木薯InDel标记及其应用转让专利
申请号 : CN202211168360.3
文献号 : CN116004888B
文献日 : 2023-10-27
发明人 : 王明 , 陆佳毓 , 叶剑秋 , 肖鑫辉 , 张洁 , 陆小静 , 薛茂富 , 韦卓文 , 万仲卿 , 符乃方
申请人 : 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所
摘要 :
本发明提供了一种InDel引物对及其应用。采用本发明的InDel引物对对木薯进行PCR扩增，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测或者测序，即可根据电泳条带或者测序结果区分出巴西14号或COL1395，可以在木薯生长任意时期随时检测，对于区分木薯种质具有重要意义。此外，本发明的InDel引物对与其他17对InDel引物合作，InDel标记聚类分析结果揭示了72份木薯种质资源的遗传多样性，各标记的基因多样性指数于0.21～0.50之间，香农多样性指数于0.36～0.70之间。聚类分析结果显示在遗传相似系数0.62处，72份木薯材料被划分为2个类群。本发明为木薯育种工作后续开展奠定一定的基础。
权利要求 :
1.一种用于鉴别木薯材料COL1395的InDel引物组，其特征在于，其包含序列为GTGTGTCAAGGGGCAACTTT和TAAATATGCCACCACCAGCA的引物对，还包含引物对IDC06、和/或IDC07、和/或IDC17、和/或IDC21、和/或IDC28、和/或IDC43、和/或IDC50、和/或IDC51、和/或IDC53、和/或IDC56；
引物对IDC06组成为：CGAGGTTAGGTTCAACGCAT和ACACGGACAAACTTCCAAGC；
引物对IDC07组成为：GGCTATGGCTTGGAAATTGA和AATTGATTCAGCAAATGGGC；
引物对IDC17组成为：ATACGTGTCGTGCGATCAGA和TTCACACAGCTGCAGGAATC；
引物对IDC21组成为：CGTGCATCCTTTTTCATCAC和CCGTGAAACAAACAAAGCCT；
引物对IDC28组成为：CGGTTGCTATGGATGGAGTT和AAGGGATGATCCAAAGACCC；
引物对IDC43组成为：ATGCGTTTGAAGGGAGAATG和CGAAAACCGCCAAATAAAAG；
引物对IDC50组成为：ACGATCGTTACAAAGGGACG和ACCAAACCAACCCTTCTCCT；
引物对IDC51组成为：TGGACATGTTTTCTGGGCTT和GGAAATGCCTTTGTGCTGTT；
引物对IDC53组成为：GTTCTCAGGACCTTTGCAGG和GGCAATTGGCGTTTAGTCTG；
引物对IDC56组成为：TGATAGGCTGCAACTCATGG和GCCAAAGGAGGAGGAGGTAG。
2.包含权利要求1所述InDel引物组的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，其还包括进行PCR反应和/或电泳所需的试剂。
4.如权利要求1所述的InDel引物组、或者权利要求2或3所述的试剂盒在鉴别木薯材料COL1395中的应用，采用GTGTGTCAAGGGGCAACTTT和TAAATATGCCACCACCAGCA的引物对进行PCR扩增，如果鉴定出待测品存在184bp及170bp的目的条带或目的片段，再采用所述引物对IDC06、和/或IDC07、和/或IDC17、和/或IDC21、和/或IDC28、和/或IDC43、和/或IDC50、和/或IDC51、和/或IDC53、和/或IDC56对待测品进行PCR扩增，对扩增结果进行凝胶电泳检测或者测序检测；
引物对IDC06的扩增条带或扩增片段为152bp和173bp，待测品为COL1395；
引物对IDC07无扩增条带或扩增片段，待测品为COL1395；
引物对IDC17的扩增条带或扩增片段为275bp和311bp，待测品为COL1395；
引物对IDC21的扩增条带或扩增片段为319bp，待测品为COL1395；
引物对IDC28的扩增条带或扩增片段为209bp，待测品为COL1395；
引物对IDC43的扩增条带或扩增片段为133bp，待测品为COL1395；
引物对IDC50的扩增条带或扩增片段为129bp，待测品为COL1395；
引物对IDC51的扩增条带或扩增片段为360bp，待测品为COL1395；
引物对IDC53的扩增条带或扩增片段为286bp，待测品为COL1395；
引物对IDC56的扩增条带或扩增片段为184bp和187bp，待测品为COL1395。
5.一种鉴别木薯材料COL1395的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的InDel引物组、或者权利要求2或3所述的试剂盒进行鉴别，具体为：采用GTGTGTCAAGGGGCAACTTT和TAAATATGCCACCACCAGCA的引物对进行PCR扩增，如果鉴定出待测品存在184bp及170bp的目的条带或目的片段，再采用所述引物对IDC06、和/或IDC07、和/或IDC17、和/或IDC21、和/或IDC28、和/或IDC43、和/或IDC50、和/或IDC51、和/或IDC53、和/或IDC56对待测品进行PCR扩增，对扩增结果进行凝胶电泳检测或者测序检测；
引物对IDC06的扩增条带或扩增片段为152bp和173bp，待测品为COL1395；
引物对IDC07无扩增条带或扩增片段，待测品为COL1395；
引物对IDC17的扩增条带或扩增片段为275bp和311bp，待测品为COL1395；
引物对IDC21的扩增条带或扩增片段为319bp，待测品为COL1395；
引物对IDC28的扩增条带或扩增片段为209bp，待测品为COL1395；
引物对IDC43的扩增条带或扩增片段为133bp，待测品为COL1395；
引物对IDC50的扩增条带或扩增片段为129bp，待测品为COL1395；
引物对IDC51的扩增条带或扩增片段为360bp，待测品为COL1395；
引物对IDC53的扩增条带或扩增片段为286bp，待测品为COL1395；
引物对IDC56的扩增条带或扩增片段为184bp和187bp，待测品为COL1395。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括提取待分析木薯的基因组DNA。
说明书 :
木薯InDel标记及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种木薯InDel标记及其应用。
背景技术
[0002] 木薯（Manihot esculenta Crantz）属于大戟科，为世界第六大重要作物之一，同甘薯、马铃薯并列为世界三大薯类作物。原产巴西，起初源于美洲，后被非洲、亚洲地区近一百多个国家引进推广种植。于19世纪20年代首次引入我国广东省，现主要分布在我国东南沿海地区，如广西、海南等省区。此外，在福建、江西、湖南和贵州等地也有种植。由于其体内富含大量淀粉广泛应用于工业原料生产，此外还可作为人体所需卡路里来源，因此成为目前世界上近10亿人的主食。作为重点粮食作物及工业重要原材料，在国际畜牧、化工、食品、环保等行业都具有重要地位。
[0003] 自木薯引入我国至今已有近两百年历史，目前我国研究学者已经从引进的种质中筛选出一系列主要植物品种。由于其遗传背景复杂、种质资源多样，我国对其种质材料的收集保存及育种工作开展进度较慢。然而育种工作的突破与否取决于品种间资源遗传多样性程度，因此分析种群间遗传多样性对于物种育种工作具有重大意义。据前人报道，分子标记具有遗传稳定、不易受环境、取材影响等优点。当前已被证为种质资源分析及鉴定评价有价值的工具，因其具有遗传稳定、不易受环境、取材影响等优点。目前已有学者利用SRAP (Sequence‑related amplified polymorphism)、SSR (Simple Sequence Repeats)、AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)、RAPD (random amplified polymorphic DNA)等标记对木薯种质进行遗传多样性分析。InDel标记（insertion‑deletion）是指种群间由于不同个体等位基因点序列发生了核苷酸片段插入、缺失造成个体变异，即对同源序列进行对比后发现gap。InDel与SNP相比，其应用更加快捷，利用电泳技术平台就可以进行快捷的检测，对设施和方法要求较简单。还有学者将其与SSR扩增结果进行比对，发现其稳定性及分离效果均优于SSR。除此以外，InDel标记还具有开发成本低、在基因组中广泛分布等优点，因此在农作物领域逐渐成为研究热门，被大量开发及利用，如辣椒、油菜、番茄、陆地棉、芥兰等。但当前利用InDel标记应用于木薯种质资源相关分析的研究报告仍较少。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种木薯InDel标记及其应用。
[0005] 本发明的第一个方面是提供一种InDel引物对，其特征在于，所述InDel引物对的组成包括GTGTGTCAAGGGGCAACTTT（SEQ ID NO. 25）和TAAATATGCCACCACCAGCA（SEQ ID NO. 26）。
[0006] 采用本发明第一个方面所述的InDel 标记引物对对木薯进行PCR扩增，扩增产物经电泳检测或者测序，即可根据电泳条带或者测序结果从72份木薯种质中直接鉴定出木薯材料巴西14号或COL1395，本领域技术人员只需再结合其他引物电泳条带或者测序结果进行巴西14号和COL1395区分即可，大大简化了巴西14号和COL1395的鉴定过程。比如IDC06在巴西14号中仅于152 bp处扩增出条带，而在COL1395中则于152bp、173bp处均扩增出条带，又比如IDC43在巴西14号中于133 bp、140 bp处扩增出了条带，在COL1395中仅于133bp处扩增出条带。除此之外，IDC03、IDC07、IDC17、IDC21、IDC28、IDC50、IDC51、IDC53、IDC56、IDC49也均可用于两份木薯材料后续鉴定（表3）。在实际应用中，比如实际已知待测木薯为巴西14号和其他非COL1395的木薯，则可应用本第一个方面所述的InDel 标记引物对简单地区分出巴西14号。
[0007] 本发明的第二个方面是提供一种InDel引物组，其包含本发明第一个方面所述的引物对，还包含引物对IDC03、和/或IDC06、和/或IDC07、和/或IDC17、和/或IDC21、和/或IDC28、和/或IDC43、和/或IDC49、和/或IDC50、和/或IDC51、和/或IDC53、和/或IDC56；
[0008] 引物对IDC03组成包括：AGAGTCGCACGAGGTGAGAT（SEQ ID NO.1）和TCCCAGATGCTTCTTTTGCT（SEQ ID NO.2）；
[0009] 引物对IDC06组成包括：CGAGGTTAGGTTCAACGCAT（SEQ ID NO.3）和ACACGGACAAACTTCCAAGC（SEQ ID NO.4）；
[0010] 引物对IDC07组成包括：GGCTATGGCTTGGAAATTGA（SEQ ID NO.5）和AATTGATTCAGCAAATGGGC（SEQ ID NO.6）；
[0011] 引物对IDC17组成包括：ATACGTGTCGTGCGATCAGA（SEQ ID NO.9）和TTCACACAGCTGCAGGAATC（SEQ ID NO.10）；
[0012] 引物对IDC21组成包括：CGTGCATCCTTTTTCATCAC（SEQ ID NO.11）和CCGTGAAACAAACAAAGCCT（SEQ ID NO.12）；
[0013] 引物对IDC28组成包括：CGGTTGCTATGGATGGAGTT（SEQ ID NO.17）和AAGGGATGATCCAAAGACCC（SEQ ID NO.18）；
[0014] 引物对IDC43组成包括：ATGCGTTTGAAGGGAGAATG（SEQ ID NO.23）和CGAAAACCGCCAAATAAAAG（SEQ ID NO.24）；
[0015] 引物对IDC49组成包括：TGGGGGAATTTATGACATCG（SEQ ID NO.39）和AGGCGGCTAGGGTTTCTTAC（SEQ ID NO.40）；
[0016] 引物对IDC50组成包括：ACGATCGTTACAAAGGGACG（SEQ ID NO.27）和ACCAAACCAACCCTTCTCCT（SEQ ID NO.28）；
[0017] 引物对IDC51组成包括：TGGACATGTTTTCTGGGCTT（SEQ ID NO.29）和GGAAATGCCTTTGTGCTGTT（SEQ ID NO.30）；
[0018] 引物对IDC53组成包括：GTTCTCAGGACCTTTGCAGG（SEQ ID NO.31）和GGCAATTGGCGTTTAGTCTG（SEQ ID NO.32）；
[0019] 引物对IDC56组成包括：TGATAGGCTGCAACTCATGG（SEQ ID NO.33）和GCCAAAGGAGGAGGAGGTAG（SEQ ID NO.34）。
[0020] 本发明的第二个方面是提供包含本发明第一个方面所述的InDel引物对或者本发明第二个方面所述InDel引物组的试剂盒。
[0021] 优选地，所述试剂盒还包括进行PCR反应和/或电泳所需的试剂。
[0022] 本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的InDel引物对或者本发明第二个方面所述的试剂盒在区分木薯种质中的应用。
[0023] 本发明的第五个方面是提供一种区分木薯种质的方法，采用本发明第一个方面所述的InDel引物对、或者本发明第二个方面所述的InDel引物组、或者本发明第三个方面所述的试剂盒进行。
[0024] 优选地，所述方法包括如下步骤：
[0025] （1）提取待分析木薯的基因组DNA；
[0026] （2）以步骤(1)待测品DNA为模板，应用本发明第一个方面所述的InDel引物对进行PCR扩增；
[0027] （3）对扩增结果进行凝胶电泳检测或者测序检测；
[0028] （4）根据检测结果对不同木薯种质进行区分，检测结果显示存在与目的条带或目的片段大小一致的条带或片段的是木薯材料巴西14号或COL1395，不存在与目的条带或目的片段大小一致的条带或片段的是其他木薯材料，目的条带或目的片段为184bp及170bp。
[0029] 待分析木薯为表5所示的木薯种质。
[0030] 采用本发明第一个方面所述的InDel 标记引物对或本发明第二个方面所述的试剂盒对木薯进行PCR扩增，扩增产物经电泳检测或者测序，即可根据电泳条带或者测序结果从72份木薯种质中直接鉴定出木薯材料巴西14号或COL1395，本领域技术人员只需再结合其他引物电泳条带或者测序结果进行巴西14号和COL1395区分即可，大大简化了巴西14号和COL1395的鉴定过程。比如IDC06在巴西14号中仅于152 bp处扩增出条带，而在COL1395中则于152bp、173bp处均扩增出条带，又比如IDC43在巴西14号中于133 bp、140 bp处扩增出了条带，在COL1395中仅于133bp处扩增出条带。除此之外，IDC03、IDC07、IDC17、IDC21、IDC28、IDC50、IDC51、IDC53、IDC56、IDC49也均可用于两份木薯材料后续鉴定（表3）。在实际应用中，比如实际已知待测木薯为巴西14号和其他非COL1395的木薯，则可应用本第一个方面所述的InDel 标记引物对简单地区分出巴西14号。
[0031] 在实际应用中，如果鉴定出待测品具有184bp及170bp的目的条带或目的片段，但不能确定是巴西14号还是COL1395时，还可采用引物对IDC03和/或IDC06、和/或IDC07、和/或IDC17、和/或IDC21、和/或IDC28、和/或IDC43、和/或IDC49、和/或IDC50、和/或IDC51、和/或IDC53、和/或IDC56对待测品进行PCR扩增，对扩增结果进行凝胶电泳检测或者测序检测：
[0032] 引物对IDC03的扩增条带或扩增片段为164bp，待测品为巴西14号，扩增条带或扩增片段为160bp，待测品为COL1395； 引物对IDC06的扩增条带或扩增片段为152 bp，待测品为巴西14号，扩增条带或扩增片段为152bp、173bp，待测品为COL1395；引物对IDC07的扩增条带或扩增片段为312bp，待测品为巴西14号，无扩增条带或扩增片段，待测品为COL1395；引物对IDC17的扩增条带或扩增片段为275bp，待测品为巴西14号，扩增条带或扩增片段为
275bp、311bp，待测品为COL1395；引物对IDC21的扩增条带或扩增片段为255bp，待测品为巴西14号，扩增条带或扩增片段为319bp，待测品为COL1395；引物对IDC28的扩增条带或扩增片段为190bp，待测品为巴西14号，扩增条带或扩增片段为209bp，待测品为COL1395；引物对IDC43的扩增条带或扩增片段为133 bp、140 bp，待测品为巴西14号，扩增条带或扩增片段为133bp，待测品为COL1395；引物对IDC49的扩增条带或扩增片段为115bp，待测品为巴西14号，扩增条带或扩增片段为122bp，待测品为COL1395；引物对IDC50的扩增条带或扩增片段为129bp、134bp，待测品为巴西14号，扩增条带或扩增片段为129bp，待测品为COL1395；引物对IDC51的扩增条带或扩增片段为360bp、264bp，待测品为巴西14号，扩增条带或扩增片段为360bp，待测品为COL1395；引物对IDC53的扩增条带或扩增片段为286bp、248bp，待测品为巴西14号，扩增条带或扩增片段为286bp，待测品为COL1395；引物对IDC56的扩增条带或扩增片段为184bp，待测品为巴西14号，扩增条带或扩增片段为184bp、187bp，待测品为COL1395。
275bp、311bp，待测品为COL1395；引物对IDC21的扩增条带或扩增片段为255bp，待测品为巴西14号，扩增条带或扩增片段为319bp，待测品为COL1395；引物对IDC28的扩增条带或扩增片段为190bp，待测品为巴西14号，扩增条带或扩增片段为209bp，待测品为COL1395；引物对IDC43的扩增条带或扩增片段为133 bp、140 bp，待测品为巴西14号，扩增条带或扩增片段为133bp，待测品为COL1395；引物对IDC49的扩增条带或扩增片段为115bp，待测品为巴西14号，扩增条带或扩增片段为122bp，待测品为COL1395；引物对IDC50的扩增条带或扩增片段为129bp、134bp，待测品为巴西14号，扩增条带或扩增片段为129bp，待测品为COL1395；引物对IDC51的扩增条带或扩增片段为360bp、264bp，待测品为巴西14号，扩增条带或扩增片段为360bp，待测品为COL1395；引物对IDC53的扩增条带或扩增片段为286bp、248bp，待测品为巴西14号，扩增条带或扩增片段为286bp，待测品为COL1395；引物对IDC56的扩增条带或扩增片段为184bp，待测品为巴西14号，扩增条带或扩增片段为184bp、187bp，待测品为COL1395。
[0033] 本发明的第六个方面是提供如本发明第一个方面所述的InDel引物对、或者本发明第二个方面所述的InDel引物组、或者本发明第三个方面所述的试剂盒在木薯遗传多样性分析中的应用。
[0034] 遗传多样性分析包括但不限于分析有效等位基因数、基因多样性指数、香浓多样性指数等遗传参数，构建UPMGA聚类树状图等。
[0035] 在本发明的一个具体实施方式中，本发明第一个方面所述的InDel引物对与SEQ ID NO. 1 24以及SEQ ID NO. 27‑36所示的18对InDel引物对合作来进行木薯遗传多样性~分析。采用本发明第一个方面所述的InDel引物对与SEQ ID NO. 1 24以及SEQ ID NO. 27‑~
36所示的18对InDel引物对72份木薯种质（表5）进行扩增，根据扩增出的基因组DNA多态性条带对待分析木薯进行遗传多样性分析，结果显示各标记的基因多样性指数于0.21 0.50~
之间，香农多样性指数于0.36 0.70之间。聚类分析结果显示在遗传相似系数0.62处，72份~
木薯材料被划分为2个类群。
36所示的18对InDel引物对72份木薯种质（表5）进行扩增，根据扩增出的基因组DNA多态性条带对待分析木薯进行遗传多样性分析，结果显示各标记的基因多样性指数于0.21 0.50~
之间，香农多样性指数于0.36 0.70之间。聚类分析结果显示在遗传相似系数0.62处，72份~
木薯材料被划分为2个类群。
[0036] 采用本发明的InDel 引物对对木薯进行PCR扩增，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测或者测序，即可根据电泳条带或者测序结果区分出巴西14号或COL1395，可以在木薯生长任意时期随时检测，对于区分木薯种质具有重要意义。此外，本发明的InDel引物对与其他17对InDel引物合作，InDel标记聚类分析结果揭示了72份木薯种质资源的遗传多样性，各标记的基因多样性指数于0.21 0.50之间，香农多样性指数于0.36 0.70之间。聚类~ ~分析结果显示在遗传相似系数0.62处，72份木薯材料被划分为2个类群。本发明为木薯育种工作后续开展奠定一定的基础。
附图说明
[0037] 图1 18分别为表3所示的18对引物在72份木薯材料中的扩增产物电泳图。~
[0038] 图19为引物对IDC49在72份木薯材料中的扩增产物电泳图。
[0039] 图20为72份木薯多样性的UPMGA聚类树状图。
具体实施方式
[0040] 下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0041] 1 木薯材料及田间试验
[0042] 选用22份遗传稳定的木薯材料（22份木薯材料基本信息见表1）用于全基因组重测序。随机选取5份木薯种质材料用于InDel标记有效性鉴定，以及72份木薯材料（72份木薯种质资源基本信息见表5）用于聚类分析。以上材料均于2021年3月种植在中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所国家木薯种质资源圃。
[0043] 表1 22份木薯种质资源基本信息
[0044] 编号 材料名称 种质类型 来源 编号 材料名称 种质类型 来源C4 SC201 选育品种 中国 C37 GR024‑8 选育品种 中国
C6 云南7号 地方品种 中国 C40 CMR37‑14‑9 引进品系 泰国
C9 瑞士W4 引进品系 瑞士 C46 COL739 引进品系 哥伦比亚
C12 ZM8625 品系 中国 C47 瑞士P11 引进品系 瑞士
C15 CM4040‑1 引进品系 哥伦比亚 C49 印尼种 引进品系 印尼
C17 R5 引进品系 泰国 C57 瑞士Q10 引进品系 瑞士
C22 KM98‑6 引进品系 越南 C58 COL2626 引进品系 哥伦比亚
C27 瑞士H19 引进品系 瑞士 C60 R80 引进品系 泰国
C31 巴西7号 引进品系 巴西 C69 桂热5号 选育品种 中国
C35 SC6 选育品种 中国 C71 SC12 选育品种 中国
C6 云南7号 地方品种 中国 C40 CMR37‑14‑9 引进品系 泰国
C9 瑞士W4 引进品系 瑞士 C46 COL739 引进品系 哥伦比亚
C12 ZM8625 品系 中国 C47 瑞士P11 引进品系 瑞士
C15 CM4040‑1 引进品系 哥伦比亚 C49 印尼种 引进品系 印尼
C17 R5 引进品系 泰国 C57 瑞士Q10 引进品系 瑞士
C22 KM98‑6 引进品系 越南 C58 COL2626 引进品系 哥伦比亚
C27 瑞士H19 引进品系 瑞士 C60 R80 引进品系 泰国
C31 巴西7号 引进品系 巴西 C69 桂热5号 选育品种 中国
C35 SC6 选育品种 中国 C71 SC12 选育品种 中国
[0045] 2 全基因组高通量测序及InDel位点挖掘
[0046] 将木薯材料的幼嫩叶片置于液氮中利用CTAB法提取基因组总DNA，并对其浓度、纯度及完整度进行检测，将检测合格的样品分别用于后续文库构建及测序。以上工作均由北京百迈客生物科技有限公司完成。将获得的raw read进行质量评估并过滤得到Clean Reads后将其利用BWA]与参考基因组序列进行比对，基于比对结果进行InDel检测和注释。
[0047] 22份木薯种质资源通过Illumina测序得到的原始数据经过滤后得到671.57G的Clean Data。各样本的clean data之间Q20均在85%以上，GC含量在36.9% 45.04%之间。将~reads与参考基因组对比后，对比率在84.93% 98.60%之间。综上可知，22份木薯种质资源的~
测序质量、GC含量、数据量均合格，可适用于InDel标记的开发。通过与木薯参考基因组序列比对后，共在22份木薯种质资源全基因组内检测出1737846个InDel，其中位于编码区的InDel共15499个。
测序质量、GC含量、数据量均合格，可适用于InDel标记的开发。通过与木薯参考基因组序列比对后，共在22份木薯种质资源全基因组内检测出1737846个InDel，其中位于编码区的InDel共15499个。
[0048] 3 InDel引物设计及标记有效性鉴定
[0049] 对测序结果鉴定到的InDel位点进行筛选，筛选条件为：Insertion/deletion碱基数13bp≥5bp 、测序深度＞10。基于InDel位点在参考基因组（Mesculenta_v7.0）上的位置，取InDel位点上下游各250 bp，利用Primer 5.0进行引物设计。上下游引物设计范围分别为 1‑225 bp和270 501 bp，引物长度20 25 bp之间，退火温度为47‑65℃之间。根据全基因组~ ~
检测出的InDel标记进行随机选择，最终选出InDel位点共64个（表2）。
检测出的InDel标记进行随机选择，最终选出InDel位点共64个（表2）。
[0050] 采用64对InDel引物用于标记有效性鉴定，以随机选取5份木薯种质材料DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系（20ul）：DNA模板（50 100ng/ml） 3ul、 2×Rapid Tap Master ~Mix（Vazyme）10ul、上游引物（20ng/ul）0.3ul、下游引物（20ng/ul）0.3ul、ddH2O 6.4ul。扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性15 s，52 60℃退火15 s，72℃延伸15 s，共32个循环；
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72℃延伸5 min，4℃保持。扩增产物配置3%琼脂糖凝胶电泳进行检测，随后用凝胶成效系统对跑胶结果进行拍照记录，统计条带类型。检测结果中，62对引物扩增出目的条带，2对引物未扩增出条带，有效率达96.88%。对琼脂糖凝胶电泳检测结果进行统计发现64对引物中有
20对引物在5份木薯中具有多态性，多态性率为31.25%。
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72℃延伸5 min，4℃保持。扩增产物配置3%琼脂糖凝胶电泳进行检测，随后用凝胶成效系统对跑胶结果进行拍照记录，统计条带类型。检测结果中，62对引物扩增出目的条带，2对引物未扩增出条带，有效率达96.88%。对琼脂糖凝胶电泳检测结果进行统计发现64对引物中有
20对引物在5份木薯中具有多态性，多态性率为31.25%。
[0051] 表2 64个InDel标记信息
[0052]
[0053] 4 InDel引物鉴定特异性种质资源的应用
[0054] 利用筛选出具有多态性的20对引物对72份种质资源材料进行群体基因分析，发现IDC46扩增条带中，多数材料仅于184bp、198bp处扩增出多态性条带，在两份木薯材料中则于184bp及170bp处扩增出多态性条带。根据条带扩增结果分析，发现IDC46可直接鉴定出特定的木薯材料巴西14号(C38)和COL1395(C70)。将两个特定种质进行鉴定后可结合其他多态性Indel引物电泳条带进行种质区分，如IDC06于巴西14号中的扩增结果中显示，该InDel引物仅于152 bp处扩增出条带，而在COL1395中则于152bp、173bp处均扩增出条带。除此之外，IDC03、IDC06、IDC07、IDC17、IDC21、IDC28、IDC43、IDC50、IDC51、IDC53、IDC56、IDC49均可用于两份木薯材料后续鉴定（表3）。因此利用IDC46进行种质鉴定，并结合上述引物的条带扩增结果统计可直接对木薯材料巴西14号和COL1395进行鉴定区分。
[0055] 若选择多个可鉴定特定木薯材料的特异性InDel引物并将其结合，可为木薯种质资源鉴定工作提供有效工具。以上发现也充分说明InDel标记后期有望用于木薯指纹图谱、分子身份证的构建。
[0056] 表3 其他多态性Indel引物对于巴西14号和COL1395中扩增结果
[0057]
[0058] 5 木薯种质资源遗传多样性分析
[0059] 选取条带清晰具有多态性的InDel标记，以72份木薯种质资源基因组DNA为模板，进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测，与上述方法相同。最终对扩增结果进行拍照统计。最终选择18对扩增效果最优的引物（表2）对72份木薯品种进行PCR扩增。经PCR扩增检测，筛选出来的18对引物均能扩增出目的条带，对18对引物扩增条带类型进行统计，条带统计方法：等位基因处有条带记“1”，无条带记“0”，缺失处记“9”。生成条带矩阵后利用Popgene32计算引物Nei、Shannon等值，并且利用NTSYS‑pc 中UPGMA算法对72份木薯种质资源进行聚类分析。结果如表4‑5和图20所示。
[0060] 由表4可知，在72份木薯种质中，有效等位基因数变化范围为1.2712‑1.9862，IDC53位点扩增的等位基因最少，IDC15位点扩增的等位基因最多，基因多样性指数变化范围为0.2134‑0.4965，香浓多样性指数变化范围为0.3698‑0.6897，有效等位基因数、基因多样性指数、香浓多样性指数呈现相似的变化趋势，最大值均出现在IDC15位点处，最小值在位点IDC53位点处。
[0061] 由表5和图20可知，利用18个多态性较好的InDel标记对72份木薯种质资源进行聚类分析发现，在遗传相似系数0.62处，72份木薯被划分成2个群体。其中最大类群为1#类群，其种质来源及类型较为广泛，来源于我国的地方品种及选育品种大多划分至1#次亚群，其余1#亚群材料无地理分布规律，2#亚群材料主要来源于哥伦比亚及中国。据聚类分析结果可知，72分木薯种质资源群体最小遗传相似系数为0.61，有7份木薯材料遗传相似系数达100%，说明木薯种质的遗传基础相对比较狭窄，与前人研究结果相似。据国内外学者研究结果表明，现有木薯种质间遗传变异水平较低，遗传基础十分狭窄，较难满足木薯育种工作需求。
[0062] 表4 18对Indel引物在72份木薯种质中的遗传多样性
[0063]
[0064] 表5 72份木薯种质资源基本信息
[0065] 编号 材料名称 种质类型 来源 亚群 编号 材料名称 种质类型 来源 亚群C1 无叶柄 野生品种 1# C37 GR024‑8 选育品种 中国 1#C2 KM94 引进品系 越南 1# C38 巴西14号 引进品系 巴西 1#
C3 SC14 选育品种 中国 1# C39 CM965‑3 引进品系 哥伦比亚 1#
C4 SC201 选育品种 中国 1# C40 CMR37‑14‑9 引进品系 泰国 1#
C5 云南8号 地方品种 中国 1# C41 瑞士T7 引进品系 瑞士 1#
C6 云南7号 地方品种 中国 1# C42 ZM9242 品系 中国 1#
C7 SC7 选育品种 中国 1# C43 ZM99250 品系 中国 1#
C8 云南2号 地方品种 中国 1# C44 COL629‑4 引进品系 哥伦比亚 1#
C9 瑞士W4 引进品系 瑞士 1# C45 CM4031‑2 引进品系 哥伦比亚 1#
C10 ZM93236 品系 中国 1# C46 COL739 引进品系 哥伦比亚 1#
C11 SC205 选育品种 中国 1# C47 瑞士P11 引进品系 瑞士 1#
C12 ZM8625 品系 中国 1# C48 巴西15号 引进品系 巴西 1#
C13 瑞士R9 引进品系 瑞士 1# C49 印尼种 引进品系 印尼 1#
C14 ZM99247 品系 中国 1# C50 瑞士S8 引进品系 瑞士 1#
C15 CM4040‑1 引进品系 哥伦比亚 1# C51 COL244 引进品系 哥伦比亚 1#
C16 SC8002 选育品种 中国 1# C52 R90 引进品系 泰国 1#
C17 R5 引进品系 泰国 1# C53 印尼细叶 引进品系 印尼 1#
C18 R72 引进品系 泰国 1# C54 CM7595 引进品系 哥伦比亚 1#
C19 COL198 引进品系 哥伦比亚 1# C55 R7 引进品系 泰国 1#
C20 粘木种 引进品系 印尼 1# C56 CM1568‑2 引进品系 哥伦比亚 1#
C21 R60 引进品系 泰国 1# C57 瑞士Q10 引进品系 瑞士 1#
C22 KM98‑6 引进品系 越南 1# C58 COL2626 引进品系 哥伦比亚 1#
C23 CM3993‑9 引进品系 哥伦比亚 1# C59 KM98‑7 引进品系 越南 1#
C24 瑞士N13 引进品系 瑞士 1# C60 R80 引进品系 泰国 1#
C25 GR911 选育品种 中国 1# C61 GR024‑3 选育品种 中国 1#
C26 巴西14号 引进品系 巴西 1# C62 COL1061 引进品系 哥伦比亚 1#
C27 瑞士H19 引进品系 瑞士 1# C63 瑞士U6 引进品系 瑞士 1#
C28 巴西9号 引进品系 巴西 1# C64 CM483‑2 引进品系 哥伦比亚 1#
C29 瑞士B25 引进品系 瑞士 1# C65 COL777 引进品系 哥伦比亚 1#
C30 CMR36‑40‑9 引进品系 泰国 1# C66 SC11 选育品种 中国 2#
C31 巴西7号 引进品系 巴西 1# C67 SC8 选育品种 中国 2#
C32 COL1049‑1 引进品系 哥伦比亚 1# C68 CM901 引进品系 哥伦比亚 2#
C33 ZM7901 品系 中国 1# C69 桂热5号 选育品种 中国 2#
C34 ZM8229 品系 中国 1# C70 COL1395 引进品系 哥伦比亚 2#
C35 SC6 选育品种 中国 1# C71 SC12 选育品种 中国 2#
C36 SC13 选育品种 中国 1# C72 CM3327‑4 引进品系 哥伦比亚 2#
C3 SC14 选育品种 中国 1# C39 CM965‑3 引进品系 哥伦比亚 1#
C4 SC201 选育品种 中国 1# C40 CMR37‑14‑9 引进品系 泰国 1#
C5 云南8号 地方品种 中国 1# C41 瑞士T7 引进品系 瑞士 1#
C6 云南7号 地方品种 中国 1# C42 ZM9242 品系 中国 1#
C7 SC7 选育品种 中国 1# C43 ZM99250 品系 中国 1#
C8 云南2号 地方品种 中国 1# C44 COL629‑4 引进品系 哥伦比亚 1#
C9 瑞士W4 引进品系 瑞士 1# C45 CM4031‑2 引进品系 哥伦比亚 1#
C10 ZM93236 品系 中国 1# C46 COL739 引进品系 哥伦比亚 1#
C11 SC205 选育品种 中国 1# C47 瑞士P11 引进品系 瑞士 1#
C12 ZM8625 品系 中国 1# C48 巴西15号 引进品系 巴西 1#
C13 瑞士R9 引进品系 瑞士 1# C49 印尼种 引进品系 印尼 1#
C14 ZM99247 品系 中国 1# C50 瑞士S8 引进品系 瑞士 1#
C15 CM4040‑1 引进品系 哥伦比亚 1# C51 COL244 引进品系 哥伦比亚 1#
C16 SC8002 选育品种 中国 1# C52 R90 引进品系 泰国 1#
C17 R5 引进品系 泰国 1# C53 印尼细叶 引进品系 印尼 1#
C18 R72 引进品系 泰国 1# C54 CM7595 引进品系 哥伦比亚 1#
C19 COL198 引进品系 哥伦比亚 1# C55 R7 引进品系 泰国 1#
C20 粘木种 引进品系 印尼 1# C56 CM1568‑2 引进品系 哥伦比亚 1#
C21 R60 引进品系 泰国 1# C57 瑞士Q10 引进品系 瑞士 1#
C22 KM98‑6 引进品系 越南 1# C58 COL2626 引进品系 哥伦比亚 1#
C23 CM3993‑9 引进品系 哥伦比亚 1# C59 KM98‑7 引进品系 越南 1#
C24 瑞士N13 引进品系 瑞士 1# C60 R80 引进品系 泰国 1#
C25 GR911 选育品种 中国 1# C61 GR024‑3 选育品种 中国 1#
C26 巴西14号 引进品系 巴西 1# C62 COL1061 引进品系 哥伦比亚 1#
C27 瑞士H19 引进品系 瑞士 1# C63 瑞士U6 引进品系 瑞士 1#
C28 巴西9号 引进品系 巴西 1# C64 CM483‑2 引进品系 哥伦比亚 1#
C29 瑞士B25 引进品系 瑞士 1# C65 COL777 引进品系 哥伦比亚 1#
C30 CMR36‑40‑9 引进品系 泰国 1# C66 SC11 选育品种 中国 2#
C31 巴西7号 引进品系 巴西 1# C67 SC8 选育品种 中国 2#
C32 COL1049‑1 引进品系 哥伦比亚 1# C68 CM901 引进品系 哥伦比亚 2#
C33 ZM7901 品系 中国 1# C69 桂热5号 选育品种 中国 2#
C34 ZM8229 品系 中国 1# C70 COL1395 引进品系 哥伦比亚 2#
C35 SC6 选育品种 中国 1# C71 SC12 选育品种 中国 2#
C36 SC13 选育品种 中国 1# C72 CM3327‑4 引进品系 哥伦比亚 2#
[0066] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。