改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN202310259063.8
文献号 : CN115969961B
文献日 : 2023-05-12
发明人 : 董帅 , 陈雯菲
申请人 : 北京朗迪制药有限公司
摘要 :
本发明提出了改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物，将葛根、补骨脂、淫羊藿和女贞子经过沸水提取后，过滤，滤液干燥，得到中药水提取物，滤渣与骨胶原蛋白、碳源、氮源混合，制得中药‑蛋白肽培养基，接种活化的植物乳杆菌和唾液乳杆菌，发酵，产物经过磷酸化反应，然后加入钙离子溶液，制得磷酸化钙肽发酵复合物，与中药水提取物、维生素D1、维生素D3、双膦酸盐、降钙素、海参皂苷和人参皂苷Rg3混合均匀，制备成微胶囊，制得改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物。本发明制得的组合物含有丰富的小分子物质，吸收率较高，具有改善肠道通透性，改善骨密度，促进成骨细胞增殖分化和肠壁细胞吸收钙能力，改善骨质疏松的效果，应用前景广阔。
权利要求 :
1.一种改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物的制备方法，其特征在于，将葛根、补骨脂、淫羊藿和女贞子经过沸水提取后，过滤，滤液干燥，得到中药水提取物，滤渣与骨胶原蛋白、碳源、氮源混合，制得中药‑蛋白肽培养基，接种活化的植物乳杆菌和唾液乳杆菌，发酵，产物经过磷酸化反应，然后加入钙离子溶液，制得磷酸化钙肽发酵复合物，与中药水提取物、柠檬酸钙、维生素D1、维生素D3、双膦酸盐、降钙素、海参皂苷和人参皂苷Rg3混合均匀，制备成微胶囊，制得改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.益生菌的活化：将植物乳杆菌和唾液乳杆菌分别在高氏培养基中划线，活化培养，得到菌种种子液；
S2.中药水提取物的制备：将葛根、补骨脂、淫羊藿和女贞子洗净，干燥，粉碎后，得到中药粉，加水沸腾提取，过滤，合并滤液，浓缩，干燥，得到中药水提取物，滤渣留用；
S3.中药‑蛋白肽培养基的制备：将步骤S2中的滤渣、骨胶原蛋白、碳源、氮源混合，加入无菌水中，搅拌混合均匀，灭菌，得到中药‑蛋白肽培养基；
S4.发酵：将步骤S1中制得的植物乳杆菌和唾液乳杆菌菌种种子液接种至步骤S3制得的中药‑蛋白肽培养基中，发酵培养，得到发酵产物；
S5.磷酸化发酵产物的制备：向步骤S4制得的发酵产物中加入三偏磷酸钠，调节pH值，加热反应，制得磷酸化发酵产物；
S6.磷酸化钙肽发酵复合物的制备：将步骤S5制得的磷酸化发酵产物中加入钙离子溶液，搅拌反应，冷冻干燥，得到磷酸化钙肽发酵复合物；
S7.维生素D组合物的制备：将维生素D1、维生素D3混合均匀，制得维生素D组合物；
S8.破骨细胞抑制剂的制备：将双膦酸盐与降钙素混合均匀，制得破骨细胞抑制剂；
S9.活性组合物的制备：将海参皂苷和人参皂苷Rg3混合均匀，制得活性组合物；
S10.改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物的制备：将步骤S2制得的中药水提取物、步骤S6制得的磷酸化钙肽发酵复合物、柠檬酸钙、维生素D组合物、破骨细胞抑制剂和活性组合物加入水中，搅拌混合均匀，加入海藻酸钠、羧甲基纤维素钠和羧甲基茯苓多糖，搅拌溶解后得到水相；将水相加入食用油中，通过快速膜乳化，加入金属离子溶液，常温固化，过滤，冷冻干燥，得到改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述活化培养的条件为微缺氧条件下，36‑38℃，时间为18‑24h，转速为50‑80r/min，所述微缺氧条件为5‑7%CO2、7‑10%O2，余量为N2，其中%为体积百分比；步骤S2中所述葛根、补骨脂、淫羊藿和女贞子的质量比为
5‑10:3‑5:5‑7:1‑3，所述中药粉和水的固液比为1:5‑10g/mL，所述沸腾提取的次数为2‑3次，时间为3‑5h。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述滤渣、骨胶原蛋白、碳源、氮源和无菌水的质量比为10‑15:7‑10:5‑12:4‑7:150‑200；步骤S4中所述植物乳杆菌和唾液乳杆菌菌种种子液的接种量分别为3‑5%和2‑4%，所述发酵培养的条件为微缺氧条件下，36‑38℃，时间为48‑72h，转速为50‑70r/min，所述微缺氧条件为5‑7%CO2、7‑10%O2，余量为N2，其中%为体积百分比。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述发酵产物、三偏磷酸钠的质量比为100:7‑12，所述调节pH值为8‑9，所述加热反应的温度为35‑45℃，时间为50‑
70min；步骤S6中所述磷酸化发酵产物和钙离子溶液的质量比为10：5‑7，所述钙离子溶液为
40‑50wt%的氯化钙溶液，所述搅拌反应的时间为30‑50min。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S7中所述维生素D1、维生素D3的质量比为1‑3:5；步骤S8中所述双膦酸盐与降钙素的质量比为3‑5:2；步骤S9中所述海参皂苷和人参皂苷Rg3的质量比为4‑7:5。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S10中所述中药水提取物、磷酸化钙肽发酵复合物、柠檬酸钙、维生素D组合物、破骨细胞抑制剂、活性组合物、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠和羧甲基茯苓多糖的质量比为4‑6:10:50‑70:0.0001‑0.001:0.01‑0.02:0.2‑
0.4:10‑12:5‑7:4‑6，所述水相和食用油的质量比为3‑5:5‑7，所述快速膜的孔径在1‑3mm之间，所述金属离子溶液为含有3‑5wt%的氯化钙、氯化铁或者氯化铝溶液，所述常温固化的时间为20‑30min。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1.益生菌的活化：将植物乳杆菌和唾液乳杆菌分别在高氏培养基中划线，微缺氧条件下，36‑38℃，50‑80r/min，活化培养18‑24h，得到菌种种子液；
所述微缺氧条件为5‑7%CO2、7‑10%O2，余量为N2，其中%为体积百分比；
S2.中药水提取物的制备：将5‑10重量份葛根、3‑5重量份补骨脂、5‑7重量份淫羊藿和
1‑3重量份女贞子洗净，干燥，粉碎后，得到中药粉，加水沸腾提取2‑3次，每次3‑5h，所述中药粉和水的固液比为1:5‑10g/mL，过滤，合并滤液，浓缩，干燥，得到中药水提取物，滤渣留用；
S3.中药‑蛋白肽培养基的制备：将10‑15重量份步骤S2中的滤渣、7‑10重量份骨胶原蛋白、5‑12重量份碳源、4‑7重量份氮源混合，加入150‑200无菌水中，搅拌混合均匀，灭菌，得到中药‑蛋白肽培养基；
S4.发酵：将步骤S1中制得的植物乳杆菌和唾液乳杆菌菌种种子液接种至步骤S3制得的中药‑蛋白肽培养基中，接种量分别为3‑5%和2‑4%，微缺氧条件下，36‑38℃，50‑70r/min，发酵培养48‑72h，得到发酵产物；
所述微缺氧条件为5‑7%CO2、7‑10%O2，余量为N2，其中%为体积百分比；
S5.磷酸化发酵产物的制备：向100重量份步骤S4制得的发酵产物中加入7‑12重量份三偏磷酸钠，调节pH值为8‑9，加热至35‑45℃，反应50‑70min，制得磷酸化发酵产物；
S6.磷酸化钙肽发酵复合物的制备：将10重量份步骤S5制得的磷酸化发酵产物中加入
5‑7重量份40‑50wt%的氯化钙溶液，搅拌反应30‑50min，冷冻干燥，得到磷酸化钙肽发酵复合物；
S7.维生素D组合物的制备：将1‑3重量份维生素D1、5重量份维生素D3混合均匀，制得维生素D组合物；
S8.破骨细胞抑制剂的制备：将3‑5重量份双膦酸盐与2重量份降钙素混合均匀，制得破骨细胞抑制剂；
S9.活性组合物的制备：将4‑7重量份海参皂苷和5重量份人参皂苷Rg3混合均匀，制得活性组合物；
S10.改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物的制备：将4‑6重量份步骤S2制得的中药水提取物、10重量份步骤S6制得的磷酸化钙肽发酵复合物、50‑70重量份柠檬酸钙、0.0001‑
0.001重量份步骤S7制得的维生素D组合物、0.01‑0.02重量份步骤S8制得的破骨细胞抑制剂和0.2‑0.4重量份步骤S9制得的活性组合物加入水中，搅拌混合均匀，加入10‑12重量份海藻酸钠、5‑7重量份羧甲基纤维素钠和4‑6重量份羧甲基茯苓多糖，搅拌溶解后得到水相；
将30‑50重量份水相加入50‑70重量份食用油中，通过孔径在1‑3mm之间的快速膜乳化，加入
10‑20重量份含有3‑5wt%的氯化钙、氯化铁或者氯化铝溶液，常温固化20‑30min，过滤，冷冻干燥，得到改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物。
9.一种如权利要求1‑8任一项所述的制备方法制得的改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物。
10.一种如权利要求9所述的改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物在制备治疗及预防骨质疏松症的产品中的应用。
说明书 :
改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 骨骼中有机物的70％‑80％是胶原蛋白，骨骼生成时，首先必须合成充足的胶原蛋白纤维来组成骨骼的框架。因此，有人称胶原蛋白为“骨中之骨”。胶原蛋白的流失或缺乏会引起骨质疏松等疾病。筋腱—构成骨骼与肌肉相联的筋腱的成分80％是胶原蛋白，缺乏胶原蛋白会导致筋腱与肌肉的衰弱。
[0003] 随着年龄的增长，胶原蛋白流失及身体各方面营养供给不足，软骨的营养供给不足会导致骨骼中的无机物增多，进而导致骨骼弹性和韧性降低，关节软骨不可避免的发生退化和磨损，而关节一直处于运动状态，导致软骨的磨损越来越严重，两块骨直接接触，引发炎症，最后导致骨关节疾病。而骨关节炎多发于中老年人，致残率非常高，被称为“不死的癌症”。且据资料显示，随着人老龄化程度的逐渐加大，骨质疏松逐渐成为人类健康生活的一大关键因素。另外，骨折也是骨损伤的重要因素之一，骨折是指骨头或骨头的结构完全或部分断裂，多见于儿童及老年人，中青年也时有发生。
[0004] 传统的骨关节临床用药主要以止痛+非甾体类抗炎药结合使用为主，但过多的使用药物治疗存在一系列的副作用，不仅会加重肝肾代谢负担，还会产生药物依赖效应，存在较大的健康安全隐患；还有关节置换、修复性治疗、基础治疗、运动支持等治疗方法，但有费用昂贵、治标不治本或疗效不明确等缺陷。
[0005] 而骨折时通常伴随着重要血管损伤、周围组织损伤以及周围神经损伤，骨折的愈合一般分为肉芽组织修复期、原始骨痂形成期、成熟骨板期和塑形期，肉芽组织修复期。肉芽组织修复期是骨折后骨的正常结构和周围的软组织破坏，形成血肿，血肿的清除、机化，形成肉芽组织，使骨折断端初步连接在一起，这个过程在骨折后两到三个星期内完成。原始骨痂形成期也就是骨折后新骨形成。开始于骨折后七到十天延续到骨折完全愈合。成熟骨板期是将原始的骨痂被改造成坚强有力的板状骨，这个过程需要8到12个星期。塑形期为骨折愈合过程中塑形，使骨折断端愈合的骨骼结实有力，骨折线消失恢复以前的正常结构，通常要几个月甚至几年。骨折修复大多需卧床，不仅神经和肌肉的活动力大大降低，且血液运行不畅，不利于骨折愈合，修复时间过长，还可能会出现痔疮、下肢深静脉血栓、关节僵硬等并发症。
[0006] 而随着人们生活水平的提高及营养保健意识日益增强，人们更追求有利于自身健康的食品，更接受“食补、食疗”的养生方式，食疗养生逐渐成为人们关注的热点。通过食补养生达到保健目的以及通过食补促进康健效果、缩减康复时间的方法逐渐被大众所接受和尝试。
[0007] 骨肽即骨胶原蛋白肽，是以骨明胶为原料，应用酶解工艺，通过控制反应条件所制备得到的骨胶原蛋白产品。胶原蛋白能有效抑制骨骼、软骨肉胶原蛋白的分解，并加速骨密度增加，可预防及治疗退化性关节炎、快速消炎、止痛、消肿、逐渐修复关节软骨及促进新骨形成，可有效预防退化性关节炎，并对关节炎患者具保护功能，能用于帮助关节炎病人的治疗，并有效改善关节疼痛，加速断骨修复、骨折的复原。现有实际生产中也有了骨肽片、骨肽注射液和骨肽饮料等产品，但现有的骨肽饮料产品在吸收速率、人体利用率以及效果等方面都还有很大的优化空间。
[0008] 中国专利申请CN107630061A公开了一种牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，其包括以下步骤：步骤一：将冷冻牦牛骨原料经过优选和清理后通过硬质骨破碎机破碎制得牦牛骨破碎料；步骤二：将所述牦牛骨破碎料进行清洗去杂；步骤三：将经过清洗去杂的所述牦牛骨破碎料采用乙醚脱脂处理后，再使用EDTA或HCl的方法进行脱钙处理得到脱脂脱钙牦牛骨；步骤四：将脱脂脱钙牦牛骨使用乙酸进行溶解并加入胃蛋白酶进行酶解处理；步骤五：将酶解后所得上清液加入NaCl溶液进行盐析；步骤六：将盐析后产物进行离心得到沉淀物；步骤七：将沉淀物冻干得到牦牛骨Ⅰ型胶原蛋白成品。
[0009] 中国专利CN105753972B公开了一种牦牛骨胶原多肽螯合钙与骨多肽联产的方法，其包括如下步骤：步骤一、从牦牛骨中提取出分子量2KDa‑4KDa的胶原多肽和其他胶原多肽；步骤二、将步骤一中得到的分子量2KDa‑4KDa的胶原多肽与Ca2+进行螯合以得到牦牛骨胶原多肽螯合钙，螯合中，温度为50‑55℃，pH值为6.8‑7.2，螯合时间为1.5‑2小时；和步骤三、将步骤一中得到的其他胶原多肽浓缩得到骨多肽。
[0010] 中国专利CN103783254B公开了一种牦牛骨胶原蛋白肽的制备方法，工艺过程包括原料前处理，明胶提取，分离胶原蛋白提取液，复合酶解，灭酶灭菌，分离肽液，脱色脱腥，浓缩干燥。其复合酶解时所采用的复合酶是由蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶组成。其优点是，明胶提取过程简单，利用混合液的流动，将油脂和明胶完全分离；酶解温度为48‑52℃，时间为4‑6小时。
[0011] 中国专利申请CN102229971A公开了一种用牦牛鲜骨制备胶原蛋白肽的方法，所述的方法包括下列步骤：1)酶解：将去髓牦牛鲜骨粗碎，加水分散，再加入相应量的酶和缓冲溶液，恒温搅拌酶解，用纱布过滤，得一次酶解液；2)二次酶解：在一次酶解液中加入另一种酶，恒温搅拌酶解，升温使酶失活，得二次酶解液；3)过滤：在二次酶解液中加絮凝剂，搅拌沉淀杂质，滤布过滤，得滤液；4)超滤：将滤液通过超滤膜除杂，滤液略微浓缩，得浓缩液；5)喷雾干燥：将浓缩液喷雾干燥，即得产品。
[0012] 中国专利CN105018554B公开了一种小分子牛骨胶原肽及其制备方法，所述制备方法依次包括以下步骤：粉碎、提取分离、酶解、复合过滤、浓缩和干燥；所述酶解过程为：在牛骨胶原蛋白提取液中加入骨胶原蛋白酶进行一次酶解；一次酶解后，用混合酸调节一次酶解液的pH值至6‑7，然后加入脯氨酸蛋白酶进行二次酶解，二次酶解时间为2h‑4h，脯氨酸蛋白酶的加入量为牛骨胶原蛋白质量的0.1％‑0.3％。
[0013] 中国专利申请CN108208851A公开了一种五元复合小分子胶原蛋白肽粉，以重量百分比计，由以下组份制成：牛骨胶原蛋白肽10％‑50％，鱼胶原蛋白肽10％‑50％，核桃肽10％‑30％，小麦肽5％‑20％，玉米肽5％‑20％，通过采用牛骨胶原蛋白肽、深海鳕鱼皮胶原蛋白肽、核桃肽、小麦肽、玉米肽五种胶原蛋白肽粉，制得五元复合小分子胶原蛋白肽粉。
CN107648205A公开了一种促进伤口愈合的胶原肽敷料，其各成分的质量百分比如下所示：
牛骨胶原低聚肽50‑70％，改性几丁聚糖溶液0.5‑5％，海参寡肽或天蚕素B5‑20％或1‑5％，人参寡肽1‑5％，保湿剂0‑20％，余量为溶剂。
CN107648205A公开了一种促进伤口愈合的胶原肽敷料，其各成分的质量百分比如下所示：
牛骨胶原低聚肽50‑70％，改性几丁聚糖溶液0.5‑5％，海参寡肽或天蚕素B5‑20％或1‑5％，人参寡肽1‑5％，保湿剂0‑20％，余量为溶剂。
[0014] “牛骨营养品质评价与牦牛骨胶原蛋白肽功效研究”，贾伟，《甘肃农业大学》，2017，采集我国4个地域牦牛和7个主要地域牛种的肱骨、股骨、脊骨、肋骨四个部位为样本进行营养组分检测,使用主成分、聚类、判别分析方法对牛骨样本进行营养品质评价，以甘南牦牛骨为原料，研究了酸法制备牦牛骨胶原蛋白和酶解制得不同分子量牦牛骨胶原多肽的结构及组成，并以人成骨细胞为体外模型评价了牦牛骨胶原多肽的营养功效。
[0015] “胶原蛋白肽含药血清促进成骨细胞增殖和分化”，刘俊丽等，《中国骨质疏松杂志》，2018(6)，阐明了牛骨CP化合物血清对成骨细胞增殖与分化的影响，通过制备牛骨CP化合物大鼠血清，牛骨CP化合物处理的实验组和未经处理的对照组大鼠血清浓度为3％、6％、10％,加到无血清的DMEM溶液中，用MTT法和流式细胞术分别检测牛骨CP血清对MC3T3‑E1细胞增殖和细胞周期的影响。
[0016] 然而，在现有的牦牛骨胶原蛋白肽制备技术中，由牦牛骨制备胶原蛋白肽多是沿用或照搬普通牛骨的提取和酶解方法，忽略了牦牛骨和普通牛骨之间的差异，例如由于牦牛的特殊生长条件，牦牛骨的钙含量要明显高于普通的饲养牛并且骨质结合强度明显较高，用于普通饲养牛的脱矿物剂就难以有效脱除牦牛骨中的钙。
发明内容
[0017] 本发明的目的在于提出改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物及其制备方法和应用，制备方法简单，原料来源广，具有改善肠道通透性，减轻肠道炎症，改善骨密度，促进成骨细胞增殖分化，降低骨吸收，不断形成新骨，促进肠壁细胞吸收钙能力，改善骨质疏松的效果，具有广阔的应用前景。
[0018] 本发明的技术方案是这样实现的：
[0019] 本发明提供一种改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物的制备方法，将葛根、补骨脂、淫羊藿和女贞子经过沸水提取后，过滤，滤液干燥，得到中药水提取物，滤渣与骨胶原蛋白、碳源、氮源混合，制得中药‑蛋白肽培养基，接种活化的植物乳杆菌和唾液乳杆菌，发酵，产物经过磷酸化反应，然后加入钙离子溶液，制得磷酸化钙肽发酵复合物，与中药水提取物、维生素D1、维生素D3、双膦酸盐、降钙素、海参皂苷和人参皂苷Rg3混合均匀，制备成微胶囊，制得改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物。
[0020] 作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：
[0021] S1.益生菌的活化：将植物乳杆菌和唾液乳杆菌分别在高氏培养基中划线，活化培养，得到菌种种子液；
[0022] S2.中药水提取物的制备：将葛根、补骨脂、淫羊藿和女贞子洗净，干燥，粉碎后，得到中药粉，加水沸腾提取，过滤，合并滤液，浓缩，干燥，得到中药水提取物，滤渣留用；
[0023] S3.中药‑蛋白肽培养基的制备：将步骤S2中的滤渣、骨胶原蛋白、碳源、氮源混合，加入无菌水中，搅拌混合均匀，灭菌，得到中药‑蛋白肽培养基；
[0024] S4.发酵：将步骤S1中制得的植物乳杆菌和唾液乳杆菌菌种种子液接种至步骤S3制得的中药‑蛋白肽培养基中，发酵培养，得到发酵产物；
[0025] S5.磷酸化发酵产物的制备：向步骤S4制得的发酵产物中加入三偏磷酸钠，调节pH值，加热反应，制得磷酸化发酵产物；
[0026] S6.磷酸化钙肽发酵复合物的制备：将步骤S5制得的磷酸化发酵产物中加入钙离子溶液，搅拌反应，冷冻干燥，得到磷酸化钙肽发酵复合物；
[0027] S7.维生素D组合物的制备：将维生素D1、维生素D3混合均匀，制得维生素D组合物；
[0028] S8.破骨细胞抑制剂的制备：将双膦酸盐与降钙素混合均匀，制得破骨细胞抑制剂；
[0029] S9.活性组合物的制备：将海参皂苷和人参皂苷Rg3混合均匀，制得活性组合物；
[0030] S10.改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物的制备：将步骤S2制得的中药水提取物、步骤S6制得的磷酸化钙肽发酵复合物、柠檬酸钙、维生素D组合物、破骨细胞抑制剂和活性组合物加入水中，搅拌混合均匀，加入海藻酸钠、羧甲基纤维素钠和羧甲基茯苓多糖，搅拌溶解后得到水相；将水相加入食用油中，通过快速膜乳化，加入金属离子溶液，常温固化，过滤，冷冻干燥，得到改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物。
[0031] 作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述活化培养的条件为微缺氧条件下，36‑38℃，时间为18‑24h，转速为50‑80r/min，所述微缺氧条件为5‑7%CO2、7‑10%O2，余量为N2，其中%为体积百分比；步骤S2中所述葛根、补骨脂、淫羊藿和女贞子的质量比为5‑10:3‑5:5‑7:1‑3，所述中药粉和水的固液比为1:5‑10g/mL，所述沸腾提取的次数为2‑3次，时间为3‑5h。
[0032] 作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述滤渣、骨胶原蛋白、碳源、氮源和无菌水的质量比为10‑15:7‑10:5‑12:4‑7:150‑200；步骤S4中所述植物乳杆菌和唾液乳杆菌菌种种子液的接种量分别为3‑5%和2‑4%，所述发酵培养的条件为微缺氧条件下，36‑38℃，时间为48‑72h，转速为50‑70r/min，所述微缺氧条件为5‑7%CO2、7‑10%O2，余量为N2，其中%为体积百分比。
[0033] 作为本发明的进一步改进，步骤S5中所述发酵产物、三偏磷酸钠的质量比为100:7‑12，所述调节pH值为8‑9，所述加热反应的温度为35‑45℃，时间为50‑70min；步骤S6中所述磷酸化发酵产物和钙离子溶液的质量比为10：5‑7，所述钙离子溶液为40‑50wt%的氯化钙溶液，所述搅拌反应的时间为30‑50min。
[0034] 作为本发明的进一步改进，步骤S7中所述维生素D1、维生素D3的质量比为1‑3:5；步骤S8中所述双膦酸盐与降钙素的质量比为3‑5:2；步骤S9中所述海参皂苷和人参皂苷Rg3的质量比为4‑7:5。
[0035] 作为本发明的进一步改进，步骤S10中所述中药水提取物、磷酸化钙肽发酵复合物、柠檬酸钙、维生素D组合物、破骨细胞抑制剂、活性组合物、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠和羧甲基茯苓多糖的质量比为4‑6:10:50‑70:0.0001‑0.001:0.01‑0.02:0.2‑0.4:10‑12:5‑7:4‑6，所述水相和食用油的质量比为3‑5:5‑7，所述快速膜的孔径在1‑3mm之间，所述金属离子溶液为含有3‑5wt%的氯化钙、氯化铁或者氯化铝溶液，所述常温固化的时间为20‑
30min。
30min。
[0036] 作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：
[0037] S1.益生菌的活化：将植物乳杆菌和唾液乳杆菌分别在高氏培养基中划线，微缺氧条件下，36‑38℃，50‑80r/min，活化培养18‑24h，得到菌种种子液；
[0038] 所述微缺氧条件为5‑7%CO2、7‑10%O2，余量为N2，其中%为体积百分比；
[0039] S2.中药水提取物的制备：将5‑10重量份葛根、3‑5重量份补骨脂、5‑7重量份淫羊藿和1‑3重量份女贞子洗净，干燥，粉碎后，得到中药粉，加水沸腾提取2‑3次，每次3‑5h，所述中药粉和水的固液比为1:5‑10g/mL，过滤，合并滤液，浓缩，干燥，得到中药水提取物，滤渣留用；
[0040] S3.中药‑蛋白肽培养基的制备：将10‑15重量份步骤S2中的滤渣、7‑10重量份骨胶原蛋白、5‑12重量份碳源、4‑7重量份氮源混合，加入150‑200无菌水中，搅拌混合均匀，灭菌，得到中药‑蛋白肽培养基；
[0041] 优选地，所述碳源选自葡萄糖、麦芽糖、异麦芽糖、果糖、蔗糖、阿拉伯糖、低聚果糖、低聚木糖、琼脂中的至少一种，所述氮源选自蛋白胨、鱼粉、尿素、氨基酸、硝酸盐、铵盐中的至少一种，所述硝酸盐选自硝酸钠、硝酸钾、硝酸镁、硝酸铝、硝酸锌、硝酸铁、硝酸铜、硝酸锰中的至少一种，所述铵盐选自氯化铵、硫酸铵、硝酸铵中的至少一种；所述氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甲氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸中的至少一种。
[0042] S4.发酵：将步骤S1中制得的植物乳杆菌和唾液乳杆菌菌种种子液接种至步骤S3制得的中药‑蛋白肽培养基中，接种量分别为3‑5%和2‑4%，微缺氧条件下，36‑38℃，50‑70r/min，发酵培养48‑72h，得到发酵产物；
[0043] 所述微缺氧条件为5‑7%CO2、7‑10%O2，余量为N2，其中%为体积百分比；
[0044] S5.磷酸化发酵产物的制备：向100重量份步骤S4制得的发酵产物中加入7‑12重量份三偏磷酸钠，调节pH值为8‑9，加热至35‑45℃，反应50‑70min，制得磷酸化发酵产物；
[0045] S6.磷酸化钙肽发酵复合物的制备：将10重量份步骤S5制得的磷酸化发酵产物中加入5‑7重量份40‑50wt%的氯化钙溶液，搅拌反应30‑50min，冷冻干燥，得到磷酸化钙肽发酵复合物；
[0046] S7.维生素D组合物的制备：将1‑3重量份维生素D1、5重量份维生素D3混合均匀，制得维生素D组合物；
[0047] S8.破骨细胞抑制剂的制备：将3‑5重量份双膦酸盐与2重量份降钙素混合均匀，制得破骨细胞抑制剂；
[0048] 优选地，所述双膦酸盐选自依替膦酸钠、氯膦酸钠、帕米膦酸钠、替鲁膦酸钠、阿仑膦酸钠、奈立膦酸钠、奥帕膦酸钠、利塞膦酸钠和伊班膦酸钠、唑来膦酸中的至少一种。
[0049] S9.活性组合物的制备：将4‑7重量份海参皂苷和5重量份人参皂苷Rg3混合均匀，制得活性组合物；
[0050] S10.改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物的制备：将4‑6重量份步骤S2制得的中药水提取物、10重量份步骤S6制得的磷酸化钙肽发酵复合物、50‑70重量份柠檬酸钙、0.0001‑0.001重量份步骤S7制得的维生素D组合物、0.01‑0.02重量份步骤S8制得的破骨细胞抑制剂和0.2‑0.4重量份步骤S9制得的活性组合物加入水中，搅拌混合均匀，加入10‑12重量份海藻酸钠、5‑7重量份羧甲基纤维素钠和4‑6重量份羧甲基茯苓多糖，搅拌溶解后得到水相；
将30‑50重量份水相加入50‑70重量份食用油中，通过孔径在1‑3mm之间的快速膜乳化，加入
10‑20重量份含有3‑5wt%的氯化钙、氯化铁或者氯化铝溶液，常温固化20‑30min，过滤，冷冻干燥，得到改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物。
将30‑50重量份水相加入50‑70重量份食用油中，通过孔径在1‑3mm之间的快速膜乳化，加入
10‑20重量份含有3‑5wt%的氯化钙、氯化铁或者氯化铝溶液，常温固化20‑30min，过滤，冷冻干燥，得到改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物。
[0051] 优选地，所述食用油选自花生油、玉米油、大豆油、菜籽油、芝麻油、亚麻籽油、橄榄油、葵花籽油中的至少一种。
[0052] 本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物。
[0053] 本发明进一步保护一种上述的改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物在制备治疗及预防骨质疏松症的产品中的应用。
[0054] 本发明具有如下有益效果：
[0055] 老年患者身体出现缺钙体征，并不是因为摄入的食品中钙的含量少了，其根本在于机体对钙的吸收能力下降，因此，单纯的补钙治疗，往往难以取得满意的效果，老年性骨质疏松症主要病发人群为老年全身性功能减退患者，其随着年龄的增长，体内各脏器的新陈代谢缓慢或异常，致使肾脏羟化酶的合成及分泌减少，且低代谢状态会降低酶活性，这不利于活性维生素D1及维生素D3的生成，进而导致肠壁细胞吸收钙能力降低，致使人体内钙吸收不足，因此，本发明通过外加补充维生素D1和维生素D3的混合物，起到很好的促进肠壁细胞吸收钙能力，两者的添加具有协同增效的作用。
[0056] 本发明破骨细胞抑制剂包括双膦酸盐与降钙素，它们能有效阻断破骨细胞的激活，诱导破骨细胞发生凋亡，而降钙素则能直接抑制破骨细胞生理作用，二者均可使骨质分解与流失变慢，并充分刺激新骨生成，从而有效的缓解老年骨质疏松症的发生，具有协同增效的作用。
[0057] 钙剂与维生素D是典型的骨矿化促进药物，前者是构成骨质的重要组成部分，后者则能直接促进钙磷吸收，并将钙磷成分从骨质中游离至外周血中，令血钙、血磷回归正常值，从而令矿化作用获得转归，不断形成新骨，因此，可以大大缓解骨质疏松症病情。因此，本发明在补充维生素D的同时，还补充了大量的有机钙（柠檬酸钙及磷酸化钙肽发酵复合物）起到了很好的相互促进作用。
[0058] 蛋白质磷酸化是提高蛋白质功能的有效手段，磷酸基的导入能够促进生物体对钙的吸收，这是因为蛋白质氨基酸的侧链加入了一个带有强负电的磷酸基团，易发生酯化反应，从而改变了蛋白质的构型、活性及与其他分子相互作用力。磷酸化也可以增强磷酸钙的溶解性，促进生物体对钙的吸收。本发明制得的磷酸化发酵产物可以明显促进小肠对钙离子的吸收，并促进骨骼钙化，其机理是磷酸化发酵产物中，磷酸化蛋白肽的磷酸丝氨酸残基能够与钙离子结合，形成可溶性的复合物，阻止小肠内钙的沉淀，同时，制得的磷酸化蛋白肽能增加多肽与金属离子的螯合位点，提高金属离子的结合活性，并提高磷酸化蛋白肽的功能特性。
[0059] 进一步地，本发明在制得的磷酸化发酵产物的基础上，加入钙离子溶液，制得磷酸化蛋白肽螯合钙，使得其中的磷酸化蛋白肽与钙离子以配位共价键结合而形成的产物，具有吸收快，营养性强，生物效价高，抗氧化、抗菌、降血脂、免疫调节等活性。钙离子的结合位点主要是天冬氨酸和谷氨酸的羧基。磷酸化蛋白肽还与钙离子结合后形成特定的空间结构，从而促进钙的吸收。当钙离子和小肽螯合后，补钙效果会更好，这是由于钙离子在小肠内以螯合态存在，加速小肠对肽的吸收，故磷酸化蛋白肽螯合钙的补钙效果更佳。
[0060] 本发明制得的活性组合物包括海参皂苷和人参皂苷Rg3，两者具有相似的结构，具有促进成骨细胞增殖分化，降低骨吸收，改善骨质疏松的效果。海参皂苷还能够降低尿钙、尿磷浓度，减少骨矿流失，增强骨密度和骨矿化沉积，具有改善骨质疏松症的作用，两者的添加具有协同增效的作用。
[0061] 雌激素能抑制抗骨吸收、促进骨形成，有明显的骨保护作用，本发明中药组合物中添加的葛根经过水提取物后，含有丰富的葛根异黄酮由于异黄酮类化合物的雌激素作用，能有效预防骨质疏松症。葛根素也可以通过提高成骨细胞上雌激素受体水平，使较少量的雌激素发挥更大的生理效应。补骨脂中含有丰富的异补骨脂素，可促进成骨细胞的增殖，抑制成骨细胞的凋亡，促进体外培养的骨髓间充质干细胞的增殖与分化，减少钙盐沉积，具有很好的抗骨质疏松的作用。葛根性甘、辛、平，表证发热，项背强痛，阴虚消渴；淫羊藿性温味辛甘，可补益肾阳、强劲筋骨；补骨脂可填精益髓，滋肾健脾；女贞子能益气活血、补肝肾，强腰膝；诸药合用共奏补益脾肾、强筋壮骨、活血通络，治疗骨质疏松症可为标本兼顾。
[0062] 经过益生菌包括植物乳杆菌和唾液乳杆菌发酵，其中植物乳杆菌能够减少炎症因子如TNF‑α和IL‑1b的表达，增加具有抑制溶骨作用的物质表达，减少骨量丢失；唾液乳杆菌能够通过促进肠上皮细胞吸收钙离子实现增加钙离子的吸收。两者的协同作用下，还可以改善肠道通透性，减轻肠道炎症，改善骨密度。
[0063] 通过海藻酸钠、羧甲基纤维素钠和羧甲基茯苓多糖混合包埋，金属离子交联后，形成的微胶囊壳层具有较好的pH响应性，在pH较低的酸性条件下能够保持较为完整的形态，从而保障益生菌、磷酸化钙肽发酵复合物等活性成分不被胃酸消化、失活，能够靶向将活性成分输送至肠道，微胶囊形态破裂后，壳材还可以作为一种益生元物质，促进益生菌的生长和定植，从而促进益生菌发挥作用，促进其他活性成分被小肠的吸收。
[0064] 本发明制得的改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物，制备方法简单，原料来源广，具有改善肠道通透性，减轻肠道炎症，改善骨密度，促进成骨细胞增殖分化，降低骨吸收，不断形成新骨，促进肠壁细胞吸收钙能力，改善骨质疏松的效果，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0065] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0066] 图1为本发明测试例1中存活率的对比图；
[0067] 图2为本发明测试例1中释放率的对比图。
具体实施方式
[0068] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0069] 植物乳杆菌，150亿cfu/g，购于潍坊瑞辰生物科技有限公司；唾液乳杆菌，350亿cfu/g，购于广州汇健生物科技有限公司；骨胶原蛋白，纯度>99%，购于江苏采薇生物科技有限公司；羧甲基茯苓多糖，纯度>98%，购于湖南补天药业有限公司。
[0070] 实施例1
[0071] 本实施例提供一种改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物的制备方法，具体包括以下步骤：
[0072] S1.益生菌的活化：将植物乳杆菌和唾液乳杆菌分别在高氏培养基中划线，微缺氧条件下，36℃，50r/min，活化培养18h，得到菌种种子液；
[0073] 所述微缺氧条件为5%CO2、7%O2，余量为N2，其中%为体积百分比；
[0074] S2.中药水提取物的制备：将5重量份葛根、3重量份补骨脂、5重量份淫羊藿和1重量份女贞子洗净，干燥，粉碎后，得到中药粉，加水沸腾提取2次，每次3h，所述中药粉和水的固液比为1:5g/mL，过滤，合并滤液，浓缩，105℃干燥2h，得到中药水提取物，滤渣留用；
[0075] S3.中药‑蛋白肽培养基的制备：将10重量份步骤S2中的滤渣、7重量份骨胶原蛋白、2重量份果糖、2重量份蔗糖、1重量份阿拉伯糖、3重量份鱼粉、1重量份硝酸铵混合，加入150无菌水中，搅拌混合15min，紫外线灭菌，得到中药‑蛋白肽培养基；
[0076] S4.发酵：将步骤S1中制得的植物乳杆菌和唾液乳杆菌菌种种子液接种至步骤S3制得的中药‑蛋白肽培养基中，接种量分别为3%和2%，微缺氧条件下，36℃，50r/min，发酵培养48h，得到发酵产物；
[0077] 所述微缺氧条件为5%CO2、7%O2，余量为N2，其中%为体积百分比；
[0078] S5.磷酸化发酵产物的制备：向100重量份步骤S4制得的发酵产物中加入7重量份三偏磷酸钠，调节pH值为8，加热至35℃，反应50min，制得磷酸化发酵产物；
[0079] S6.磷酸化钙肽发酵复合物的制备：将10重量份步骤S5制得的磷酸化发酵产物中加入5重量份40wt%的氯化钙溶液，搅拌反应30min，冷冻干燥，得到磷酸化钙肽发酵复合物；
[0080] S7.维生素D组合物的制备：将1重量份维生素D1、5重量份维生素D3搅拌混合15min，制得维生素D组合物；
[0081] S8.破骨细胞抑制剂的制备：将3重量份替鲁膦酸钠与2重量份降钙素搅拌混合15min，制得破骨细胞抑制剂；
[0082] S9.活性组合物的制备：将4重量份海参皂苷和5重量份人参皂苷Rg3搅拌混合15min，制得活性组合物；
[0083] S10.改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物的制备：将4重量份步骤S2制得的中药水提取物、10重量份步骤S6制得的磷酸化钙肽发酵复合物、50重量份柠檬酸钙、0.0001重量份步骤S7制得的维生素D组合物、0.01重量份步骤S8制得的破骨细胞抑制剂和0.2重量份步骤S9制得的活性组合物加入水中，搅拌混合20min，加入10重量份海藻酸钠、5重量份羧甲基纤维素钠和4重量份羧甲基茯苓多糖，搅拌溶解后得到水相；将30重量份水相加入50重量份花生油中，通过孔径为1mm的快速膜乳化，加入10重量份含有3wt%的氯化钙、氯化铁或者氯化铝溶液，常温固化20min，过滤，冷冻干燥，得到改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物。
[0084] 实施例2
[0085] 本实施例提供一种改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物的制备方法，具体包括以下步骤：
[0086] S1.益生菌的活化：将植物乳杆菌和唾液乳杆菌分别在高氏培养基中划线，微缺氧条件下，38℃，80r/min，活化培养24h，得到菌种种子液；
[0087] 所述微缺氧条件为7%CO2、10%O2，余量为N2，其中%为体积百分比；
[0088] S2.中药水提取物的制备：将10重量份葛根、5重量份补骨脂、7重量份淫羊藿和3重量份女贞子洗净，干燥，粉碎后，得到中药粉，加水沸腾提取3次，每次5h，所述中药粉和水的固液比为1:10g/mL，过滤，合并滤液，浓缩，105℃干燥2h，得到中药水提取物，滤渣留用；
[0089] S3.中药‑蛋白肽培养基的制备：将15重量份步骤S2中的滤渣、10重量份骨胶原蛋白、5重量份麦芽糖、5重量份异麦芽糖、2重量份果糖、2重量份重量份鱼粉、2重量份尿素、2重量份硝酸锌、1重量份硝酸铁混合，加入200无菌水中，搅拌混合15min，紫外线灭菌，得到中药‑蛋白肽培养基；
[0090] S4.发酵：将步骤S1中制得的植物乳杆菌和唾液乳杆菌菌种种子液接种至步骤S3制得的中药‑蛋白肽培养基中，接种量分别为5%和4%，微缺氧条件下，38℃，70r/min，发酵培养72h，得到发酵产物；
[0091] 所述微缺氧条件为7%CO2、10%O2，余量为N2，其中%为体积百分比；
[0092] S5.磷酸化发酵产物的制备：向100重量份步骤S4制得的发酵产物中加入12重量份三偏磷酸钠，调节pH值为9，加热至45℃，反应70min，制得磷酸化发酵产物；
[0093] S6.磷酸化钙肽发酵复合物的制备：将10重量份步骤S5制得的磷酸化发酵产物中加入7重量份50wt%的氯化钙溶液，搅拌反应50min，冷冻干燥，得到磷酸化钙肽发酵复合物；
[0094] S7.维生素D组合物的制备：将3重量份维生素D1、5重量份维生素D3搅拌混合15min，制得维生素D组合物；
[0095] S8.破骨细胞抑制剂的制备：将5重量份利塞膦酸钠与2重量份降钙素搅拌混合15min，制得破骨细胞抑制剂；
[0096] S9.活性组合物的制备：将7重量份海参皂苷和5重量份人参皂苷Rg3搅拌混合15min，制得活性组合物；
[0097] S10.改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物的制备：将6重量份步骤S2制得的中药水提取物、10重量份步骤S6制得的磷酸化钙肽发酵复合物、70重量份柠檬酸钙、0.001重量份步骤S7制得的维生素D组合物、0.02重量份步骤S8制得的破骨细胞抑制剂和0.4重量份步骤S9制得的活性组合物加入水中，搅拌混合20min，加入12重量份海藻酸钠、7重量份羧甲基纤维素钠和6重量份羧甲基茯苓多糖，搅拌溶解后得到水相；将50重量份水相加入70重量份大豆油中，通过孔径为3mm的快速膜乳化，加入20重量份含有5wt%的氯化钙、氯化铁或者氯化铝溶液，常温固化30min，过滤，冷冻干燥，得到改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物。
[0098] 实施例3
[0099] 本实施例提供一种改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物的制备方法，具体包括以下步骤：
[0100] S1.益生菌的活化：将植物乳杆菌和唾液乳杆菌分别在高氏培养基中划线，微缺氧条件下，37℃，65r/min，活化培养21h，得到菌种种子液；
[0101] 所述微缺氧条件为6%CO2、8.5%O2，余量为N2，其中%为体积百分比；
[0102] S2.中药水提取物的制备：将7重量份葛根、4重量份补骨脂、6重量份淫羊藿和2重量份女贞子洗净，干燥，粉碎后，得到中药粉，加水沸腾提取3次，每次4h，所述中药粉和水的固液比为1:7g/mL，过滤，合并滤液，浓缩，105℃干燥2h，得到中药水提取物，滤渣留用；
[0103] S3.中药‑蛋白肽培养基的制备：将12重量份步骤S2中的滤渣、8.5重量份骨胶原蛋白、5重量份葡萄糖、2重量份麦芽糖、3重量份蛋白胨、2重量份尿素混合，加入170无菌水中，搅拌混合15min，紫外线灭菌，得到中药‑蛋白肽培养基；
[0104] S4.发酵：将步骤S1中制得的植物乳杆菌和唾液乳杆菌菌种种子液接种至步骤S3制得的中药‑蛋白肽培养基中，接种量分别为4%和3%，微缺氧条件下，37℃，60r/min，发酵培养56h，得到发酵产物；
[0105] 所述微缺氧条件为6%CO2、8.5%O2，余量为N2，其中%为体积百分比；
[0106] S5.磷酸化发酵产物的制备：向100重量份步骤S4制得的发酵产物中加入10重量份三偏磷酸钠，调节pH值为8.5，加热至40℃，反应60min，制得磷酸化发酵产物；
[0107] S6.磷酸化钙肽发酵复合物的制备：将10重量份步骤S5制得的磷酸化发酵产物中加入6重量份45wt%的氯化钙溶液，搅拌反应40min，冷冻干燥，得到磷酸化钙肽发酵复合物；
[0108] S7.维生素D组合物的制备：将2重量份维生素D1、5重量份维生素D3搅拌混合15min，制得维生素D组合物；
[0109] S8.破骨细胞抑制剂的制备：将4重量份奥帕膦酸钠与2重量份降钙素搅拌混合15min，制得破骨细胞抑制剂；
[0110] S9.活性组合物的制备：将5重量份海参皂苷和5重量份人参皂苷Rg3搅拌混合15min，制得活性组合物；
[0111] S10.改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物的制备：将5重量份步骤S2制得的中药水提取物、10重量份步骤S6制得的磷酸化钙肽发酵复合物、60重量份柠檬酸钙、0.0005重量份步骤S7制得的维生素D组合物、0.015重量份步骤S8制得的破骨细胞抑制剂和0.3重量份步骤S9制得的活性组合物加入水中，搅拌混合20min，加入11重量份海藻酸钠、6重量份羧甲基纤维素钠和5重量份羧甲基茯苓多糖，搅拌溶解后得到水相；将40重量份水相加入60重量份菜籽油中，通过孔径为2mm的快速膜乳化，加入15重量份含有4wt%的氯化钙、氯化铁或者氯化铝溶液，常温固化25min，过滤，冷冻干燥，得到改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物。
[0112] 对比例1
[0113] 与实施例3相比，不同之处在于，步骤S2中未添加葛根。
[0114] 具体如下：
[0115] S2.中药水提取物的制备：将11重量份补骨脂、6重量份淫羊藿和2重量份女贞子洗净，干燥，粉碎后，得到中药粉，加水沸腾提取3次，每次4h，所述中药粉和水的固液比为1:7g/mL，过滤，合并滤液，浓缩，105℃干燥2h，得到中药水提取物，滤渣留用。
[0116] 对比例2
[0117] 与实施例3相比，不同之处在于，步骤S2中未添加补骨脂。
[0118] 具体如下：
[0119] S2.中药水提取物的制备：将11重量份葛根、6重量份淫羊藿和2重量份女贞子洗净，干燥，粉碎后，得到中药粉，加水沸腾提取3次，每次4h，所述中药粉和水的固液比为1:7g/mL，过滤，合并滤液，浓缩，105℃干燥2h，得到中药水提取物，滤渣留用。
[0120] 对比例3
[0121] 与实施例3相比，不同之处在于，步骤S3中未添加滤渣。
[0122] 具体如下：
[0123] S3.中药‑蛋白肽培养基的制备：将20.5重量份骨胶原蛋白、5重量份葡萄糖、2重量份麦芽糖、3重量份蛋白胨、2重量份尿素混合，加入170无菌水中，搅拌混合15min，紫外线灭菌，得到中药‑蛋白肽培养基。
[0124] 对比例4
[0125] 与实施例3相比，不同之处在于，步骤S3中未添加骨胶原蛋白。
[0126] 具体如下：
[0127] S3.中药‑蛋白肽培养基的制备：将20.5重量份步骤S2中的滤渣、5重量份葡萄糖、2重量份麦芽糖、3重量份蛋白胨、2重量份尿素混合，加入170无菌水中，搅拌混合15min，紫外线灭菌，得到中药‑蛋白肽培养基。
[0128] 对比例5
[0129] 与实施例3相比，不同之处在于，步骤S4中未接种植物乳杆菌。
[0130] 具体如下：
[0131] S4.发酵：将步骤S1中制得的唾液乳杆菌菌种种子液接种至步骤S3制得的中药‑蛋白肽培养基中，接种量为7%，微缺氧条件下，37℃，60r/min，发酵培养56h，得到发酵产物；
[0132] 所述微缺氧条件为6%CO2、8.5%O2，余量为N2，其中%为体积百分比。
[0133] 对比例6
[0134] 与实施例3相比，不同之处在于，步骤S4中未接种唾液乳杆菌。
[0135] 具体如下：
[0136] S4.发酵：将步骤S1中制得的植物乳杆菌菌种种子液接种至步骤S3制得的中药‑蛋白肽培养基中，接种量为7%，微缺氧条件下，37℃，60r/min，发酵培养56h，得到发酵产物；
[0137] 所述微缺氧条件为6%CO2、8.5%O2，余量为N2，其中%为体积百分比。
[0138] 对比例7
[0139] 与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S4，骨胶原蛋白直接加入步骤S5中。
[0140] 具体如下：
[0141] S1.中药水提取物的制备：将7重量份葛根、4重量份补骨脂、6重量份淫羊藿和2重量份女贞子洗净，干燥，粉碎后，得到中药粉，加水沸腾提取3次，每次4h，所述中药粉和水的固液比为1:7g/mL，过滤，合并滤液，浓缩，105℃干燥2h，得到中药水提取物；
[0142] S2.磷酸化骨胶原蛋白的制备：向10重量份骨胶原蛋白中加入10重量份三偏磷酸钠，调节pH值为8.5，加热至40℃，反应60min，制得磷酸化骨胶原蛋白；
[0143] S3.磷酸化钙肽复合物的制备：将10重量份步骤S5制得的磷酸化骨胶原蛋白中加入6重量份45wt%的氯化钙溶液，搅拌反应40min，冷冻干燥，得到磷酸化钙肽复合物；
[0144] S4.维生素D组合物的制备：将2重量份维生素D1、5重量份维生素D3搅拌混合15min，制得维生素D组合物；
[0145] S5.破骨细胞抑制剂的制备：将4重量份奥帕膦酸钠与2重量份降钙素搅拌混合15min，制得破骨细胞抑制剂；
[0146] S6.活性组合物的制备：将5重量份海参皂苷和5重量份人参皂苷Rg3搅拌混合15min，制得活性组合物；
[0147] S7.改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物的制备：将5重量份步骤S1制得的中药水提取物、10重量份步骤S3制得的磷酸化钙肽复合物、60重量份柠檬酸钙、0.0005重量份步骤S4制得的维生素D组合物、0.015重量份步骤S5制得的破骨细胞抑制剂和0.3重量份步骤S6制得的活性组合物加入水中，搅拌混合20min，加入11重量份海藻酸钠、6重量份羧甲基纤维素钠和5重量份羧甲基茯苓多糖，搅拌溶解后得到水相；将40重量份水相加入60重量份菜籽油中，通过孔径为2mm的快速膜乳化，加入15重量份含有4wt%的氯化钙、氯化铁或者氯化铝溶液，常温固化25min，过滤，冷冻干燥，得到改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物。
[0148] 对比例8
[0149] 与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S5。
[0150] 具体如下：
[0151] S1.益生菌的活化：将植物乳杆菌和唾液乳杆菌分别在高氏培养基中划线，微缺氧条件下，37℃，65r/min，活化培养21h，得到菌种种子液；
[0152] 所述微缺氧条件为6%CO2、8.5%O2，余量为N2，其中%为体积百分比；
[0153] S2.中药水提取物的制备：将7重量份葛根、4重量份补骨脂、6重量份淫羊藿和2重量份女贞子洗净，干燥，粉碎后，得到中药粉，加水沸腾提取3次，每次4h，所述中药粉和水的固液比为1:7g/mL，过滤，合并滤液，浓缩，105℃干燥2h，得到中药水提取物，滤渣留用；
[0154] S3.中药‑蛋白肽培养基的制备：将12重量份步骤S2中的滤渣、8.5重量份骨胶原蛋白、5重量份葡萄糖、2重量份麦芽糖、3重量份蛋白胨、2重量份尿素混合，加入170无菌水中，搅拌混合15min，紫外线灭菌，得到中药‑蛋白肽培养基；
[0155] S4.发酵：将步骤S1中制得的植物乳杆菌和唾液乳杆菌菌种种子液接种至步骤S3制得的中药‑蛋白肽培养基中，接种量分别为4%和3%，微缺氧条件下，37℃，60r/min，发酵培养56h，得到发酵产物；
[0156] 所述微缺氧条件为6%CO2、8.5%O2，余量为N2，其中%为体积百分比；
[0157] S5.钙肽发酵复合物的制备：将10重量份步骤S4制得的发酵产物中加入6重量份45wt%的氯化钙溶液，搅拌反应40min，冷冻干燥，得到钙肽发酵复合物；
[0158] S6.维生素D组合物的制备：将2重量份维生素D1、5重量份维生素D3搅拌混合15min，制得维生素D组合物；
[0159] S7.破骨细胞抑制剂的制备：将4重量份奥帕膦酸钠与2重量份降钙素搅拌混合15min，制得破骨细胞抑制剂；
[0160] S8.活性组合物的制备：将5重量份海参皂苷和5重量份人参皂苷Rg3搅拌混合15min，制得活性组合物；
[0161] S9.改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物的制备：将5重量份步骤S2制得的中药水提取物、10重量份步骤S5制得的钙肽发酵复合物、60重量份柠檬酸钙、0.0005重量份步骤S6制得的维生素D组合物、0.015重量份步骤S7制得的破骨细胞抑制剂和0.3重量份步骤S8制得的活性组合物加入水中，搅拌混合20min，加入11重量份海藻酸钠、6重量份羧甲基纤维素钠和5重量份羧甲基茯苓多糖，搅拌溶解后得到水相；将40重量份水相加入60重量份菜籽油中，通过孔径为2mm的快速膜乳化，加入15重量份含有4wt%的氯化钙、氯化铁或者氯化铝溶液，常温固化25min，过滤，冷冻干燥，得到改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物。
[0162] 对比例9
[0163] 与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S6。
[0164] 具体如下：
[0165] S1.益生菌的活化：将植物乳杆菌和唾液乳杆菌分别在高氏培养基中划线，微缺氧条件下，37℃，65r/min，活化培养21h，得到菌种种子液；
[0166] 所述微缺氧条件为6%CO2、8.5%O2，余量为N2，其中%为体积百分比；
[0167] S2.中药水提取物的制备：将7重量份葛根、4重量份补骨脂、6重量份淫羊藿和2重量份女贞子洗净，干燥，粉碎后，得到中药粉，加水沸腾提取3次，每次4h，所述中药粉和水的固液比为1:7g/mL，过滤，合并滤液，浓缩，105℃干燥2h，得到中药水提取物，滤渣留用；
[0168] S3.中药‑蛋白肽培养基的制备：将12重量份步骤S2中的滤渣、8.5重量份骨胶原蛋白、5重量份葡萄糖、2重量份麦芽糖、3重量份蛋白胨、2重量份尿素混合，加入170无菌水中，搅拌混合15min，紫外线灭菌，得到中药‑蛋白肽培养基；
[0169] S4.发酵：将步骤S1中制得的植物乳杆菌和唾液乳杆菌菌种种子液接种至步骤S3制得的中药‑蛋白肽培养基中，接种量分别为4%和3%，微缺氧条件下，37℃，60r/min，发酵培养56h，得到发酵产物；
[0170] 所述微缺氧条件为6%CO2、8.5%O2，余量为N2，其中%为体积百分比；
[0171] S5.磷酸化发酵产物的制备：向100重量份步骤S4制得的发酵产物中加入10重量份三偏磷酸钠，调节pH值为8.5，加热至40℃，反应60min，制得磷酸化发酵产物；
[0172] S6.维生素D组合物的制备：将2重量份维生素D1、5重量份维生素D3搅拌混合15min，制得维生素D组合物；
[0173] S7.破骨细胞抑制剂的制备：将4重量份奥帕膦酸钠与2重量份降钙素搅拌混合15min，制得破骨细胞抑制剂；
[0174] S8.活性组合物的制备：将5重量份海参皂苷和5重量份人参皂苷Rg3搅拌混合15min，制得活性组合物；
[0175] S9.改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物的制备：将5重量份步骤S2制得的中药水提取物、10重量份步骤S5制得的磷酸化发酵产物、60重量份柠檬酸钙、0.0005重量份步骤S6制得的维生素D组合物、0.015重量份步骤S7制得的破骨细胞抑制剂和0.3重量份步骤S8制得的活性组合物加入水中，搅拌混合20min，加入11重量份海藻酸钠、6重量份羧甲基纤维素钠和5重量份羧甲基茯苓多糖，搅拌溶解后得到水相；将40重量份水相加入60重量份菜籽油中，通过孔径为2mm的快速膜乳化，加入15重量份含有4wt%的氯化钙、氯化铁或者氯化铝溶液，常温固化25min，过滤，冷冻干燥，得到改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物。
[0176] 对比例10
[0177] 与实施例3相比，不同之处在于，步骤S7中未添加维生素D1。
[0178] 具体如下：
[0179] S7.维生素D组合物的制备：将7重量份维生素D3搅拌混合15min，制得维生素D组合物。
[0180] 对比例11
[0181] 与实施例3相比，不同之处在于，步骤S7中未添加维生素D3。
[0182] 具体如下：
[0183] S7.维生素D组合物的制备：将7重量份维生素D1搅拌混合15min，制得维生素D组合物。
[0184] 对比例12
[0185] 与实施例3相比，不同之处在于，步骤S8中未添加奥帕膦酸钠。
[0186] 具体如下：
[0187] S8.破骨细胞抑制剂的制备：将6重量份降钙素搅拌混合15min，制得破骨细胞抑制剂。
[0188] 对比例13
[0189] 与实施例3相比，不同之处在于，步骤S8中未添加降钙素。
[0190] 具体如下：
[0191] S8.破骨细胞抑制剂的制备：将6重量份奥帕膦酸钠搅拌混合15min，制得破骨细胞抑制剂。
[0192] 对比例14
[0193] 与实施例3相比，不同之处在于，步骤S9中未添加海参皂苷。
[0194] 具体如下：
[0195] S9.活性组合物的制备：将10重量份人参皂苷Rg3搅拌混合15min，制得活性组合物。
[0196] 对比例15
[0197] 与实施例3相比，不同之处在于，步骤S9中未添加人参皂苷Rg3。
[0198] 具体如下：
[0199] S9.活性组合物的制备：将10重量份海参皂苷搅拌混合15min，制得活性组合物。
[0200] 对比例16
[0201] 与实施例3相比，不同之处在于，步骤S10中未添加磷酸化钙肽发酵复合物。
[0202] 具体如下：
[0203] S10.改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物的制备：将5重量份步骤S2制得的中药水提取物、60重量份柠檬酸钙、0.0005重量份步骤S7制得的维生素D组合物、0.015重量份步骤S8制得的破骨细胞抑制剂和0.3重量份步骤S9制得的活性组合物加入水中，搅拌混合20min，加入11重量份海藻酸钠、6重量份羧甲基纤维素钠和5重量份羧甲基茯苓多糖，搅拌溶解后得到水相；将40重量份水相加入60重量份菜籽油中，通过孔径为2mm的快速膜乳化，加入15重量份含有4wt%的氯化钙、氯化铁或者氯化铝溶液，常温固化25min，过滤，冷冻干燥，得到改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物。
[0204] 对比例17
[0205] 与实施例3相比，不同之处在于，步骤S10中未添加维生素D组合物。
[0206] 具体如下：
[0207] S10.改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物的制备：将5重量份步骤S2制得的中药水提取物、10重量份步骤S6制得的磷酸化钙肽发酵复合物、60重量份柠檬酸钙、0.015重量份步骤S8制得的破骨细胞抑制剂和0.3重量份步骤S9制得的活性组合物加入水中，搅拌混合20min，加入11重量份海藻酸钠、6重量份羧甲基纤维素钠和5重量份羧甲基茯苓多糖，搅拌溶解后得到水相；将40重量份水相加入60重量份菜籽油中，通过孔径为2mm的快速膜乳化，加入15重量份含有4wt%的氯化钙、氯化铁或者氯化铝溶液，常温固化25min，过滤，冷冻干燥，得到改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物。
[0208] 对比例18
[0209] 与实施例3相比，不同之处在于，步骤S10中未添加柠檬酸钙。
[0210] 具体如下：
[0211] S10.改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物的制备：将5重量份步骤S2制得的中药水提取物、10重量份步骤S6制得的磷酸化钙肽发酵复合物、0.0005重量份步骤S7制得的维生素D组合物、0.015重量份步骤S8制得的破骨细胞抑制剂和0.3重量份步骤S9制得的活性组合物加入水中，搅拌混合20min，加入11重量份海藻酸钠、6重量份羧甲基纤维素钠和5重量份羧甲基茯苓多糖，搅拌溶解后得到水相；将40重量份水相加入60重量份菜籽油中，通过孔径为2mm的快速膜乳化，加入15重量份含有4wt%的氯化钙、氯化铁或者氯化铝溶液，常温固化25min，过滤，冷冻干燥，得到改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物。
[0212] 对比例19
[0213] 与实施例3相比，不同之处在于，步骤S10中未添加破骨细胞抑制剂。
[0214] 具体如下：
[0215] S10.改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物的制备：将5重量份步骤S2制得的中药水提取物、10重量份步骤S6制得的磷酸化钙肽发酵复合物、60重量份柠檬酸钙、0.0005重量份步骤S7制得的维生素D组合物、0.3重量份步骤S9制得的活性组合物加入水中，搅拌混合20min，加入11重量份海藻酸钠、6重量份羧甲基纤维素钠和5重量份羧甲基茯苓多糖，搅拌溶解后得到水相；将40重量份水相加入60重量份菜籽油中，通过孔径为2mm的快速膜乳化，加入15重量份含有4wt%的氯化钙、氯化铁或者氯化铝溶液，常温固化25min，过滤，冷冻干燥，得到改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物。
[0216] 对比例20
[0217] 与实施例3相比，不同之处在于，步骤S10中未添加活性组合物。
[0218] 具体如下：
[0219] S10.改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物的制备：将5重量份步骤S2制得的中药水提取物、10重量份步骤S6制得的磷酸化钙肽发酵复合物、60重量份柠檬酸钙、0.0005重量份步骤S7制得的维生素D组合物、0.015重量份步骤S8制得的破骨细胞抑制剂加入水中，搅拌混合20min，加入11重量份海藻酸钠、6重量份羧甲基纤维素钠和5重量份羧甲基茯苓多糖，搅拌溶解后得到水相；将40重量份水相加入60重量份菜籽油中，通过孔径为2mm的快速膜乳化，加入15重量份含有4wt%的氯化钙、氯化铁或者氯化铝溶液，常温固化25min，过滤，冷冻干燥，得到改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物。
[0220] 对比例21
[0221] 与实施例3相比，不同之处在于，步骤S10中未添加中药水提取物。
[0222] 具体如下：
[0223] S10.改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物的制备：将10重量份步骤S6制得的磷酸化钙肽发酵复合物、60重量份柠檬酸钙、0.0005重量份步骤S7制得的维生素D组合物、0.015重量份步骤S8制得的破骨细胞抑制剂和0.3重量份步骤S9制得的活性组合物加入水中，搅拌混合20min，加入11重量份海藻酸钠、6重量份羧甲基纤维素钠和5重量份羧甲基茯苓多糖，搅拌溶解后得到水相；将40重量份水相加入60重量份菜籽油中，通过孔径为2mm的快速膜乳化，加入15重量份含有4wt%的氯化钙、氯化铁或者氯化铝溶液，常温固化25min，过滤，冷冻干燥，得到改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物。
[0224] 对比例22
[0225] 与实施例3相比，不同之处在于，步骤S10未进行微胶囊化。
[0226] 具体如下：
[0227] S10.改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物的制备：将5重量份步骤S2制得的中药水提取物、10重量份步骤S6制得的磷酸化钙肽发酵复合物、60重量份柠檬酸钙、0.0005重量份步骤S7制得的维生素D组合物、0.015重量份步骤S8制得的破骨细胞抑制剂和0.3重量份步骤S9制得的活性组合物搅拌混合20min，得到改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物。
[0228] 测试例1
[0229] 将0.5g本发明实施例1‑3和对比例22制得的改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物分别加入到10mL人工模拟胃液和10mL人工模拟肠液中，在37℃、70r/min条件下分别反应2h和3h，另外，取等量的改善肠道菌群平衡的益生菌剂加入到10mL人工模拟胃液中，70r/min条件下，在37℃、反应2h后，离心，再加入10mL人工模拟肠液，70r/min条件下，在37℃继续反应
3h。反应结束后进行益生菌群细胞计数。
3h。反应结束后进行益生菌群细胞计数。
[0230] 人工模拟胃液：取稀盐酸16.4mL，加水约800mL，调pH2.0，胃蛋白酶10g，搅匀后加水定容至1000mL。
[0231] 人工模拟肠液：磷酸二氢钾6.8g，加水500mL蒸馏水溶解，用0.4%的氢氧化钠调节pH至6.8；120℃灭菌20min；胰蛋白酶10g，加无菌水适量使溶解，将两液混合后，加水定容至1000mL。
[0232] 按照以下公式计算存活率：
[0233] 存活率(%)=Nt/N0×100%
[0234] 式中，Nt为在体外孵育一定时间后存活的益生菌浓度(cfu/g)，N0为益生菌原始浓度(cfu/g)。
[0235] 按照以下公式计算释放率：
[0236] 释放率(%)=（Wt‑W0）/W0×100%
[0237] 式中，Wt为样品起始重量；W0为样品在体外孵育一定时间后重量。
[0238] 结果见图1和图2。
[0239] 由图1‑2可知，本发明实施例1‑3制得的改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物在人工模拟胃液中能够保持较好的形态，在人工模拟肠液中发生崩塌释放内容物。本发明通过海藻酸钠、羧甲基纤维素钠和羧甲基茯苓多糖混合包埋，金属离子交联后，形成的微胶囊壳层具有较好的pH响应性，在pH较低的酸性条件下能够保持较为完整的形态，从而保障益生菌、磷酸化钙肽发酵复合物等活性成分不被胃酸消化、失活，能够靶向将活性成分输送至肠道，微胶囊形态破裂后，壳材还可以作为一种益生元物质，促进益生菌的生长和定植，从而促进益生菌发挥作用，促进其他活性成分被小肠的吸收。
[0240] 测试例2
[0241] 将280只出生3‑4周的断乳SPF级雌性大鼠，体质量60‑90g，按体质量随机分为28组，每组10只，分别为正常对照组、低钙对照组、碳酸钙组、实施例1‑3组、对比例1‑22组。除了正常对照组，其他组以低钙饲料持续喂食制备低骨量模型大鼠，同时各个组喂食相应的受试品，碳酸钙组的喂食150mg/kg碳酸钙，实施例1‑3及对比例1‑22组喂食相应的改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物150mg/kg，低钙对照组给予相应体积的蒸馏水，正常对照组以正常饲料和相应体积的蒸馏水喂食，均持续13周。
[0242] 低钙饲料配方为：黄豆粉15%、酪蛋白10%、豆油4%、面粉54%、纤维素2%、维生素1%、无钙矿物盐2.6%、蛋氨酸0.2%、氯化胆碱0.2%、淀粉11%；辐照灭菌。
[0243] 身长、体质量的测定：大鼠禁食12h后，测定身长、体质量，第13周测1次。结果见表1。
[0244] 表1
[0245] 组别 体质量（g） 身长（cm）正常对照组 317.2±22.1 24.2±1.4
* *
低钙对照组 282.5±19.5 20.1±1.2
# #
碳酸钙组 291.4±21.4 21.9±1.5
# #
实施例1组 303.2±22.4 23.1±1.9
# #
实施例2组 304.1±19.5 23.2±2.1
# #
实施例3组 305.0±15.7 23.4±2.0
对比例1组 298.7±17.2 22.8±1.6
对比例2组 297.5±23.1 22.6±1.4
对比例3组 295.6±22.4 22.4±1.2
对比例4组 295.0±19.8 22.3±1.6
对比例5组 296.8±20.4 22.7±1.9
对比例6组 297.0±18.9 22.6±1.8
对比例7组 295.4±16.7 22.4±1.2
对比例8组 298.9±17.2 22.9±1.1
对比例9组 296.7±15.9 22.6±1.4
对比例10组 296.5±18.4 22.5±1.7
对比例11组 295.8±19.0 22.4±1.5
对比例12组 297.4±14.7 22.7±2.0
对比例13组 297.2±21.0 22.6±2.1
对比例14组 295.3±20.3 22.4±1.9
对比例15组 294.9±19.8 22.3±2.2
对比例16组 292.3±18.9 22.1±1.0
对比例17组 295.0±19.2 22.3±0.9
对比例18组 292.0±17.8 22.0±1.2
对比例19组 296.5±19.5 22.5±1.4
对比例20组 293.6±20.1 22.1±1.2
对比例21组 294.2±20.3 22.2±1.3
对比例22组 295.1±19.8 22.4±1.5
* *
低钙对照组 282.5±19.5 20.1±1.2
# #
碳酸钙组 291.4±21.4 21.9±1.5
# #
实施例1组 303.2±22.4 23.1±1.9
# #
实施例2组 304.1±19.5 23.2±2.1
# #
实施例3组 305.0±15.7 23.4±2.0
对比例1组 298.7±17.2 22.8±1.6
对比例2组 297.5±23.1 22.6±1.4
对比例3组 295.6±22.4 22.4±1.2
对比例4组 295.0±19.8 22.3±1.6
对比例5组 296.8±20.4 22.7±1.9
对比例6组 297.0±18.9 22.6±1.8
对比例7组 295.4±16.7 22.4±1.2
对比例8组 298.9±17.2 22.9±1.1
对比例9组 296.7±15.9 22.6±1.4
对比例10组 296.5±18.4 22.5±1.7
对比例11组 295.8±19.0 22.4±1.5
对比例12组 297.4±14.7 22.7±2.0
对比例13组 297.2±21.0 22.6±2.1
对比例14组 295.3±20.3 22.4±1.9
对比例15组 294.9±19.8 22.3±2.2
对比例16组 292.3±18.9 22.1±1.0
对比例17组 295.0±19.2 22.3±0.9
对比例18组 292.0±17.8 22.0±1.2
对比例19组 296.5±19.5 22.5±1.4
对比例20组 293.6±20.1 22.1±1.2
对比例21组 294.2±20.3 22.2±1.3
对比例22组 295.1±19.8 22.4±1.5
[0246] 注释：*为与正常对照组相比，P<0.05；#为与低钙对照组相比，P<0.05。
[0247] 由上表可知，本发明实施例1‑3制得的改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物能明显促进大鼠身体生长。
[0248] 腰椎骨密度的测定：于试验结束前1d采用双能X射线骨密度仪测量大鼠腰椎骨密度。
[0249] 股骨折断力的测定：试验结束后，将左侧股骨取出置于冰箱中，利用医药包装性能测试仪将股骨头凹面朝下，股骨头端朝前的位置放置于跨距为20mm的两个支撑点上，压头‑1（厚度1.2mm）在股骨长度中间位置的正上方给标本施加向下20mm·min 的载荷，直至股骨断裂。记录并计算最大力值，股骨断裂前所能承受的最大力，为最大折断力。
[0250] 股骨骨钙含量的测定：用原子吸收法对恒重的左侧股骨进行消化后测定骨钙含量。
[0251] 结果见表2。
[0252] 2组别 腰椎骨密度（g/cm） 最大折断力（N） 骨钙含量（mg/g）
正常对照组 0.242±0.021 141.2±13.02 307.2±25.72
* * *
低钙对照组 0.115±0.011 65.7±5.28 238.1±18.21
# # #
碳酸钙组 0.154±0.021 120.2±10.21 274.5±22.12
# # #
实施例1组 0.224±0.024 128.9±11.24 291.4±20.14
# # #
实施例2组 0.226±0.029 129.5±10.58 292.1±21.42
# # #
实施例3组 0.234±0.027 130.2±13.21 294.5±22.82
对比例1组 0.188±0.022 126.7±12.44 288.4±20.11
对比例2组 0.184±0.026 127.0±12.08 289.0±21.78
对比例3组 0.176±0.029 125.5±11.27 287.2±21.48
对比例4组 0.168±0.033 124.9±11.50 286.1±22.31
对比例5组 0.173±0.031 125.2±12.42 287.4±19.22
对比例6组 0.171±0.029 125.0±12.11 287.0±20.33
对比例7组 0.166±0.030 124.6±13.04 286.7±21.41
对比例8组 0.162±0.028 122.5±13.10 284.7±20.38
对比例9组 0.160±0.027 121.7±12.57 278.5±19.27
对比例10组 0.169±0.029 124.8±12.11 281.0±20.47
对比例11组 0.171±0.025 125.4±12.88 280.2±21.31
对比例12组 0.175±0.024 125.7±12.47 288.0±20.38
对比例13组 0.178±0.019 126.0±11.38 288.5±21.48
对比例14组 0.172±0.027 125.1±11.30 284.2±19.58
对比例15组 0.174±0.030 125.5±11.58 283.7±18.39
对比例16组 0.159±0.028 121.2±12.17 276.4±17.09
对比例17组 0.167±0.025 124.2±12.35 279.4±20.12
对比例18组 0.164±0.021 122.5±10.21 278.2±18.92
对比例19组 0.172±0.022 125.2±11.25 287.3±19.24
对比例20组 0.170±0.025 124.7±11.49 282.5±20.15
对比例21组 0.162±0.029 125.0±10.28 285.8±19.28
对比例22组 0.165±0.031 124.9±11.32 279.7±19.42
正常对照组 0.242±0.021 141.2±13.02 307.2±25.72
* * *
低钙对照组 0.115±0.011 65.7±5.28 238.1±18.21
# # #
碳酸钙组 0.154±0.021 120.2±10.21 274.5±22.12
# # #
实施例1组 0.224±0.024 128.9±11.24 291.4±20.14
# # #
实施例2组 0.226±0.029 129.5±10.58 292.1±21.42
# # #
实施例3组 0.234±0.027 130.2±13.21 294.5±22.82
对比例1组 0.188±0.022 126.7±12.44 288.4±20.11
对比例2组 0.184±0.026 127.0±12.08 289.0±21.78
对比例3组 0.176±0.029 125.5±11.27 287.2±21.48
对比例4组 0.168±0.033 124.9±11.50 286.1±22.31
对比例5组 0.173±0.031 125.2±12.42 287.4±19.22
对比例6组 0.171±0.029 125.0±12.11 287.0±20.33
对比例7组 0.166±0.030 124.6±13.04 286.7±21.41
对比例8组 0.162±0.028 122.5±13.10 284.7±20.38
对比例9组 0.160±0.027 121.7±12.57 278.5±19.27
对比例10组 0.169±0.029 124.8±12.11 281.0±20.47
对比例11组 0.171±0.025 125.4±12.88 280.2±21.31
对比例12组 0.175±0.024 125.7±12.47 288.0±20.38
对比例13组 0.178±0.019 126.0±11.38 288.5±21.48
对比例14组 0.172±0.027 125.1±11.30 284.2±19.58
对比例15组 0.174±0.030 125.5±11.58 283.7±18.39
对比例16组 0.159±0.028 121.2±12.17 276.4±17.09
对比例17组 0.167±0.025 124.2±12.35 279.4±20.12
对比例18组 0.164±0.021 122.5±10.21 278.2±18.92
对比例19组 0.172±0.022 125.2±11.25 287.3±19.24
对比例20组 0.170±0.025 124.7±11.49 282.5±20.15
对比例21组 0.162±0.029 125.0±10.28 285.8±19.28
对比例22组 0.165±0.031 124.9±11.32 279.7±19.42
[0253] 注释：*为与正常对照组相比，P<0.05；#为与低钙对照组相比，P<0.05。
[0254] 由上表可知，本发明实施例1‑3制得的改善骨密度的钙、VD、蛋白肽组合物能明显提高骨密度，提高骨钙含量，最大折断力明显提高。
[0255] 对比例1、2与实施例3相比，步骤S2中未添加葛根或补骨脂。对比例21与实施例3相比，步骤S10中未添加中药水提取物。对比例3、4与实施例3相比，步骤S3中未添加滤渣或骨胶原蛋白。体质量下降，身长缩短，骨密度下降，最大折断力减小，本发明中药组合物中添加的葛根经过水提取物后，含有丰富的葛根异黄酮由于异黄酮类化合物的雌激素作用，能有效预防骨质疏松症。葛根素也可以通过提高成骨细胞上雌激素受体水平，使较少量的雌激素发挥更大的生理效应。补骨脂中含有丰富的异补骨脂素，可促进成骨细胞的增殖，抑制成骨细胞的凋亡，促进体外培养的骨髓间充质干细胞的增殖与分化，减少钙盐沉积，具有很好的抗骨质疏松的作用。葛根性甘、辛、平，表证发热，项背强痛，阴虚消渴；淫羊藿性温味辛甘，可补益肾阳、强劲筋骨；补骨脂可填精益髓，滋肾健脾；女贞子能益气活血、补肝肾，强腰膝；诸药合用共奏补益脾肾、强筋壮骨、活血通络，治疗骨质疏松症可为标本兼顾。
[0256] 对比例5、6与实施例3相比，步骤S4中未接种植物乳杆菌或唾液乳杆菌。对比例7与实施例3相比，未进行步骤S4，骨胶原蛋白直接加入步骤S5中。体质量下降，身长缩短，骨密度下降，最大折断力减小，本发明经过益生菌包括植物乳杆菌和唾液乳杆菌发酵，其中植物乳杆菌能够减少炎症因子如TNF‑α和IL‑1b的表达，增加具有抑制溶骨作用的物质表达，减少骨量丢失；唾液乳杆菌能够通过促进肠上皮细胞吸收钙离子实现增加钙离子的吸收。两者的协同作用下，还可以改善肠道通透性，减轻肠道炎症，改善骨密度。
[0257] 对比例8与实施例3相比，未进行步骤S5。骨密度下降，最大折断力减小，蛋白质磷酸化是提高蛋白质功能的有效手段，磷酸基的导入能够促进生物体对钙的吸收，这是因为蛋白质氨基酸的侧链加入了一个带有强负电的磷酸基团，易发生酯化反应，从而改变了蛋白质的构型、活性及与其他分子相互作用力。磷酸化也可以增强磷酸钙的溶解性，促进生物体对钙的吸收。本发明制得的磷酸化发酵产物可以明显促进小肠对钙离子的吸收，并促进骨骼钙化，其机理是磷酸化发酵产物中，磷酸化蛋白肽的磷酸丝氨酸残基能够与钙离子结合，形成可溶性的复合物，阻止小肠内钙的沉淀，同时，制得的磷酸化蛋白肽能增加多肽与金属离子的螯合位点，提高金属离子的结合活性，并提高磷酸化蛋白肽的功能特性。
[0258] 对比例9与实施例3相比，未进行步骤S6。体质量下降，身长缩短，骨密度下降，最大折断力减小，骨钙含量下降，本发明在制得的磷酸化发酵产物的基础上，加入钙离子溶液，制得磷酸化蛋白肽螯合钙，使得其中的磷酸化蛋白肽与钙离子以配位共价键结合而形成的产物，具有吸收快，营养性强，生物效价高，抗氧化、抗菌、降血脂、免疫调节等活性。钙离子的结合位点主要是天冬氨酸和谷氨酸的羧基。磷酸化蛋白肽还与钙离子结合后形成特定的空间结构，从而促进钙的吸收。当钙离子和小肽螯合后，补钙效果会更好，这是由于钙离子在小肠内以螯合态存在，加速小肠对肽的吸收，故磷酸化蛋白肽螯合钙的补钙效果更佳。
[0259] 对比例16与实施例3相比，步骤S10中未添加磷酸化钙肽发酵复合物。体质量明显下降，身长明显缩短，骨密度明显下降，最大折断力减小，骨钙含量下降。
[0260] 对比例10、11与实施例3相比，步骤S7中未添加维生素D1或维生素D3。对比例17与实施例3相比，步骤S10中未添加维生素D组合物。体质量下降，身长缩短，骨密度下降，最大折断力减小，骨钙含量下降，老年患者身体出现缺钙体征，并不是因为摄入的食品中钙的含量少了，其根本在于机体对钙的吸收能力下降，因此，单纯的补钙治疗，往往难以取得满意的效果，老年性骨质疏松症主要病发人群为老年全身性功能减退患者，其随着年龄的增长，体内各脏器的新陈代谢缓慢或异常，致使肾脏羟化酶的合成及分泌减少，且低代谢状态会降低酶活性，这不利于活性维生素D1及维生素D3的生成，进而导致肠壁细胞吸收钙能力降低，致使人体内钙吸收不足，因此，本发明通过外加补充维生素D1和维生素D3的混合物，起到很好的促进肠壁细胞吸收钙能力，两者的添加具有协同增效的作用。
[0261] 对比例18与实施例3相比，步骤S10中未添加柠檬酸钙。体质量下降，身长缩短，骨密度下降，最大折断力减小，骨钙含量明显下降，钙剂与维生素D是典型的骨矿化促进药物，前者是构成骨质的重要组成部分，后者则能直接促进钙磷吸收，并将钙磷成分从骨质中游离至外周血中，令血钙、血磷回归正常值，从而令矿化作用获得转归，不断形成新骨，因此，可以大大缓解骨质疏松症病情。因此，本发明在补充维生素D的同时，还补充了大量的有机钙（柠檬酸钙及磷酸化钙肽发酵复合物）起到了很好的相互促进作用。
[0262] 对比例12、13与实施例3相比，步骤S8中未添加奥帕膦酸钠或降钙素。对比例19与实施例3相比，步骤S10中未添加破骨细胞抑制剂。体质量下降，身长缩短，骨密度下降，本发明破骨细胞抑制剂包括双膦酸盐与降钙素，它们能有效阻断破骨细胞的激活，诱导破骨细胞发生凋亡，而降钙素则能直接抑制破骨细胞生理作用，二者均可使骨质分解与流失变慢，并充分刺激新骨生成，从而有效的缓解老年骨质疏松症的发生，具有协同增效的作用。
[0263] 对比例14、15与实施例3相比，步骤S9中未添加海参皂苷或人参皂苷Rg3。对比例20与实施例3相比，步骤S10中未添加活性组合物。体质量下降，身长缩短，骨密度下降，骨钙含量下降，本发明制得的活性组合物包括海参皂苷和人参皂苷Rg3，两者具有相似的结构，具有促进成骨细胞增殖分化，降低骨吸收，改善骨质疏松的效果。海参皂苷还能够降低尿钙、尿磷浓度，减少骨矿流失，增强骨密度和骨矿化沉积，具有改善骨质疏松症的作用，两者的添加具有协同增效的作用。
[0264] 对比例22与实施例3相比，步骤S10未进行微胶囊化。体质量下降，身长缩短，骨密度下降，最大折断力减小，骨钙含量下降。本发明通过海藻酸钠、羧甲基纤维素钠和羧甲基茯苓多糖混合包埋，金属离子交联后，形成的微胶囊壳层具有较好的pH响应性，在pH较低的酸性条件下能够保持较为完整的形态，从而保障益生菌、磷酸化钙肽发酵复合物等活性成分不被胃酸消化、失活，能够靶向将活性成分输送至肠道，微胶囊形态破裂后，壳材还可以作为一种益生元物质，促进益生菌的生长和定植，从而促进益生菌发挥作用，促进其他活性成分被小肠的吸收。
[0265] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。