，lncRNA BTN3A2的干扰促进了球虫的炎症反应。结果证明了lncRNABTN3A2的升高能够调控鸡球虫子孢子侵染的免疫反应。
[0039] 5.qPCR对lncRNA BTN3A2进行验证
[0040] 分别利用抗性和易感组的鸡盲肠组织提取总RNA进行反转录，得到cDNA。根据上海欧易生物科技有限公司高通量测序获得的lncRNA BTN3A2核苷酸序列(Genebank序列号为：XM_025145936.1，种属：鸡；长度：1397bp)，设计特异性上、下游引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。采用包含特异引物的荧光定量试剂盒，按照常规反应体系和扩增程序对该lncRNA的表达量进行测定。
[0041] 该试剂盒由SYBR Premix Ex Taq II、ROX Reference Dye、正反向引物和无酶双蒸水组成。其中，所述的特异性引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，内参基因为β‑actin引物对序列(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)、SYBR Premix Ex Taq II、ROX Reference Dye和无酶双蒸水均来自大连宝生物科技股份有限公司的荧光定量试剂盒(SYBR Premix Ex Taq II kits)。
[0042]
[0043]
[0044] 荧光定量反应体系为20μl：SYBR Premix Ex Taq II 10.0μl；ROX Reference Dye II(50×)0.4μl；上游、下游引物各0.4μl；模板cDNA 2.0μl；ddH2O 7.2μl。荧光定量反应程序：94℃预变性30sec；95℃5sec，60℃34sec，40个循环；95℃15sec，60℃60sec，95℃15sec获得溶解曲线。
[0045] 运用2‑△△CT方法分析鸡柔嫩艾美尔(E.tenella)抗性和易感群体盲肠组织中lncRNA BTN3A2的相对表达量。由图4可知，qPCR显示抗性群体(JR)该lncRNA的表达量为易感群体(JS)的2倍左右，与RNA‑seq的测序结果趋势一致。
[0046] 本发明提供的试剂盒可用于检测lncRNA BTN3A2在鸡盲肠组织的表达量，检测方法简单快捷，本发明提供的lncRNA BTN3A2可用于开发鸡球虫病的辅助选择标记，同时用于研究lncRNA在鸡宿主免疫反应中的调控机制。