一种糖基转移酶突变体及其编码基因

摘要

本发明公开了一种糖基转移酶突变体及其编码基因，Reb D甜度高、无苦味和甘草余味，是非常优质的代糖选择，Reb D的生产成本高是限制其作为甜味剂推广的主要原因。本发明设计的三种植物来源突变的糖基转移酶，可以野生型3倍左右的量在微生物中高量表达。同时表达得到的突变体的热稳定性也明显优于野生型。因此，本发明公开的三种糖基转移酶的突变体参与的Red A催化生成Red D的酶催化反应体系可以在较高温度下进行，这样可以明显提高该反应体系的催化效率，提高Red D的生产效率。

权利要求

1.一种糖基转移酶突变体，其特征在于，所述糖基转移酶突变体为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的变体1或氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的变体2，或氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的变体3。

2.一种重组基因，其特征在于所述重组基因为能够表达如权利要求1所述的糖基转移酶突变体的DNA。

3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包括如权利要求2所述的重组基因。

说明书

一种糖基转移酶突变体及其编码基因

技术领域

[0001] 本发明涉及生物工程领域，更具体的是涉及一种糖基转移酶突变体及其编码基因。

背景技术

[0002] 甜菊糖，又名甜菊糖苷，具有高甜度(蔗糖的300～450倍)、低热值(蔗糖的1/300)等特点，天然蔗糖替代品，被誉为“世界第三糖原”。甜菊糖从甜叶菊中萃取得到，生产商们在甜叶菊中提取出的甜菊糖中大都是甜菊苷(Stevioside,STV)和莱鲍迪苷A（Rebaudioside A，Reb A）。但是STV和Reb A具有苦味和甘草余味，这大大限制了甜菊糖苷作为甜味剂在食品中的应用。

[0003] 研究发现莱鲍迪苷D（Rebaudioside D，Reb D）保持了甜菊糖高甜度和低热值的优点的同时，还不具有苦味和甘草余味，是非常优质的代糖选择。然而Reb D的规模生产存在较大的瓶颈：Reb D在甜叶菊中占比不到1％，通过植物提取生产Reb D的成本高昂。糖基转移酶基本为植物来源，其在微生物中的表达量较少，这导致目前通过微生物发酵法或者酶催化法生产Reb D的成本也处于较高水平。因此，如何提高植物来源的糖基转移酶在微生物中的表达量是目前亟待解决的技术问题。

发明内容

[0004] 针对现有技术存在的不足，本发明的目的之一在于提供一种可在微生物中高表达量的植物源糖基转移酶的氨基酸序列。

[0005] 为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种糖基转移酶，其野生型序列如SEQ ID NO.1所示。该野生型糖基转移酶来源于Solanum lycopersicum，NCBI Reference Sequence: XP_004250485.1。对上述野生型糖基转移酶进行以下位点突变，得到氨基酸序列如SEQID NO.2所示的变体1：

[0006] L5I‑L34H‑R41P‑I48K‑A56S‑I62V‑N87M‑P88N‑H91K‑P99S‑R103K‑N127S‑E128S‑Q129H‑C140G‑S149H‑E167D‑V168Y‑V171K‑T202E‑C211L‑T212R‑G244D‑T245K‑D266E‑V270I‑F272H‑S277A‑A285V‑K301E‑R312I‑T329I‑G331A‑A341L‑I356F‑P361F‑G387E‑T392V‑L393I‑S395K‑K414E‑I419K‑A426E。

[0007] 对上述野生型糖基转移酶进行以下位点突变，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的变体2：

[0008] L5I‑L34H‑I48K‑I62V‑N87M‑P88N‑H91K‑P99S‑N127S‑E128S‑Q129H‑C140G‑S149H‑V168Y‑T202E‑C211L‑T212R‑G244D‑D266E‑V270I‑F272H‑S277A‑A285V‑R312I‑T329I‑G331A‑A341L‑I356F‑P361F‑G387E‑T392V‑L393I‑S395K‑I419K‑A426E。

[0009] 对上述野生型糖基转移酶进行以下位点突变，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的变体3：

[0010] L5I‑I48K‑N87L‑P99S‑S149H‑T202E‑C211L‑G244D‑V270I‑S277T‑A285V‑I356F‑P361F‑G387E‑L393I‑I419K。

[0011] 本发明突变后的三种糖基转移酶在大肠杆菌中的表达量是野生型的3倍左右，最高的UGTSL2‑2更是达到了3.24倍，极大地提高了植物来源的糖基转移酶在大肠杆菌中的表达量，降低了Reb D的生产成本，有利于Reb D工业化生产的推广。

[0012] 针对现有技术存在的不足，本发明的目的之二在于提供一种可在微生物中表达上述糖基转移酶的重组基因。

[0013] 针对现有技术存在的不足，本发明的目的之三在于提供一种包括上述重组基因的重组质粒。

[0014] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明设计的三种植物来源突变的糖基转移酶，可在微生物中高量表达。具体地，野生型糖基转移酶在大肠杆菌中的表达量为3.4g/L，突变后的三种突变体在大肠杆菌中的表达量分别达到10.2g/L，11.0g/L，8.5g/L，。突变后的三种糖基转移酶在大肠杆菌中的表达量是野生型的3倍左右，最高的突变体更是达到了3.24倍，极大地提高了植物来源的糖基转移酶在大肠杆菌中的表达量，降低了Reb D的生产成本。同时野生型的糖基转移酶在40℃下孵育30mi n，酶活降低至55％左右，突变后得到的三种突变体40℃下孵育30mi n，酶活分别降低至79％左右、92％左右和酶活没有降低。因此，经过突变改造，本发明提供的三种糖基转移酶变体不仅提高了其在大肠杆菌中的表达量，热稳定性也明显得到了改善，其参与的Red A催化生成Red D的酶催化反应体系可以在较高温度下反应，这样可以明显提高该反应体系的催化效率，提高Red D的生产效率。

附图说明

[0015] 图1为UGTSL2、UGTSL2‑1、UGTSL2‑2和UGTSL2‑3的蛋白胶图；

[0016] 图2为莱鲍迪苷D的反应流程图；

[0017] 图3为UGTSL2在30℃，40℃，50℃孵育不同时间的剩余酶活图；

[0018] 图4为UGTSL2、UGTSL2‑1、UGTSL2‑2和UGTSL2‑3分别在40℃下孵育30mi n的剩余酶活图。

具体实施方式

[0019] DNA构建体，是指能表达出本发明的糖基转移酶及糖基转移酶变体的序列。通常，DNA构建体通过PCR或本领域已知的其他合适技术在体外合成。在某些实施方案中，DNA构建体还包括其他附件元件，如控制元件(如启动子等)。DNA构建体还可以包括标记物质(如荧光等)。DNA构建体还可以包括不影响目的基因表达的其他序列。

[0020] 术语“表达”是指DNA转录成信使RNA（mRNA）然后翻译成蛋白质的过程。

[0021] “表达载体”具有在宿主细胞中掺入和表达异源多核酸片段的能力。许多原核和真核表达载体是市售的。选择合适的表达载体在技术人员的知识范围内。

[0022] 术语“宿主细胞”是指用于表达包含本发明DNA的合适宿主载体。宿主可以包含任何能够包含和表达本文所公开的核酸或基因的生物体，但不限于此。宿主可以是原核生物或真核生物，单细胞或多细胞，包括哺乳动物细胞、植物细胞、真菌等。单细胞宿主的例子包括埃希氏菌、沙门氏菌、芽孢杆菌、梭菌、链霉菌、葡萄球菌、奈瑟菌、乳酸杆菌、志贺氏菌和支原体的细胞。合适的大肠杆菌菌株（包括许多其他菌株）包括BL21（DE3），C600，DH5αF′，1113101，JM83，JM101，JM103，JM105，JM107，JM109，JM110，MC1061，MC4100，MM294，NM522，NM554，TGI，χ1776，XL1‑Blue和Y1089 +，所有这些都是市售的。

[0023]  “同源性”是指序列相似性或序列同一性。同源性是使用本领域已知的标准技术确定的（参见，例如，史密斯和沃特曼，高级应用数学，2：482，1981;Needleman and Wunsch， J.Mol. Biol.， 48：443， 1970;皮尔逊和利普曼，美国科学院院刊85：2444，1988年;威斯康星州遗传学软件包中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA 等程序（威斯康星州麦迪逊市遗传学计算机组）;和德弗勒等人，核酸研究， 12：387‑395， 1984）.一个非限制性的例子包括使用BLAST程序（Altschul等人，Gapped BLAST和PSI‑BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序，Nucleic Acid Res. 25：3389‑3402，1997）来识别可以说是“同源”的序列。最新版本，如 2.2.16、2.2.17、2.2.18、2.2.19 或最新版本，包括用于蛋白质‑蛋白质比较的 blastp、用于核苷酸‑核苷酸比较的 blastn、用于蛋白质‑核苷酸比较的 tblastn 或用于核苷酸‑蛋白质比较的 blastx，参数如下：返回的最大序列数为 10，000 或 100，000;E值（期望值）为−2 −5
1e 或1e ，字数为3，评分矩阵BLOSUM62，差距成本存在11，差距成本扩展1，可能合适。例−5
如，E 值为 1e 表明随机发生同源匹配的几率约为 1/10，000，从而标志着真实同源性的高置信度。

[0024] 术语“同一性”，意味着两个序列中的残基在比对最大对应时是相同的，如使用诸如本文描述的那些序列比较或分析算法测量的那样。例如，如果在正确对齐时，两个序列的相应片段在 10 个位置中的 5 个位置具有相同的残基，则说这两个序列具有 50% 的同一性。大多数生物信息学程序报告了比对序列区域的百分比同一性，这些区域通常不是整个分子。如果对齐足够长并且包含足够多的相同残基，则可以计算期望值，这表明对齐中的同一级别不太可能随机发生。

[0025] 下面结合附图和实施例，对本发明进一步详细说明。

[0026] 实施例1

[0027] 蛋白质序列中包含丰富的进化信息，对于提升蛋白质的热稳定性具有至关重要的作用。领域内已经开发了很多经典的共进化分析方法，这些方法基于同源序列比对文件，使用基于物理能量的Potts模型，通过不断降低同源序列的能量，得到蛋白质序列中的共进化信号。但是，同源序列中存在源自系统生成树的噪声，严重影响了模型的精度。为此，发明人提出了平均乘积修正的后处理方法，但是这种方法仅对预测蛋白质接触图有效，无法消除噪声对共进化蛋白质设计算法的影响。发明人基于经典的蛋白质共进化分析方法Gremlin，提出了谱范数惩罚项。在Gremlin的优化过程中，谱范数惩罚项可以抑制共进化矩阵的最大特征值，进而降低系统生成噪声。基于计算得到的进化矩阵，发明人设计了逐代最优单点突变的贪婪算法，不断增强野生型糖基转移酶（氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示）中的进化信号，最终得到了计算层面上最优的酶变体（基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示）。

[0028] 具体地，本发明以野生型糖基转移酶（UGTSL2，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示）作为母体，进行以下点突变：L5I‑L34H‑R41P‑I48K‑A56S‑I62V‑N87M‑P88N‑H91K‑P99S‑R103K‑N127S‑E128S‑Q129H‑C140G‑S149H‑E167D‑V168Y‑V171K‑T202E‑C211L‑T212R‑G244D‑T245K‑D266E‑V270I‑F272H‑S277A‑A285V‑K301E‑R312I‑T329I‑G331A‑A341L‑I356F‑P361F‑G387E‑T392V‑L393I‑S395K‑K414E‑I419K‑A426E，得到糖基转移酶变体‑1（UGTSL2‑1，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示）。

[0029] 或者以野生型糖基转移酶（氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示）作为母体，进行以下点突变：L5I‑L34H‑I48K‑I62V‑N87M‑P88N‑H91K‑P99S‑N127S‑E128S‑Q129H‑C140G‑S149H‑V168Y‑T202E‑C211L‑T212R‑G244D‑D266E‑V270I‑F272H‑S277A‑A285V‑R312I‑T329I‑G331A‑A341L‑I356F‑P361F‑G387E‑T392V‑L393I‑S395K‑I419K‑A426E,得到糖基转移酶变体‑2（UGTSL2‑2，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示）。

[0030] 或者以野生型糖基转移酶（氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示）作为母体，进行以下点突变：L5I‑I48K‑N87L‑P99S‑S149H‑T202E‑C211L‑G244D‑V270I‑S277T‑A285V‑I356F‑P361F‑G387E‑L393I‑I419K，得到糖基转移酶变体‑3（UGTSL2‑3，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示）。

[0031] DNA构建体的构建：

[0032] 目的基因（UGTSL2、UGTSL2‑1、UGTSL2‑2和UGTSL2‑3）的核苷酸序列均由北京擎科生物科技有限公司合成，并将这些核苷酸序列插入到表达载体中，具体地，插入到pET21b(+)的NdeI和XhoI酶切位点处，从而获得相对应的质粒。随后将合成的质粒pET21b‑UGTSL2、pET21b‑UGTSL2‑1、pET21b‑UGTSL2‑2、pET21b‑UGTSL2‑3转入宿主细胞（E. coliBL21(DE3)）中,由此构建了含有不同质粒的大肠杆菌菌株。

[0033] UGTSL2、UGTSL2‑1、UGTSL2‑2和UGTSL2‑3的表达与纯化：

[0034] 按照1%的接种量接菌至2 YT培养基（16 g/L蛋白胨，10 g/L 酵母提取物，5 g/L氯化钠）中，表达菌株摇菌，OD600达到0.6‑0.8时添加IPTG（终浓度0.1 mM）16℃,180rpm诱导过夜培养。8000 g离心10分钟收集细胞，将菌体称重定量。用裂解缓冲液20mM Tris,300mM NaCl (pH=8) 按照培养基的1/10重悬菌体。超声破碎（裂解液1 min/ mL），随后在4℃，15000 g离心30 min，分离上清和沉淀。使用NTA‑0 (30mL), NTA‑20 (30mL) 洗脱杂蛋白，考马斯亮蓝检测洗脱液至不显蓝色，使用 NTA‑40 (5mL), NTA‑60 (10mL),NTA‑150（20mL）收集目标蛋白上清 20 μL加4μL电泳上样缓冲液，100℃水浴5 min,取1μL上样，130 V电泳
70 min，进行SDS‑PAGE分析，测定结果如图1所示。

[0035] 蛋白表达量测定：将过夜诱导的UGTSL2、UGTSL2‑1、UGTSL2‑2和UGTSL2‑3收集菌体并称重，按照1g菌体/10 mL裂解缓冲液20mM Tris,300mM NaCl (pH=8.0) 进行重悬，将各突变体超声破碎（裂解液1 min/mL）后，4℃，15000 g离心30 min，取20 μL上清样品加5 μL loading buffer（电泳上样缓冲液），100℃水浴5 min,取1 μL上样，130 V电泳大约70 min（时间可适当延长），随后进行考马斯亮蓝染色，并通过软件BandScan 5.0分析蛋白胶（蛋白胶图如图1所示）中各突变体目的蛋白的表达量，分析结果如表1所示。

[0036] 表1

[0037]蛋白 UGTSL2 UGTSL2‑1 UGTSL2‑2 UGTSL2‑3
表达量（g/L） 3.4 10.2 11.0 8.5

[0038] 由表1可知，本发明突变后的三种糖基转移酶在大肠杆菌中的表达量是野生型的3倍左右，最高的UGTSL2‑2更是达到了3.24倍，极大地提高了植物来源的糖基转移酶在大肠杆菌中的表达量，降低了Reb D的生产成本，有利于Reb D工业化生产的推广。

[0039] UGTSL2、UGTSL2‑1、UGTSL2‑2和UGTSL2‑3的热稳定性测定：

[0040] 反应体系 : 3 mM MgCl2，0.5 mMRedA,0.1g/L糖基转移酶， 2 mMUDP‑葡萄糖, 100 mM硫酸盐缓冲液（pH 8）；

[0041] 标准曲线：将Reb D配制成不同浓度溶液：0.01 mM、0.02 mM、0.05 mM、0.1 mM、0.2 mM、0.4 mM、0.6mM、1mM，HPLC检测统计面积，绘制标准曲线。

[0042] HPLC条件：LC‑2030C HT系统(SHIMADZU, Japan)，水 (0.1%甲酸)/乙腈(0.1%甲酸)梯度洗脱（0 min: 25%乙腈  ,75%水;12 min:47%乙腈,53%水;15 min:100%乙腈,0%水;17 min:100%ACN,0%水;17.1min:25%乙腈,75%水;20 min:25%乙腈,75%水），流速0.8mL/min，210 nm, TC‑C18 色谱柱(250 mm × 4.6 mm)，柱温40 ℃。

[0043] 莱鲍迪苷A和UDP‑葡萄糖在糖基转移酶的催化下得到莱鲍迪苷D和UDP，具体反应方程式如图2所示。

[0044] 将UGTSL2在30℃，40℃，50℃孵育不同时间（0 h,0.5 h,1 h,2 h,4 h,6 h,24 h）后，按照上述反应体系配制反应液，将反应液置于30℃水浴锅中反应1h后，将反应体系置于95℃水浴10 min终止反应，经0.22 µM 的滤膜过滤，HPLC检测分析，检测结果如图3所示。

[0045] 由图3可知，野生型糖基转移酶在30℃下孵育6h，酶活降低至70%左右，40℃下孵育30min，酶活降低至55%左右，50℃下迅速失活。综上所述，野生型糖基转移酶的热稳定性较差。

[0046] 将UGTSL2、UGTSL2‑1、UGTSL2‑2和UGTSL2‑3分别在40℃下孵育30min，按照上述反应体系配制反应液，将反应液置于30℃水浴锅中反应1h后，将反应体系置于95℃水浴10 min终止反应，经0.22 µM 的滤膜过滤，HPLC检测分析，检测结果如图4所示。

[0047] 由图4可知，突变后得到的糖基转移酶变体‑1（UGTSL2‑1），40℃下孵育30min，酶活降低至79%左右，糖基转移酶变体‑2（UGTSL2‑2）酶活降低至92%左右，糖基转移酶变体‑3（UGTSL2‑3）酶活没有降低（实验数据显示为102%左右，该数据的偏差在实验误差范围内）。综上所述，经过突变改造，本发明提供的三种糖基转移酶变体的热稳定性明显得到了改善，其参与的Red A催化生成Red D的酶催化反应体系可以较高温度进行，这样可以明显提高该反应体系的催化效率，提高Red D的生产效率。

[0048] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通研究人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。