本发明公开了一种黄酮3'‑羟基化酶及其应用。黄酮3'‑羟基化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.：1所示。本发明的黄酮3'‑羟基化酶，催化活性高、手性选择性强，可以在较为宽泛的反应条件进行酶促反应，高效、清洁地将二氢山柰酚催化为二氢槲皮素。
一种黄酮3’‑羟基化酶及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物领域，具体涉及一种黄酮3’‑羟基化酶及其应用。
背景技术
[0002] 二氢槲皮素，英文名为:Taxifolin，化学名为:3,3',4',5,7‑五羟基二氢黄酮醇。它来源于松科植物落叶松、花旗松等植物，是一种重要的生物黄酮类化合物，是一种强抗氧化剂，也可用作食品的防腐剂，在医药上用于提高红细胞的活性，以延缓人体的衰老。二氢槲皮素也可以在市场上以商品名 Venoruton® 的半合成形式在市场上找到，据报道，二氢槲皮素可以作为髓过氧化物酶 (MPO) 衍生的 RNS的清除剂。细胞水平研究发现二氢槲皮素在结肠直肠细胞中以剂量依赖性方式和时间依赖性方式诱导细胞毒性，实验还验证了对人类结肠直肠癌HCT116 和 HT29细胞施用二氢槲皮素会导致细胞生长停滞、控制细胞周期的分子在细胞周期的G2 期发挥作用的变化以及浓度依赖性方法中的细胞凋亡。二氢槲皮素给药同时还降低了β‑catenin基因、AKT 基因和Survivin 基因的表达以及体外和体内的蛋白质表达。最近的一项对照研究表明，二氢槲皮素能够下调 UVB 处理的皮肤细胞中的胶原酶 I (MMP‑1)，这使得二氢槲皮素对人体的循环系统疾病、缺血性心脏病、缺血性动脉硬化、肝活动障碍、眼科病、糖尿病等诸多疾病有较好的疗效。
[0003] 近日，国家卫计委就发布了关于将二氢槲皮素批准为新食品原料的文件，使得二氢槲皮素研究热度大幅提高。目前二氢槲皮素的原料主要是从落叶松根等通过回流提取，树脂脱色、浓缩、盐酸水解等复杂步骤提取分离纯化获得。大量的有机溶剂使用对环境带来了巨大的压力，如何通过合成生物学的手段在可控的发酵/酶转化体系中得到二氢槲皮素是黄酮类化合物现在研究的热点。
[0004] 黄酮3’‑羟化酶(F3'H)是产生花青素I型色素的黄酮途径中的关键酶，它在很多植物物种(例如蔷薇、石竹、矮牵牛、牵牛花和菊花)中产生了红色和粉红色的花色产生重要的作用。同时黄酮3'位羟基化是黄酮类化合物的重要修饰位点之一，羟基化后的黄酮还会被进一步糖基化修饰。在不同植物或组织中，F3'H具有底物特异性。现有公开报道的黄酮3’‑羟化酶在大肠杆菌等异源表达体系中表达后，投料量较小，一般不超过0.1mM，不能够工业化。
[0005] 参考文献：
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发明内容
[0013] 本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种黄酮3’‑羟基化酶及其应用。
[0014] 本发明所采取的技术方案是：
[0015] 本发明的第一个方面，提供：
[0016] 一种黄酮3’‑羟基化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.：1所示。
[0017] 本发明的第二个方面，提供：
[0018] 编码本发明第一个方面所述黄酮3’‑羟基化酶的基因。
[0019] 在一些黄酮3’‑羟基化酶的基因的实例中，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：2所示。
[0020] 本发明的第三个方面，提供：
[0021] 一种重组蛋白表达载体，其含有本发明第二个方面所述的黄酮3’‑羟基化酶的基因并表达该基因。
[0022] 在一些重组蛋白表达载体的实例中，所述表达载体的宿主细胞选自原核生物、真核生物。
[0023] 在一些重组蛋白表达载体的实例中，所述宿主细胞选自大肠杆菌、酿酒酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
[0024] 本发明的第四个方面，提供：
[0025] 本发明第一个方面所述黄酮3’‑羟基化酶在将二氢山柰酚酶促反应为二氢槲皮素中的应用。
[0026] 本发明的第五个方面，提供：
[0027] 一种二氢槲皮素的生产方法，包括如下步骤：在缓冲液中加入二氢山柰酚和本发明第一个方面所述的黄酮3’‑羟基化酶，酶促反应得到二氢槲皮素。
[0028] 在一些生产方法的实例中，所述缓冲液的pH为5.0～8.0，优选为7.0～8.0。
[0029] 在一些生产方法的实例中，所述酶促反应的温度为20～60℃，优选为30～50℃。
[0030] 在一些生产方法的实例中，二氢山柰酚的浓度为100 mg/L～10 g/L。
[0031] 在一些生产方法的实例中，黄酮3’‑羟基化酶的添加量为100～5000 U/L。
[0032] 在一些生产方法的实例中，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液。
[0033] 在一些生产方法的实例中，黄酮3’‑羟基化酶为表达得到的粗提物。
[0034] 本发明的第六个方面，提供：
[0035] 一种催化剂，其包括本发明第一个方面所述的黄酮3’‑羟基化酶。
[0036] 本发明的有益效果是：
[0037] 本发明的黄酮3’‑羟基化酶，催化活性高、手性选择性强，可以在较为宽泛的反应条件进行酶促反应，高效、清洁地将二氢山柰酚催化为二氢槲皮素。
附图说明
[0038] 图1是本发明的黄酮3’‑羟基化酶重组表达载体图。
[0039] 图2是本发明的黄酮3’‑羟基化酶PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。
[0040] 图3是本发明的黄酮3’‑羟基化酶粗酶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图及底物转化液相色谱图（产物：6.8 min）。
具体实施方式
[0041] 本发明的第一个方面，提供：
[0042] 一种黄酮3’‑羟基化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.：1所示。
[0043] 本发明的第二个方面，提供：
[0044] 编码本发明第一个方面所述黄酮3’‑羟基化酶的基因。
[0045] 编码黄酮3’‑羟基化酶的基因可以根据宿主的不同而进行表达优化，以尽可能提高重组蛋白的表达量。
[0046] 在一些黄酮3’‑羟基化酶的基因的实例中，其核苷酸序列如SEQ ID NO.：2所示。
[0047] 本发明的第三个方面，提供：
[0048] 一种重组蛋白表达载体，其含有本发明第二个方面所述的黄酮3’‑羟基化酶的基因并表达该基因。
[0049] 在一些重组蛋白表达载体的实例中，所述表达载体的宿主细胞选自原核生物、真核生物。
[0050] 在一些重组蛋白表达载体的实例中，所述宿主细胞选自大肠杆菌、酿酒酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
[0051] 本发明的第四个方面，提供：
[0052] 本发明第一个方面所述黄酮3’‑羟基化酶在将二氢山柰酚酶促反应为二氢槲皮素中的应用。
[0053] 本发明中催化黄酮3’‑羟基化反应形成二氢槲皮素类产物的催化剂，可以是上述产生的重组黄酮3’‑羟基化酶的转化体的培养物，也可以是通过将该培养物离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品。这里“加工的制品”是指由转化体细胞得到的提取物、或通过对提取物中的黄酮3’‑羟基化酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定化获得的固定化酶制剂。
[0054] 本发明的第五个方面，提供：
[0055] 一种二氢槲皮素的生产方法，包括如下步骤：在缓冲液中加入二氢山柰酚和本发明第一个方面所述的黄酮3’‑羟基化酶，酶促反应得到二氢槲皮素。
[0056] 酶促反应的反应式如下：
[0057] 。
[0058] 缓冲液的pH只要满足酶促反应即可，在一些生产方法的实例中，所述缓冲液的pH为5.0～8.0，优选为7.0～8.0。
[0059] 反应温度只要满足酶促反应即可，在一些生产方法的实例中，所述酶促反应的温度为20～60℃，优选为30～50℃。
[0060] 在不影响酶促反应速度的情况下，二氢山柰酚越高越好。在一些生产方法的实例中，二氢山柰酚的浓度为100 mg/L～10 g/L。这一浓度下，具有较好的反应速率，综合成本相对更优。
[0061] 酶的加入量可以根据底物的浓度进行相应的调整，在一些生产方法的实例中，黄酮3’‑羟基化酶的添加量为100～5000 U/L。这样条件下具有良好的
[0062] 缓冲液的作用在于维持反应过程中的pH稳定，只要缓冲液对酶反应没有抑制作用即可。在一些生产方法的实例中，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液易于配置，成本低廉，无毒无害，是更佳的选择。
[0063] 在一些生产方法的实例中，黄酮3’‑羟基化酶为表达得到的粗提物。这种粗提物已经具有良好的催化活性，
[0064] 本发明的第六个方面，提供：
[0065] 一种催化剂，其包括本发明第一个方面所述的黄酮3’‑羟基化酶。
[0066] 下面结合实施，进一步说明本发明的技术方案。
[0067] 发明人在现有黄酮3’‑羟基化酶基础上，改造得到了一种新的黄酮3’‑羟基化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.：1所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.：2所示。
[0068] MLVLIFFTVVLAFFLYRLFGPGGSRHALPLPPGPKPWPVVGNLPHLGPVPHHSLAALARQYGPLMHLRLGFVDVVVAASASVASQFLKTHDANFSSRPPNSGAKHLAYNYQDLVFAPYGPRWRMLRKISSVHLFSGKALDDLKHVRQEEVGVLAHGLASAGSKPVNLGQLLNVCTVNALGRVMVGRRLFGDGSGGEDQKADEFKSMVVEMMVLAGVFNIGDFIPALEWLDLQGVAGKMKKLHKRFDAFLTAIVEDHKRSRGGKHVDMLTTLLSLKDDADGEGAKLTDTEIKALLLNMFTAGTDTSSSTVEWAIAELLRHPKILAQLQQELDQVAGRDRLITESDLPNLTYLQAVIKETFRLHPSTPLSLPRMASESCEINGFHIPKGATLLVNVWAISRDPAQWSEPLEFRPERFLPGGEKPNVDVKGNDFEVIPFGAGRRICAGMTLGLRMVSLMTATLVHGFDWTLADGLTPEKLNMDEAYGLTLQRAAPLMVHPRNRLAPHAYNASSP (SEQ ID NO.：1)。
[0069] ATGCTTGTTCTCATATTCTTCACCGTTGTCTTGGCCTTCTTCTTATACCGGCTCTTCGGCCCCGGCGGGAGCCGCCACGCTCTGCCTCTTCCGCCAGGGCCGAAACCCTGGCCTGTCGTGGGAAACTTGCCCCACTTAGGTCCCGTTCCCCATCACTCTCTGGCAGCGTTGGCCCGTCAGTATGGACCCCTTATGCACCTCCGCTTGGGGTTCGTTGACGTGGTTGTTGCAGCCTCTGCTTCGGTGGCGTCACAGTTCTTGAAGACCCATGACGCCAATTTCTCCAGCAGACCACCCAACTCCGGCGCCAAGCATCTCGCTTACAACTACCAGGATTTGGTGTTCGCGCCGTACGGTCCACGATGGCGGATGTTACGGAAGATCAGCTCCGTCCATTTGTTCTCCGGCAAGGCTCTCGATGATCTTAAACATGTTCGCCAGGAGGAAGTAGGTGTGCTGGCACATGGATTAGCAAGTGCAGGGTCAAAGCCAGTGAACTTAGGGCAGCTACTGAACGTGTGCACAGTCAACGCCCTAGGGCGGGTGATGGTAGGGCGGAGGCTCTTCGGAGACGGTAGCGGGGGCGAAGACCAGAAGGCCGACGAGTTCAAATCCATGGTGGTGGAGATGATGGTGTTGGCTGGCGTTTTCAACATCGGCGACTTCATCCCGGCCCTCGAGTGGCTGGACTTGCAGGGGGTGGCGGGAAAGATGAAGAAGCTGCACAAGAGGTTCGATGCCTTCTTGACCGCCATTGTTGAAGACCACAAGAGGAGCCGCGGAGGGAAGCACGTGGACATGCTGACGACGTTGCTGTCGCTCAAGGATGATGCTGACGGTGAGGGCGCCAAGCTCACGGACACTGAGATTAAAGCTTTGCTTTTGAACATGTTCACAGCTGGCACTGACACGTCATCAAGCACGGTGGAATGGGCCATAGCAGAACTCCTTCGCCACCCCAAGATTCTAGCCCAACTCCAACAAGAGCTGGACCAAGTAGCGGGGCGGGATCGGCTCATAACCGAGTCGGACCTGCCTAACTTGACCTACCTCCAAGCAGTAATCAAGGAAACCTTTCGGCTACACCCGTCAACCCCGCTCTCCCTGCCTCGAATGGCGTCCGAGAGTTGCGAAATCAACGGGTTCCACATCCCCAAGGGTGCCACTCTTCTGGTCAACGTATGGGCCATATCTCGCGACCCGGCCCAATGGTCCGAACCGCTTGAGTTTAGACCCGAGCGGTTCTTGCCGGGTGGAGAGAAGCCCAATGTGGACGTCAAGGGTAATGATTTCGAGGTTATACCGTTTGGGGCCGGGCGGAGAATATGCGCCGGGATGACCCTTGGGCTGCGTATGGTGTCTCTAATGACCGCGACCCTGGTCCATGGTTTTGATTGGACCTTGGCTGATGGGCTCACACCTGAGAAATTGAACATGGACGAGGCTTATGGGCTCACACTACAAAGAGCCGCACCATTAATGGTGCACCCACGTAACAGGCTAGCCCCTCATGCATATAATGCGTCATCACCTTGA(SEQ ID NO.：2)。
[0070] 实施例1：重组表达载体的构建
[0071] 重组表达载体可以按现有方法构建得到，或具体的，参照如下方法构建得到。
[0072] 通过将DNA合成所得的核酸产物与表达载体pET28a分别用限制性内切酶SacⅠ和XhoⅠ双酶切，形成互补的粘性末端，经T4‑DNA连接酶连接，形成含有本发明的黄酮3’‑羟基化酶基因的重组表达质粒pET28a‑His‑AAF3'H重组表达质粒(结果见图1)。
[0073] 实施例2：重组表达转化体的构建
[0074] 将前述重组表达质粒pET28a‑His‑AAF3'H转化至E. coliBL21(DE3)中，即可获得本发明优选的基因工程菌株，即E. coliBL21(DE3)/pET28a‑His‑AAF3'H(结果见图2)。转化方法可选择本领域常规方法，如电转法，热击法等，较佳地选择热击法进行转化。
[0075] 实施例3：重组黄酮3’‑羟基化酶的制备方法
[0076] 一种重组黄酮3’‑羟基化酶的制备方法，包括培养本发明所述的重组表达转化体，以及从培养物中获得重组黄酮3’‑羟基化酶。其中，所述的重组表达转化体同前述介绍，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞得到。培养重组表达转化体中所用的培养基可以是本领域常规的任何可使转化体生长并产生本发明的黄酮3’‑羟基化酶的培养基，对于大肠杆菌菌株，优选LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，pH=7.0)。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要能使转化体生长并产生本发明的黄酮3’‑羟基化酶即可。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行。
[0077] 对于大肠杆菌菌株，摇瓶培养发酵生产酶较佳地选用下述方法：将本发明涉及的重组大肠杆菌(E. coli BL21(DE3)/pET28a‑His‑AAF3'H)接种至含氨苄霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.5～0.7时，加入终浓度为0.01～1.0mmol/L的异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度20～40℃，160～240rpm培养10～18h，即可高效表达本发明所述重组黄酮3’‑羟基化酶。培养完成后，收集菌体，匀浆或者超声后得到粗酶液，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(结果见图3A)。
[0078] 实施例4：黄酮3’‑羟基化酶的酶催化反应
[0079] 在10mL磷酸盐缓冲液(100mmol/L，pH7.5)中加入不同终浓度(5～20g/L)的二氢山柰酚，在非密封容器中搅拌20‑30分钟，加入根据制备的黄酮3’‑羟基化酶的粗酶液(实施例3)至蛋白质终浓度为1g/L，30～50℃反应，反应一定时间添加与反应液等量且含有0.1%三氟乙酸(TFA)的90%乙腈水溶液，终止反应。反应条件及反应结果如表1所示。
[0080] 表1
[0081] 编号 二氢山柰酚终浓度/ g/L 反应温度/℃ 搅拌反应时间/min 转化率/% 产物手性1 5 37 120 96.5 S
2 10 37 120 95.1 S
3 15 37 180 92.2 S
4 20 37 180 90.4 S
5 15 30 150 85.6 S
6 15 50 150 81.3 S
[0082] 为了分析反应产物，使用了ODS C‑18柱（4.6×250mm，Waters公司）的反相高效液相色谱（HPLC）进行（结果如图3B，样品编号3）。关于样品的洗脱，用含有0.5%TFA的20‑100%直线浓度梯度的乙腈水溶液以0.6ml/min洗脱15分钟，在280nm的波长下检测。将已知底物及产物样品的HPLC洗脱时间和吸收光谱与产物的洗脱时间和吸收光谱进行比较，产物的质+谱分子离子峰[M+H]=305.07与文献报道一致，确定其产物为二氢槲皮素。
[0083] 以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。
