一株勒克氏菌CYIJM 6及其应用

摘要

本发明提供了一株勒克氏菌CYIJM6及其应用，属于微生物技术领域。所述勒克氏菌CYIJM6于2022年10月12日保存到中国典型培养物保藏中心，保藏编号为M20221561。本发明提供的菌株溶磷能力强，适用干旱半干旱地区土壤中磷素的活化，利用该溶磷菌可以显著提高干旱半干旱地区土壤速效磷含量，减少磷肥的施用。本发明提供的溶磷菌株作用底物广泛，既可以释放有机酸等小分子活化固定态无机磷，也可以分泌磷酸酶水解有机磷，利用该溶磷菌可以显著提高土壤磷素活化能力。

权利要求

1.一株勒克氏菌(Leclerciasp.)CYIJM6，于2022年10月12日保存到中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M20221561。

2.权利要求1所述的勒克氏菌CYIJM6在溶磷解磷中的应用；

所述溶磷解磷中的磷为植酸钙和/或磷酸钙。

说明书

一株勒克氏菌CYIJM 6及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物领域，特别是涉及一株勒克氏菌CYIJM 6及其应用。

背景技术

[0002] 磷肥施用是保证作物产量的必需措施之一，然而施入磷肥的75‑90％被土壤固定无法利用。大量磷素以无效态形式在土壤中积累，不仅影响土壤养分结构，还会提高面源污染的风险。更重要的是，磷肥的主要来源磷矿是不可再生资源，亟需有效的土壤磷素活化技术，能够高效利用土壤中积累的磷素，兼顾农业生产与磷素的可持续利用。

[0003] 溶磷微生物能有效溶解土壤难溶磷、减少磷肥固定、增加作物吸磷量，从而提高磷肥利用率和提高作物产量，是目前世界上公认的安全、经济和有效的生物措施。然而，能够分离得到的高效溶磷微生物菌株种类和数量有限，筛选多与不同环境土壤的适配能力差。特别是干旱半干旱地区，土壤磷素有效性极低，水分胁迫导致大部分微生物活性与功能大幅减弱。因此，特异性耐旱溶磷微生物资源及其利用，对于活化土壤磷素、保障粮食产量以及减少环境污染和能源浪费具有重要的战略意义。

发明内容

[0004] 为了解决上述问题，本发明提供了一株勒克氏菌CYIJM 6及其应用，本发明提供的菌株溶磷能力强，适用干旱半干旱地区土壤中磷素的活化，利用该溶磷菌可以显著提高干旱半干旱地区土壤速效磷含量，减少磷肥的施用。

[0005] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

[0006] 本发明提供了一株勒克氏菌(Leclercia sp.)CYIJM 6，于2022年10月12日保存到中国典型培养物保藏中心，保藏编号为M 20221561。

[0007] 本发明还提供了上述技术方案所述的勒克氏菌CYIJM 6在溶磷解磷中的应用。

[0008] 优选的，所述溶磷解磷中的磷包括有机磷和/或无机磷。

[0009] 优选的，所述有机磷包括植酸钙。

[0010] 优选的，所述无机磷包括磷酸钙。

[0011] 本发明的有益效果为：

[0012] 本发明提供的菌株溶磷能力强，适用干旱半干旱地区土壤中磷素的活化，利用该溶磷菌可以显著提高干旱半干旱地区土壤速效磷含量，减少磷肥的施用。

[0013] 本发明提供的溶磷菌株作用底物广泛，既可以释放有机酸等小分子活化固定态无机磷，也可以分泌磷酸酶水解有机磷，利用该溶磷菌可以显著提高土壤磷素活化能力。

[0014] 本发明提供的溶磷菌Leclercia sp.CYIJM 6在磷酸钙(无机磷)固体培养基中培养5天后，溶磷指数为2.42，可溶性磷浓度达到430mg/L。

[0015] 本发明提供溶磷菌Leclercia sp.CYIJM 6在植酸钙(有机磷)固体培养基中培养5天后，解磷指数为2.85，解磷量为228mg/L。

[0016] 生物保藏说明

[0017] 勒克氏菌(Leclercia sp.)CYIJM 6，于2022年10月12日保存到中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20221561，保藏地址：武汉大学。

附图说明

[0018] 图1为以FastMinimum Evolution法构建序列进化树。

具体实施方式

[0019] 本发明提供了一株勒克氏菌(Leclercia sp.)CYIJM 6，于2022年10月12日保存到中国典型培养物保藏中心，保藏编号为M 20221561。

[0020] 本发明还提供了上述技术方案所述的勒克氏菌CYIJM 6在溶磷解磷中的应用。在本发明中，所述溶磷解磷中的磷优选包括有机磷和/或无机磷。在本发明中，所述有机磷优选包括植酸钙。在本发明中，所述无机磷包括磷酸钙。

[0021] 为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0022] 实施例1

[0023] 1.菌株筛选与保存

[0024] (1)采集朝阳双塔区农田耕层土壤，放置无菌袋低温保存。朝阳由于北部蒙古高原的干燥冷空气经常侵入，形成了半干旱半湿润易干旱地区，适合耐旱菌株的筛选。

[0025] (2)将1g土壤放于100mL无机磷筛选液体培养基(葡萄糖：10g/L，Ca3(PO4)2：5g/L，MgCl2：5g/L，MgSO4·7H2O：0.25g/L，KCl：0.2g/L，(NH4)2SO4：0.1g/L)，置于恒温培养箱28℃震荡培养24小时。

[0026] (3)取1mL培养悬浊液接种于100mL新鲜配置的无机磷筛选液体培养基，置于恒温培养箱28℃震荡培养24小时。

[0027] (4)重复(3)1次后，取培养悬浊液梯度稀释104和105倍，取200μL涂布无机磷筛选培养基平板，置于恒温培养箱28℃培养24‑48小时。

[0028] (5)选择具有较大透明圈(即溶磷圈)的菌株，命名为CYIJM 6，计算溶磷指数(溶磷圈直径/菌落直径)。并将菌株在无机磷筛选平板纯化，单克隆纯化至少3次。纯化后的菌株用50％甘油与新鲜菌液1:1混合，于‑80℃超低温冰箱保存。

[0029] 2.菌株鉴定

[0030] 细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取菌株CYIJM 6的DNA，Qubit2.0检测提取DNA的浓度与纯度。以该DNA为模板，以16S rRNA 27F/1429R为引物，进行聚合酶链式反应(PCR)。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的质量后，扩增片段采用Sanger法测序，菌株16S rRNA序列如SEQ ID No.1所示。

[0031] 序列在NCBI的16S rRNA数据库进行比对分析，将其与相似度较高的菌株序列以Fast Minimum Evolution法构建序列进化树(图1)，确定CYIJM 6为勒克氏菌(Leclercia)。

[0032] >Leclercia sp.CYIJM 6菌株16S rRNA序列(SEQ ID No.1)：

[0033] TCGAACGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGTCTGGGAAACTGCCCGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCACACCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGGTGAAGTTAATAACTTCACCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTGGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGAC。

[0034] 实施例2

[0035] 磷活化能力(解磷量)测定：

[0036] (1)菌悬液的配制：用接种环挑取1环实施例1保存的菌种，接种于装有LB培养基的试管中，28℃恒温振荡培养过夜。按2％接种量转接于装有LB培养基的三角瓶中，28℃恒温振荡培养至菌悬液OD600≈1。

[0037] (2)培养：吸取1mL的菌悬液，置于1.5mL离心管中，用无菌水洗涤3次，并重悬于无菌水中。

[0038] (3)吸取0.2mL洗涤后的菌悬液(接种量：1％)，转接于装有20mL的液体培养基(测定无机磷溶能力：无机磷筛选液体培养基同实施例1；测定有机磷溶能力：植酸钙培养基(葡萄糖：10g/L，植酸钙：3g/L，MgCl2：5g/L，MgSO4·7H2O：0.25g/L，KCl：0.2g/L，(NH4)2SO4：0.1g/L))，28℃恒温振荡培养7d，设置3个平行，每24h取样；同时，吸取0.2mL的无菌水替代菌悬液，作为阴性对照。

[0039] (4)室温静置15min，将发酵液倒入离心管中，1500rpm离心3min，收集上清液A；部分上清液A再次10000rpm离心10min，收集上清B。

[0040] (5)测定菌液浓度：吸取100μL上清液A，加入100μL的1M HCl，用分光光度计测定OD600值。

[0041] (6)测定有效磷：

[0042] 吸取适量上清液B于50mL容量瓶中，加入8mL钼锑抗显色液(0.528g抗坏血酸溶于100mL硫酸钼锑贮备液，混合均匀，该溶液需现用现配。硫酸钼锑贮备液：称取经磨细的钼酸铵6.0g溶于200mL水中；称取0.146g酒石酸锑钾溶于50mL水中；量取74mL浓硫酸，缓缓加入
400mL水中，不断搅拌，冷却；将上述三种溶液缓慢混合，冷却后，加水稀释定容至1000mL，摇匀后贮于棕色试剂瓶中)用去离子水定容至50mL，充分摇匀，显色后用分光光度计在880nm下测定溶液吸光值。

[0043] 绘制标准曲线：准确吸取5mg/L磷标准溶液0、1、2、4、6、8、10mL，分别放入50mL容量瓶中，加入钼锑抗试剂5mL，用水定容至50mL。充分摇匀，显色后用分光光度计在880nm下测定溶液吸光值。

[0044] 解磷量(mg/L)＝ρ×V2/V1

[0045] 式中：ρ—待测液中磷的质量浓度(mg/L)；

[0046] V1——吸取上清液B体积(mL)；

[0047] V2——显色的溶液体积(mL)。

[0048] (7)测定pH值：用pH计测定上清液B的pH值。

[0049] 结果如下：

[0050] 溶磷菌Leclercia sp.CYIJM 6在磷酸钙(无机磷)固体培养基中培养5天后，溶磷指数为2.42，解磷量达到430mg/L。

[0051] 溶磷菌Leclercia sp.CYIJM 6在植酸钙(有机磷)固体培养基中培养5天后，解磷指数为2.85，解磷量为228mg/L。

[0052] 由此可以得出，本发明提供的溶磷菌株作用底物广泛，既可以释放有机酸等小分子活化固定态无机磷，也可以分泌磷酸酶水解有机磷，利用该溶磷菌可以显著提高土壤磷素活化能力。

[0053] 实施例3

[0054] 菌剂制备：

[0055] 纯化平板上单克隆菌落接种于5mL LB液体培养基中，28℃180rpm震荡培养过夜。按照1％接种量转接于100mL LB培养基中，28℃，180rpm震荡培养至对数生长期。8000rpm离心10min后，弃上清，收集菌体。菌体重悬于无菌水，8000rpm离心10min，该步骤重复2～3次。
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菌体最终重悬于无菌水至OD600＝1.0的菌剂悬液，细菌浓度约10/mL。

[0056] 实施例4

[0057] 菌株在半干旱地区农田生态系统的应用

[0058] 在朝阳双塔区桃花吐镇设置定位试验(120.594181E，41.720583N)，该地区属于易干旱区，土壤春季质量含水量约12％‑14％。试验开始前土壤经历多年的一年一熟制的传统耕作，种植方式以玉米连作为主。试验采用随机区组设计，主要包括常规施肥(NPK；N：195kg/公顷，P2O5：75kg/公顷，K2O：90kg/公顷)、磷肥减量施用20％(NP80K；N：195kg/公顷，P2O5：60kg/公顷，K2O：90kg/公顷)以及磷肥减量施用20％配施菌剂(NP80KL，N：195kg/公顷，P2O5：60kg/公顷，K2O：90kg/公顷，实施例3制备的菌剂：40‑50L/公顷)3个处理，每个处理4次
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重复。每个小区面积为70m (7m×10m)，种植作物为玉米。收获期测定作物产量与土壤有效磷含量。

[0059] 1、作物产量测定：玉米成熟期，称取具有代表性的面积S(3垄宽×5m长为取样范围，记录垄距计算面积)内所有果穗重，再根据平均穗重法取10穗具有代表性的果穗进行出籽率和含水量计算，后根据样点面积、果穗数量、实际鲜重、出籽率、含水量计算出实际产量。产量(14％含水量)(kg/亩)＝(666.7÷样点面积)×样点总穗数×每穗样品平均籽粒鲜重×(1‑样品籽粒含水量)÷(1‑14％)×0.85(注：0.85为测产系数，为矫正人为误差用)。

[0060] 2、土壤样品采集:在试验处理的每个小区内，除去表层杂物后，按照五点取样法用直径为3cm土钻采集0‑10和10‑20cm土层的土壤样品。将同一土层的5个采样点的土样混合，去除石子、植物根系等杂质后过2mm筛，并均匀混合成一个土壤样品，自然风干后测定土壤有效磷含量。

[0061] 结果如表1：

[0062] 表1实验结果

[0063] NPK NP80K NP80KL产量(kg/亩) 658.3±17.1 630.6±6.8 647.6±24.7
有效磷(mg/kg) 37.4±1.6 36.5±4.4 40.6±5.2

[0064] 该菌株制备菌剂后，可作为磷素增效剂、活化剂及农用微生物菌剂使用。将该溶磷菌与化学肥料配施，可以提高土壤有效磷含量和肥料利用效率，从而减少磷肥的施用20％，仍可保证作物稳产，土壤有效磷含量提高8.6％。

[0065] 尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。