EPHA2嵌合抗原受体及其用途

摘要

本发明属于免疫学和分子生物学技术领域，具体涉及EPHA2嵌合抗原受体及其用途。本发明获得一系列新的抗EPHA2单域抗体并进行人源化设计，从而能够与EPHA2抗原结合，并进一步设计靶向EPHA2嵌合抗原受体，通过试验证明，采用表达上述EPHA2嵌合抗原受体的CAR‑T细胞具有优异的表达率和持久性，这些细胞显示出良好的持久稳定性作用和抗肿瘤特别是抗脑胶质瘤效果，同时经试验证明在施用剂量较低的情况下即可取得显著疗效，因此安全性更高，从而表明其具有良好的实际应用之价值。

权利要求

1.一种EPHA2嵌合抗原受体，其特征在于，其至少包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和信号传导结构域，其中，所述抗原结合结构域为抗EPHA2单域抗体；

其中，所述抗EPHA2单域抗体的氨基酸序列选自如SEQ ID NO.5、7、9、11、13、21、23、25、

27、29、31、33、35、37或39所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的EPHA2嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗EPHA2单域抗体的氨基酸序列选自如SEQ ID NO. 25、29或37所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的EPHA2嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包括信号肽，所述信号肽为CD8α信号肽；所述CD8α信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示。

4.如权利要求1所述的EPHA2嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗原结合结构域和跨膜结构域通过铰链区进行连接，所述铰链区包含CD8铰链区，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 42所示。

5.如权利要求1所述的EPHA2嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域为CD8跨膜结构域，所述CD8跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO. 43所示。

6.如权利要求1所述的EPHA2嵌合抗原受体，其特征在于，所述共刺激结构域包括4‑1BB结构域；所述4‑1BB结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO. 44所示；

所述信号传导结构域为CD3ζ信号传导域，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 45所示。

7.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1‑6任一项所述的EPHA2嵌合抗原受体。

8.一种CAR表达载体，其特征在于，所述CAR表达载体包含权利要求7所述的核酸分子。

9.一种CAR‑T细胞，其特征在于，所述CAR‑T细胞表达权利要求1‑6任一项所述的EPHA2嵌合抗原受体。

10.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物其至少包含权利要求9所述CAR‑T细胞；所述肿瘤为与EPHA2过表达相关的肿瘤。

11.如权利要求10所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述肿瘤为脑胶质瘤。

说明书

EPHA2嵌合抗原受体及其用途

技术领域

[0001] 本发明属于免疫学和分子生物学技术领域，具体涉及EPHA2嵌合抗原受体及其用途。

背景技术

[0002] 本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

[0003] 脑神经胶质瘤是最常见和最具侵袭性的高级原发性成人脑瘤。目前的标准护理治疗包括手术切除、放疗和化疗，可将患者的生存期延长至14‑15个月。5年生存率约为10％，最终死亡率接近100％。由于脑神经胶质瘤异质性、免疫逃逸、浸润性和血脑屏障的保护，实际上是无法被治愈的。因此，迫切需要开发新的治疗方法来消除脑神经胶质瘤。

[0004] 表达嵌合抗原受体的T细胞在治疗恶性血液病方面表现出了显著的疗效，为肿瘤治疗提供了广阔的前景。这种免疫疗法可以通过病毒或质粒载体修饰T细胞来表达一个嵌合抗原受体(CAR)，识别肿瘤相关抗原(TAAs)或癌细胞过表达的抗原，利用T细胞的能力来杀死恶性细胞。CAR分子是由胞外段抗原识别区、跨膜区和胞内信号激活区三部分组成，CAR分子修饰后的T细胞可直接攻击表达表面抗原的肿瘤。

[0005] ephrin type A受体2(EPHA2)是一个跨膜酪氨酸激酶受体，属于酪氨酸激酶受体(RTKs)超家族成员之一。与其他酪氨酸激酶一样，EPHA2分子可以分为三个结构域，及胞外的配体结合区，胞内的酪氨酸激酶活性功能区及跨膜区共同组成。EPHA2参与神经系统发育和血管系统的发育，与良性肿瘤相比，在恶性胶质瘤中EPHA2显著过表达，并与较差的预后显著相关，进一步说明EPHA2有助于肿瘤的恶性转化。EphA2/Ephrin A1系统至少可以通过两种机制被作为癌症治疗的靶点。首先，EphA2的致癌功能可以被抑制，如降低EphA2的表达，促进EphA2的降解，阻断内源性EphA2的激活。或者，EphA2受体可用于向癌细胞和相关血管输送治疗药物(外源性药物或内源性免疫细胞)。EphA2靶向治疗已经出现在多种类型和阶段的恶性肿瘤的临床试验中。临床上抑制EphA2的策略包括EphA2靶向抗体‑细胞毒药物结合物(ADC)或肽‑药物结合物(PDC)；酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，如已批准上市的达沙替尼；识别和靶向EphA2抗原的CAR‑T细胞；以及设计用于向肿瘤细胞运送靶向EphA2的siRNAs的纳米载体。未来潜在的抑制非规范信号的策略可能还包括EphA2激动剂，如可溶性EphA2激动剂(A1‑Fc)，或其他小分子抑制剂，以阻断S897处的EphA2磷酸化(Akti/rski/PKAi)。

[0006] 有研究表明EPHA2在脑胶质瘤发生中发挥重要作用，包括侵袭、转移和血管生成。也有研究者已成功展示了EPHA2作为CAR‑T治疗胶质瘤异种移植模型的靶点的抗肿瘤活性；
然而，有关缓解持续时间的数据有限，大多仍处于研究和实验阶段。EPHA2在几乎所有脑神经胶质瘤上都过表达，但在正常脑组织中最低或根本不表达。因此，EPHA2被认为是脑胶质瘤的合适靶标，用于开发CAR‑T细胞免疫治疗。

发明内容

[0007] 本发明提供EPHA2嵌合抗原受体及其用途。本发明的目的即在于提供与已知的CAR‑T细胞相比在EPHA2高表达的肿瘤(如脑胶质瘤)中具有显著治疗优势的CAR‑T细胞、CAR表达载体和CAR治疗平台。

[0008] 为了实现上述技术目的，本发明提供的技术方案如下：

[0009] 本发明的第一方面，提供一种EPHA2嵌合抗原受体，其至少包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和信号传导结构域，其中，所述抗原结合结构域为抗EPHA2单域抗体；

[0010] 其中，所述抗EPHA2单域抗体的氨基酸序列选自：

[0011] (a)如SEQ ID NO.5、7、9、11、13、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39所示的氨基酸序列；或，

[0012] (b)如SEQ ID NO.SEQ ID NO.5、7、9、11、13、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失而形成的，能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合EPHA2和诱导T细胞信号传导功能的变体。

[0013] 所述EPHA2嵌合抗原受体包括CD8α信号肽、结合EPHA2抗原的上述抗原结合结构域、CD8铰链区、CD8跨膜结构域、4‑1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域串联而成。

[0014] 本发明的第二方面，提供一种核酸序列，所述核酸序列能够编码第一方面所述的EPHA2嵌合抗原受体。

[0015] 本发明的第三方面，提供一种CAR表达载体，所述CAR表达载体包含第二方面所述的核苷酸。

[0016] 本发明的第四方面，提供一种CAR‑T细胞，所述CAR‑T细胞能够表达上述EPHA2的嵌合抗原受体。

[0017] 具体的，其通过引入上述CAR表达载体来进行制备获得。

[0018] 本发明的第五方面，提供一种抗肿瘤药物，所述药物其至少包含上述CAR‑T细胞。

[0019] 本发明的第六方面，提供一种治疗脑胶质瘤的方法，所述方法包括：向受试者施用治疗有效剂量上述CAR‑T细胞或抗肿瘤药物。

[0020] 上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

[0021] 上述技术方案获得一系列新的抗EPHA2单域抗体并进行人源化设计，从而能够与EPHA2抗原结合，并进一步设计靶向EPHA2嵌合抗原受体，通过试验证明，采用表达上述EPHA2嵌合抗原受体的CAR‑T细胞具有优异的表达率和持久性，这些细胞显示出良好的持久稳定性作用和抗肿瘤特别是抗脑胶质瘤效果，同时经试验证明在施用剂量较低的情况下即可取得显著疗效，因此安全性更高，从而表明其具有良好的实际应用之价值。

附图说明

[0022] 构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

[0023] 图1为本发明实施例中质粒图谱；

[0024] 图2为本发明实施例中SDS‑PAGE图，其中M为marker蛋白，Lane 1为2μg EPHA2‑His‑ek‑huFc蛋白；

[0025] 图3为本发明实施例中EPHA2蛋白活性鉴定图；

[0026] 图4为本发明实施例中使用Vector NTI进行序列分析图；

[0027] 图5为本发明实施例中克隆A5、A2、C10、A12、A10与目的蛋白的结合图；

[0028] 图6为本发明实施例中抗体A5、A2、C10、A12、A10‑VHH‑huFc融合抗体和CHO‑K1/CHO‑K1‑EPHA2细胞结合的情况图；

[0029] 图7为本发明实施例中内源性表达EPHA2的肿瘤细胞对Jurkat‑NFAT‑Luc‑GFP细胞株的激活情况图；

[0030] 图8为本发明实施例中靶向EPHA2 CAR‑T细胞的体外抗肿瘤活性图；

[0031] 图9为本发明实施例中使用人源化后EPHA2 CAR‑T细胞治疗后移植瘤(U87)小鼠的肿瘤体积变化图；

[0032] 图10为本发明实施例中使用人源化后EPHA2 CAR‑T细胞治疗后移植瘤(U87)小鼠存活情况图；

[0033] 图11为本发明实施例中使用不同剂量人源化后EPHA2 CAR‑T细胞治疗后移植瘤(U87)小鼠的肿瘤体积变化图；

[0034] 图12为本发明实施例中使用不同剂量人源化后EPHA2 CAR‑T细胞后移植瘤(U87)小鼠存活情况图。

具体实施方式

[0035] 应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0036] 需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0037] 现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0038] 本发明的一个典型实施方案中，提供一种EPHA2嵌合抗原受体，其至少包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和信号传导结构域，其中，所述抗原结合结构域为抗EPHA2单域抗体；

[0039] 其中，所述抗EPHA2单域抗体的氨基酸序列选自：

[0040] (a)如SEQ ID NO.5、7、9、11、13、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39所示的氨基酸序列；或，

[0041] (b)如SEQ ID NO.5、7、9、11、13、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失而形成的，能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合EPHA2和诱导T细胞信号传导功能的变体。

[0042] 本发明中通过对大量EPHA2抗体进行筛选，从而获得上述抗EPHA2单域抗体，提高嵌合抗原受体的治疗效果；通过对其进行人源化处理，经试验证明，SEQ ID NO.25、29、37所示氨基酸序列的抗EPHA2单域抗体所制备的CAR‑T细胞其治疗效果显著，且在低剂量给药剂量下同样具有显著的抗脑胶质瘤疗效，显著优于现有技术产品。

[0043] 本发明的一个或多个实施方案中，所述如SEQ ID NO.5、7、9、11、13、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失而形成的氨基酸序列与SEQ ID NO.5、7、9、11、13、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39所示的氨基酸序列具有至少90％同一性，包括91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性，仍然具有能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合EPHA2和诱导T细胞信号传导功能。

[0044] 本发明的一个或多个实施方案中，所述抗EPHA2单域抗体的核苷酸序列包含具有如SEQ ID NO.6、8、10、12、14、16、18、26、28、30、32、34、36、38、40所示的序列。

[0045] 本发明的一个或多个实施方案中，所述抗EPHA2单域抗体的核苷酸序列包含与SEQ ID NO.6、8、10、12、14、16、18、26、28、30、32、34、36、38、40所示的序列具有至少80％，包括但不限于81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性的变体，其表达的蛋白具有能够特异结合在嵌合抗原受体上，具有结合EPHA2和诱导T细胞信号传导功能。

[0046] 本发明的一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体还包括信号肽，所述信号肽为CD8α信号肽；所述CD8α信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示。

[0047] 本发明的一个或多个实施方案中，所述抗原结合结构域和跨膜结构域通过铰链区进行连接，所述铰链区可以包含CD8铰链区，其核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示。

[0048] 本发明的一个或多个实施方案中，所述跨膜结构域为CD8跨膜结构域，所述CD8跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示。

[0049] 本发明的一个或多个实施方案中，所述共刺激结构域包括4‑1BB结构域、CD27结构域、CD40结构域或OX40结构域中的任意一种或多种，优选为4‑1BB结构域；所述人4‑1BB结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示。

[0050] 所述信号传导结构域为CD3ζ信号传导域，其核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示。

[0051] 本发明的一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体包括CD8α信号肽、结合EPHA2抗原的上述抗原结合结构域、CD8铰链区、CD8跨膜结构域、人4‑1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域串联而成。

[0052] 本发明的一个或多个实施方案中，提供一种核酸序列，所述核酸序列能够编码第一方面所述的EPHA2嵌合抗原受体。

[0053] 本发明的一个或多个实施方案中，提供一种CAR表达载体，所述CAR表达载体包含第二方面所述的核苷酸。

[0054] 本发明的一个或多个实施方案中，所述CAR表达载体可以为病毒载体，其包括但不限于慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或质粒等，鉴于目前的技术成熟度，优选为慢病毒载体。

[0055] 所述慢病毒载体包含上述靶向EPHA2的嵌合抗原受体的核苷酸序列。

[0056] 本发明的一个或多个实施方案中，提供一种CAR‑T细胞，所述CAR‑T细胞能够表达上述EPHA2的嵌合抗原受体。

[0057] 具体的，其通过引入上述CAR表达载体来进行制备获得。在本领域内，可采用熟知的技术手段完成上述操作，如通过将EPHA2嵌合抗原受体通过其编码的核苷酸序列转染至T细胞中表达获得，而转染过程中则可通过CAR表达载体转染至T细胞得以实现。

[0058] 本发明的一个或多个实施方案中，提供一种抗肿瘤药物，所述药物其至少包含上述CAR‑T细胞。

[0059] 其中，所述肿瘤为与EPHA2过表达相关的肿瘤相关疾病，特别是脑胶质瘤。

[0060] 所述药物还可包括药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可为缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、赋形剂、填充剂、凝结剂与调和剂、界面活性剂、扩散剂或消泡剂。

[0061] 所述药物还可包括可药用载体。所述可药用载体可为微囊、脂质体、纳米颗粒或聚合物及其任意组合。所述可药用载体的递送载剂可为脂质体、生物相容性聚合物(包括天然聚合物和合成聚合物)、脂蛋白、多肤、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、无机(包括金属)颗粒、以及细菌或病毒(例如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒)、噬菌体、黏粒或质粒载体。

[0062] 所述药物还可与其他预防和/或治疗复发性流产的药物联用，其他预防和/或治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

[0063] 所述药物还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它预防和/或治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物的剂量。

[0064] 本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。

[0065] 本发明的一个或多个实施方案中，提供一种脑胶质瘤治疗的方法，所述方法包括：向受试者施用治疗有效剂量上述CAR‑T细胞或抗肿瘤药物。

[0066] 所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指人。所述“治疗有效量”是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物或人的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。必须认识到，本发明所述活性成分的最佳给药剂量和间隔是由其性质和诸如给药的形式、路径和部位以及所治疗的特定哺乳动物等外部条件决定的，而这一最佳给药剂量可用常规的技术确定。同时也必须认识到，最佳的疗程，即同时化合物在额定的时间内每日的剂量，可用本领域内公知的方法确定。特别需要说明的是，本发明的CAR‑T细胞在低剂量施用情况下，依然能够达到满意的治疗效果，从而提供更加安全有效的脑胶质瘤治疗方式。

[0067] 以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。

[0068] 实施例

[0069] 1.EPHA2重组蛋白的制备

[0070] (1)EPHA2_huFc表达质粒的构建

[0071] 体外合成人EPHA2的胞外段Ala24‑Val343(SEQ ID NO:1)基因(SEQ ID NO:2，将该基因插入含有人IgG1重链恒定区的Fc段Asp104‑Lys330的真核表达质粒中，中间以“6*His‑enterokinase site(ek)”相连接，形成融合表达蛋白EPH_huFc(SEQ ID NO:3所示)，相对应的基因序列(SEQ ID NO:4所示)。

[0072] (2)EPHA2_huFc病毒包装

[0073] a.转染前一天，接种3×105/ml HEK293T细胞于10cm培养皿。

[0074] b.转染当天，HEK293T细胞汇合度达到70％左右,吸弃原有培养基，用PBS洗一遍，加入9mlDMEM不完全培养，置于37℃、5％CO2培养箱，待用

[0075] C.准备PEI‑DNA复合物：取1mL DMEM至一个1.5ml无菌离心管中，分别加入7.5μg EPHA2_huFc质粒、5.7μg pGP、3.75μg pVSVG，移液枪上下吹打充分混匀后，加入50.75μL 1μg/μL PEI，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10‑15min。

[0076] d.转染：将上述DNA‑PEI复合物逐滴加入到一个10cm培养皿中，“米”字型轻轻晃动培养皿，充分混匀。将培养皿置于37℃、5％CO2培养箱，培养6～8h后，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的完全培养基(DMEM+10％FBS)。将培养皿置于37℃、5％CO2培养箱，培养48h。

[0077] e.首次收毒：收集培养皿中的培养液至50mL无菌离心管中，置于4℃待用。沿培养皿边缘小心的加入10mL新鲜的完全培养基[DMEM+10％FBS]，将培养皿置于37℃、5％CO2培养箱，继续培养24h。将收集的病毒液。

[0078] d.二次收毒：收集培养皿中的培养液至首次收毒的50mL无菌离心管中，于4℃，6000x g过夜离心16h。

[0079] f.吸弃离心后上清，加入300ulPBS重悬，形成EPHA2_huFc病毒液。

[0080] (3)病毒感染表达EPHA2_huFc。

[0081] a.用CHO GROW CD1将CHO‑S细胞密度调整为1×106/ml，接种于6孔板。

[0082] b.将EPHA2_huFc病毒液逐滴滴加到6孔板内，混匀，置于37℃、5％CO2、130rpm震荡培养箱中培养。

[0083] c.24h后，收集六孔板内细胞培养液，200xg、25℃离心5min。

[0084] d.离心结束后，吸弃上清，加入2mL含有puromycine的CHO GROW CD1，重悬后转移至6孔板，置于37℃、5％CO2、130rpm摇床上培养箱中培养进行筛选(注意设置一个空白CHO‑6
S细胞对照组)。筛选期间维持细胞密度1×10/ml。

[0085] f.对照孔内的细胞基本死亡，筛选结束。将CHO‑S‑EPHA2‑His‑ek‑Fc2‑Puro细胞株扩大培养，期间加入H410KJ CellTurbo feed1增强蛋白表达。连续培养表达4天，收集培养表达上清，用0.45μm针孔滤器过滤，形成过滤样品。

[0086] (4)采用protein A填料预装柱进行亲和纯化

[0087] a.平衡：PBS冲洗预装柱至UV曲线平衡。

[0088] b.上样：将进样管放入过滤样品内进行上样。

[0089] c.洗杂：上样结束后用PBS冲洗至曲线平衡；

[0090] d.洗脱：用甘氨酸缓冲液(PH3.0)进行洗脱，出峰收集蛋白液，立即用适量Tris‑HCl(PH 9.0)溶液中和。

[0091] e.使用截流量为10KD的millipore超滤管进行蛋白洗脱液浓缩，使用超微量核酸蛋白检测仪OD280模块检测蛋白浓度。

[0092] f.取2ug跑SDS‑PAGE，结果如图2所示。

[0093] (5)EPHA2蛋白活性鉴定

[0094] 构建anti‑EPHA2阳性抗体4H5的pCDH‑EF1a‑4H5‑CAR‑EGFRt质粒，转染HEK293T细胞。取转染后HEK293T‑4H5细胞与纯化的EPHA2‑His‑ek‑Fc蛋白进行孵育，接着孵育anti‑human FC‑PE，HEK293T细胞作为阴性细胞对照FACS分析结果显示EPHA2‑ek‑Fc蛋白有功能，可用于下一步的免疫和检测。(图3)

[0095] 2.使用噬菌体展示文库筛选针对EPHA2特异的VHH抗体

[0096] (1)使用EPHA2蛋白(切去huFc tag)免疫羊驼，皮下多点免疫，取外周血测定抗体效价，免疫血清与EPHA2重组蛋白可以结合，且随着免疫血清的梯度稀释，OD值成梯度变化，符合建库要求，安排构建噬菌体展示库。

[0097] (2)采集免疫羊驼的外周血，提取RNA，制备cDNA样品后，PCR克隆VHH抗体编码基9
因，构建噬菌体展示库，(库容量2x10 ，空载率0％，随机挑取16个单克隆进行测序，使用Vector NTI进行序列分析，结果显示各单克隆序列差异大，库多样性较好。(图4)

[0098] (3)使用EPHA2重组蛋白抗原进行固相淘选，进行2‑4轮的噬菌体淘选实验，每轮结束后计算input和output值，在第2轮开始对获取的单克隆噬菌体进行Phage ELISA。

[0099] a.用CBS按1μg/mL浓度包被EPHA2重组蛋白抗原，4℃过夜。

[0100] b.弃去抗原，用3％MPBS室温封闭2h，此为Sample板；同时用MPBS封闭一块空白ELISA板，此为Negative control板。

[0101] c.弃去MPBS，用0.05％PBST洗涤4次；用0.01％PBST 1:1稀释单克隆噬菌体上清，每孔100μL，4℃孵育1h。

[0102] d.弃去一抗，用0.05％PBST洗涤5次；用0.05％的PBST按1:3000稀释anti‑M13 antibody‑HRP，每孔100μL，4℃孵育1h。

[0103] f.弃去二抗，PBST洗涤5次；TMB 37℃显色15min，硫酸酸终止反应，读取OD450。g.计算S/N值，挑选比值较大的样品进行Sanger测序。

[0104] h.获取候选单域抗体的核酸及氨基酸序列信息，进行序列比对，挑选CDR区域氨基酸序列不同的候选抗体。在候选抗体序列的N端和C端分别通过Overlap PCR引入CMV启动子、信号肽及hu IgG1 Fc标签，将纯化PCR产物瞬时转染293F细胞，收集培养基上清。

[0105] I.复苏1×106个处于对数生长期的CHO‑K1‑EPHA2重组细胞株，400xg，4℃离心5min。CHO‑K1细胞株作为阴性对照组。弃上清后加入上述100uL培养基上清，4℃孵育30min后，加入1mL PBS洗涤细胞3次，然后用100uL PBS重悬细胞，加入5uL PE标记的Anti human IgG抗体，室温避光孵育30分钟后，加入1mL PBS洗涤三次，最后用500uL PBS重悬细胞。通过流式细胞仪初步确定候选抗体与目的蛋白的结合情况。结果显示CHO‑K1与EphA2抗体不结合，而与CHO‑K1‑EphA2特异性结合，是EPHA2的特异性抗体。克隆号分别为A5、A2、C10、A12、A10。(图5)

[0106] A5的VHH氨基酸序列如(SEQ ID NO:5)所示，基因序列如(SEQ ID NO:6)；A2的VHH氨基酸序列如(SEQ ID NO:7)所示，基因序列如(SEQ ID NO:8)；C10的VHH氨基酸序列如(SEQ ID NO:9)所示，基因序列如(SEQ ID NO:10)；A12的VHH氨基酸序列如(SEQ ID NO:11)所示，基因序列如(SEQ ID NO:12)；A10的VHH氨基酸序列如(SEQ ID NO:13)所示，基因序列如(SEQ ID NO:14)。

[0107] 3.抗EPHA2‑VHH_huFc融合抗体的构建及其在真核细胞中的瞬转表达纯化、活性鉴定

[0108] a.将单域抗体编码区基因序列克隆至pFUSE‑huIgG1‑Fc2载体中，构建真核表达载体。瞬时转染对数生长期的293F细胞。转染5‑7天后收集培养上清通过Protein A进行亲和纯化。

[0109] b.复苏CHO‑K1‑EPHA2细胞，将纯化的候选单域抗体梯度稀释后与其进行孵育，CHO‑K1作为阴性对照组。然后分别加入PE标记的Anti human IgG抗体进行孵育。用细胞流式术进行检测分析，并以MFI数值和抗体浓度绘制曲线。结果显示抗体A5、A2、C10、A12、A10‑VHH‑huFc融合抗体和

[0110] CHO‑K1/CHO‑K1‑EPHA2细胞结合的情况。这五个抗体E2‑A2抗体随梯度稀释与靶细胞结合程度逐渐发生偏移,但抗体A5、A2在高浓度时存在了较低的非特异性结合，也就是说C10、A12、A10在全部稀释梯度及A5、A2在2ug/ml以下的稀释梯度都特异性的结合表达EPHA2的CHO‑K1‑EPHA2细胞，不结合阴性细胞CHO‑K1(图6)。进一步做激活实验进行序列筛选。

[0111] c.将单域抗体编码区基因序列克隆至Lenti‑EF1a‑pCAR‑puro载体中，构建真核表达载体。瞬时转染HEK293T细胞，将病毒转导Jurkat‑NFAT‑Luc‑GFP细胞株，未转导病毒的Jurkat‑NFAT‑Luc‑GFP细胞为阴性对照组。用puromycin筛选5‑7天，待阴性对照组细胞基本死亡，筛选得到CAR‑Jurkat‑NFAT‑Luc‑GFP细胞株。

[0112] d.将内源性表达EPHA2的处于对数生长期的脑胶质瘤细胞U87和U251，分别与Jurkat‑NFAT‑Luc‑GFP细胞株按照一定比例进行共培养，检测共培养后，内源性表达EPHA2的肿瘤细胞对Jurkat‑NFAT‑Luc‑GFP细胞株的激活情况。结果显示在相同共培养情况下，C10激活倍数最高，A10次之(图7)。选择C10和A10进一步人源化，并验证其功能。

[0113] d.采用氨基偶联的方案将EPHA2抗原偶联至BiaCore T200芯片上，使用C10/A10‑VHH抗体作为流动相对单域抗体进行亲和力测定，其亲和力均达到nM级别。

[0114] 4.单域抗体人源化设计

[0115] (21)根据单域抗体鉴定结果，对C10和A10进行人源化。抗体C10‑VHH的CDR1氨基酸序列如(SEQ ID NO:15)所示；CDR2氨基酸序列如(SEQ ID NO:16)所示；CDR3氨基酸序列如(SEQ ID NO:17)所示；抗体A10‑VHH的CDR1氨基酸序列如(SEQ ID NO:18)所示；CDR2氨基酸序列如(SEQ ID NO:19)所示；CDR3氨基酸序列如(SEQ ID NO:20)所示。采用CDR&SDR Grafting及Back mutation对C10和A10进行人源化。C10‑HM1人源化后氨基酸序列如(SEQ ID NO:21)所示，C10‑HM1人源化后核酸序列如(SEQ ID NO:22)所示；C10‑HM2人源化后氨基酸序列如(SEQ ID NO:23)所示，C10‑HM2人源化后核酸序列如(SEQ ID NO:24)所示；C10‑HM3人源化后氨基酸序列如(SEQ ID NO:25)所示，C10‑HM3人源化后核酸序列如(SEQ ID NO:26)所示；C10‑HM4人源化后氨基酸序列如(SEQ ID NO:27)所示，C10‑HM4人源化后核酸序列如(SEQ ID NO:28)所示；C10‑HM5人源化后氨基酸序列如(SEQ ID NO:29)所示，C10‑HM5人源化后核酸序列如(SEQ ID NO:30)所示。A10‑HM1人源化后氨基酸序列如(SEQ ID NO:31)所示，A10‑HM1人源化后核酸序列如(SEQ ID NO:32)所示；A10‑HM2人源化后氨基酸序列如(SEQ ID NO:33)所示，A10‑HM2人源化后核酸序列如(SEQ ID NO:34)所示；A10‑HM3人源化后氨基酸序列如(SEQ ID NO:35)所示，A10‑HM3人源化后核酸序列如(SEQ ID NO:
36)所示；A10‑HM4人源化后氨基酸序列如(SEQ ID NO:37)所示，A10‑HM4人源化后核酸序列如(SEQ ID NO:38)所示；A10‑HM5人源化后氨基酸序列如(SEQ ID NO:39)所示，A10‑HM5人源化后核酸序列如(SEQ ID NO:40)所示。

[0116] 5.CAR‑T细胞的制备和抗肿瘤活性研究

[0117] 选择C10和A10及各自人源化序列进行CAR‑T细胞制备和抗肿瘤活性研究。

[0118] (1)靶向EPHA2的嵌合抗原受体慢病毒表达载体构建

[0119] 以pCDH‑EF1a质粒为载体，构建表达EPHA2抗体的二代嵌合抗原受体的慢病毒质粒。包括pCDH‑EF1a‑C10‑BBZ、pCDH‑EF1a‑C10‑HM1‑BBZ、pCDH‑EF1a‑C10‑HM2‑BBZ、pCDH‑EF1a‑C10‑HM3‑BBZ、pCDH‑EF1a‑C10‑HM4‑BBZ、pCDH‑EF1a‑C10‑HM5‑BBZ、pCDH‑EF1a‑A10‑BBZ、pCDH‑EF1a‑A10‑HM1‑BBZ、pCDH‑EF1a‑A10‑HM2‑BBZ、pCDH‑EF1a‑A10‑HM3‑BBZ、pCDH‑EF1a‑A10‑HM4‑BBZ、pCDH‑EF1a‑A10‑HM5‑BBZ。

[0120] C10‑BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:41)、C10‑VHH(SEQ ID NO:10)、CD8铰链区(SEQ ID NO:42)、CD8跨膜区(SEQ IDNO:43)和胞内信号传导结构域4‑1BB(SEQ ID NO:44)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:45)组成。

[0121] C10‑HM1‑BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:41)、C10‑VHH(SEQ ID NO:22)、CD8铰链区(SEQ ID NO:42)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:43)和胞内信号传导结构域4‑1BB(SEQ ID NO:44)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:45)组成。

[0122] C10‑HM2‑BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:41)、C10‑VHH(SEQ ID NO:24)、CD8铰链区(SEQ ID NO:42)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:43)和胞内信号传导结构域4‑1BB(SEQ ID NO:44)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:45)组成。

[0123] C10‑HM3‑BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:41)、C10‑VHH(SEQ ID NO:26)、CD8铰链区(SEQ ID NO:42)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:43)和胞内信号传导结构域4‑1BB(SEQ ID NO:44)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:45)组成。

[0124] C10‑HM4‑BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:41)、C10‑VHH(SEQ ID NO:28)、CD8铰链区(SEQ ID NO:42)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:43)和胞内信号传导结构域4‑1BB(SEQ ID NO:44)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:45)组成。

[0125] C10‑HM5‑BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:41)、C10‑VHH(SEQ ID NO:30)、CD8铰链区(SEQ ID NO:42)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:43)和胞内信号传导结构域4‑1BB(SEQ ID NO:44)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:45)组成。

[0126] A10‑BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:41)、C10‑VHH(SEQ ID NO:14)、CD8铰链区(SEQ ID NO:42)、CD8跨膜区(SEQ IDNO:43)和胞内信号传导结构域4‑1BB(SEQ ID NO:44)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:45)组成。

[0127] A10‑HM1‑BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:41)、C10‑VHH(SEQ ID NO:32)、CD8铰链区(SEQ ID NO:42)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:43)和胞内信号传导结构域4‑1BB(SEQ ID NO:44)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:45)组成。

[0128] A10‑HM2‑BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:41)、C10‑VHH(SEQ ID NO:34)、CD8铰链区(SEQ ID NO:42)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:43)和胞内信号传导结构域4‑1BB(SEQ ID NO:44)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:45)组成。

[0129] A10‑HM3‑BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:41)、C10‑VHH(SEQ ID NO:36)、CD8铰链区(SEQ ID NO:42)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:43)和胞内信号传导结构域4‑1BB(SEQ ID NO:44)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:45)组成。

[0130] A10‑HM4‑BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:41)、C10‑VHH(SEQ ID NO:38)、CD8铰链区(SEQ ID NO:42)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:43)和胞内信号传导结构域4‑1BB(SEQ ID NO:44)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:45)组成。

[0131] A10‑HM5‑BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:41)、C10‑VHH(SEQ ID NO:40)、CD8铰链区(SEQ ID NO:42)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:43)和胞内信号传导结构域4‑1BB(SEQ ID NO:44)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:45)组成。

[0132] 上述所有质粒经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，得到转染级别质粒，用于HEK293F悬浮细胞慢病毒包装实验。

[0133] (2)靶向EPHA2的嵌合抗原受体慢病毒制备

[0134] a.用FreeStyle 293培养基将HEK293F细胞密度调整为4.5×106cells/mL，体积为包装体积的90％。暂置37.0℃大容量50振幅CO2叠加式恒温振荡器培养备用。

[0135] b.配制质粒/PEI复合物：准备2个无菌离心管，分别加入5％包装体积的FreeStyle 293培养基。向第一支离心管中依次加入一定比例的pLP1、pLP2、pLP/VSVG和pCDH‑EF1a‑CAR质粒，质粒总量180μg/100mL包装体积，轻轻混匀，室温孵育5min。向另一支离心管中加入PEI溶液，PEI用量(μg)＝质粒总量(μg)*3，轻轻混匀，室温孵育5min。

[0136] c.将上述孵育后的PEI稀释液加入到质粒稀释液中，并迅速充分混匀，垂直层流洁净工作台内室温孵育约12min。

[0137] d.转染：取出上述准备好的HEK293F细胞，边轻摇边加入制备好的质粒/PEI复合物，混匀，37.0℃、130rpm、振幅50.0mm、5.0％CO2培养过夜。

[0138] e.转染后约16‑18h。加入OPM‑CHO PFF06，体积为转染体系的10％，混匀，37.0℃、130rpm、振幅50.0mm、5.0％CO2培养过夜。

[0139] f.转染后约48h。3000×g、22.0℃离心15min，收集上清液病毒，用0.65μm针头滤器过滤。

[0140] g.核酸酶消化。按100U/mL向上述病毒液添加Super Nuclease溶液，上下颠倒5～8次混匀，4℃过夜处理约16h。

[0141] h.6000×g、4℃过夜离心约16h，弃上清。用1％包装体积DPBS(含10％人血白蛋白)重悬。取50ul病毒液检测感染滴度，剩余全部分装后置于‑80℃储存。

[0142] i.将不同稀释梯度的病毒液感染293T细胞，48h后，用流式细胞术检测被感染的阳性细胞率，并换算为病毒液的感染滴度，以便后续转导T细胞。

[0143] (3)CART细胞的制备

[0144] 一种含有上述重组表达载体的宿主细胞。我们用到的宿主细胞为人外周血T细胞或含有T细胞的细胞群。

[0145] a.外周血T细胞分离

[0146] 将5mL抗凝血样品转移至一个15mL无菌离心管，离心力800×g、离心降速设为最低，将血样室温离心20min。吸弃血清层，向下层的红色外周血细胞层加入等体积的生理盐水，混匀。

[0147] 向一个新的15mL离心管中加入5mL淋巴细胞分离液，然后将生理盐水稀释后的血样沿管壁缓慢添加至淋巴细胞分离试剂的上层，离心力800×g，转速下降速度设为最低，室温离心30min。吸取白色单核细胞层吸至一个新的15mL无菌离心管中，加入等体积的生理盐水，混匀。离心力800×g，离心5min。吸弃上清，加入5mL生理盐水，混匀，取部分细胞悬液进+行计数，流式细胞检测CD3T细胞比例。

[0148] 根据Dynabeads与CD3+T细胞数目比例为1:1，分离T细胞，取部分细胞悬液计数。

[0149] b.T细胞激活

[0150] 加入T细胞生长培养基(含X‑Vivo 15培养基、300IU/mL白介素2、10ng/mL白介素7、5ng/mL白介素15、5ng/mL白介素21)，调整T细胞密度1E6/mL。将细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养40h。

[0151] c.T细胞培转导

[0152] 从‑80℃冰箱中，取出慢病毒，冰上解冻。

[0153] 从培养箱中取出激活的T细胞，向培养器皿中加入polybrene至终浓度为6μg/mL，加入病毒液(MOI约50)，充分混匀，使用封口膜将培养器皿密封，800×g室温离心1h。

[0154] 离心后，将培养器皿于37℃、5％CO2的培养箱中，继续培养24h。

[0155] 400×g离心10min，弃掉含有病毒的培养基上清，用新鲜T细胞生长培养基重悬细6
胞沉淀，将细胞转移至新的培养器皿中，继续培养。维持细胞密度在1‑2x10/mL。

[0156] 培养4天后，取部分细胞用流式细胞仪检测T细胞表面CAR分子的表达。离心收集制备的CAR‑T细胞和NC‑T细胞(对照组)，PBS洗涤一次后弃上清，加入EPHA2‑huFc蛋白孵育30min；用PBS洗涤两次后弃上清，加入PE anti‑human IgGFc抗体避光孵育30min；用PBS洗涤两次后弃上清，重悬，最后流式细胞仪检测流式细胞仪检测CAR阳性的T细胞比例。CAR分子的表达效率约40％。

[0157] (4)靶向EPHA2 CAR‑T细胞的体外抗肿瘤活性

[0158] 通过细胞毒实验判断EPHA2 CART细胞的抗肿瘤活性。在比较UTD、C10‑BBZ、C10‑HM1‑BBZ、C10‑HM2‑BBZ、C10‑HM3‑BBZ、C10‑HM4‑BBZ、C10‑HM5‑BBZ、A10‑BBZ、A10‑HM1‑BBZ、A10‑HM2‑BBZ、C10‑HM3‑BBZ、C10‑HM4‑BBZ、C10‑HM5‑BBZ CAR‑T细胞的体外杀伤活性时，十二种CAR T细胞的感染阳性率分别为27.8％、22.6％、21.8％、27.8％、27.0％、27.8％、31.2％、28.7％、30.9％、25.1％、30.7％以及28.2％。

[0159] a.内源性表达EPHA2的U251‑Luc、U87‑Luc细胞作为靶细胞，用RPMI1640完全培养5 4
基调整密度为5*10个/mL，然后100μL/孔，96孔板，即5*10个/孔。

[0160] b.CAR‑T细胞和UTD为效应细胞，同时用RPMI1640完全培养基分别调整至合适密度，实验组按照效应细胞：靶细胞＝2.5:1，5:1，10:1的比例分别加入靶细胞孔内，100μL/孔。同时设置对照组为不加效应细胞组，即靶细胞萤光释放最大孔。每个比例设2个复孔[0161] c.放置37℃、5％CO2培养箱中培养18h。

[0162] d.根据板布局，每孔转移100uL细胞悬液至全白酶标板，每孔加入100uL D‑luciferin，混匀，全程避光操作，且动作要迅速，静置5min。用多功能酶标仪生物发光信号检测系统进行检测。细胞毒性计算公式为：％细胞毒性＝[(对照组‑实验组)/对照组]*100。
结果显示均有显著的抗肿瘤活性，在中E:T比(5:1)时裂解超过85％的肿瘤细胞(优于CN 
113980138A)。综合看，其中C10‑HM3/C10‑HM5/A10‑HM4抗肿瘤活性比人源化之前的C10、A10及其他人源化序列都好，图8。后续进行动物体内抗肿瘤效果评价。

[0163] CART与靶细胞共培养后IFN‑γ分泌检测

[0164] a.U251‑Luc、U87‑Luc细胞作为靶细胞(含EPHA2靶蛋白)，用RPMI1640完全培养基5 4
调整密度为5*10/mL，然后100μL/孔，96孔板，即5*10个/孔。

[0165] b.CAR‑T细胞和UTD(对照组)为效应细胞，同时用RPMI1640完全培养基分别调整至6
2.5×10/mL，加入靶细胞孔内，100μL/孔，设3个复孔。

[0166] c.放置37℃、5％CO2培养箱中培养18h。

[0167] d.准备ELISA板，并进行包被、封闭。

[0168] 包被capture antibody：使用PBS稀释capture antibody至2μg/mL，96孔ELISA板，100μL/孔。4℃孵育过夜。

[0169] 封闭：先用PBST洗板三次，再使用1％BSA‑PBS室温封闭1h，300μL/孔。

[0170] e.将96孔细胞板置于离心机，800×g，室温离心5min，收集培养上清。

[0171] f.加样品：先用PBST洗板三次，再分别加入收集的培养上清和标准品【9.38pg/mL‑600pg/mL】，100μL/孔，室温孵育2h。

[0172] g.加detection antibody：先用PBST洗板三次，再使用PBS稀释detection antibody至125ng/mL，100μL/孔，室温孵育2h。

[0173] h.加Streptavidin‑HRP B：先用PBST洗板三次，再使用PBS将Streptavidin‑HRP B稀释40倍，100μL/孔，室温孵育20min，注意避光。

[0174] i.加显色液：先用PBST洗板三次，再加入显色液，100μL/孔，室温孵育20min，注意避光。

[0175] g.终止反应：加入2M H2SO4，50μL/孔，注意避光。

[0176] k.检测：用多功能酶标仪读取OD450，参考波长540nm.

[0177] 分析数据，CAR‑T组比UTD组明显增高，说明CAR‑T在表达EPHA2的肿瘤细胞刺激下，能够分泌大量IFN‑γ。

[0178] CART与靶细胞共培养后IL‑2释放情况

[0179] a.U251‑Luc、U87‑Luc细胞作为靶细胞(含EPHA2靶蛋白)，用RPMI1640完全培养基5
调整密度为5×10/mL，然后100μL/孔，96孔板，即5×104个/孔。

[0180] b.CAR‑T细胞和UTD(对照组)为效应细胞，同时用RPMI1640完全培养基分别调整至6
2.5×10/mL，加入靶细胞孔内，100μL/孔，每个比例设3个复孔。

[0181] c.放置37℃、5％CO2培养箱中培养18h。

[0182] d.准备ELISA板，并进行包被、封闭。

[0183] 包被capture antibody：PBS稀释capture antibody至4μg/mL，96孔ELISA板，100μL/孔。4℃孵育过夜。

[0184] 封闭：先用PBST洗板三次，再使用1％BSA‑PBS室温封闭1h，300μL/孔。

[0185] e.将96孔细胞板置于离心机，800×g，室温离心5min，收集培养上清。

[0186] f.加样品：先用PBST洗板三次，再分别加入收集的培养上清和标准品【15.6pg/mL‑1000pg/mL】，100μL/孔，室温孵育2h。

[0187] g.加detection antibody：先用PBST洗板三次，再使用PBS稀释detection antibody至100ng/mL，100μL/孔，室温孵育2h。

[0188] h.加Streptavidin‑HRP B：先用PBST洗板三次，再使用PBS将Streptavidin‑HRP B稀释40倍，100μL/孔，室温孵育20min，注意避光。

[0189] i.加显色液：先用PBST洗板三次，再加入显色液，100μL/孔，室温孵育20min，注意避光。

[0190] g.终止反应：加入2M H2SO4，50μL/孔，注意避光。

[0191] k.检测：用多功能酶标仪读取OD450，参考波长540nm.

[0192] 分析数据，CAR‑T组比UTD组明显增高，说明CAR‑T在表达EPHA2的肿瘤细胞刺激下，能够分泌大量IL‑2。

[0193] (5)靶向EPHA2 CAR‑T细胞的动物体内抗肿瘤活性

[0194] NSG小鼠在NOD‑SCID的基础上敲除Il2rg基因，是一种严重免疫缺陷小鼠，缺失成熟T、B、NK细胞，是人源化小鼠、异种移植、免疫重建的重要载体；对于研究人类造血干细胞、肿瘤发生与治疗、免疫缺陷疾病与体内免疫机制研究都具有重要意义。是目前国际公认的免疫缺陷程度较高、较适合人源细胞或组织移植的工具小鼠。

[0195] a.收获对数生长期的U87细胞，用PBS重悬细胞，调整细胞密度为1.5×107/mL，将其与Matrigel基质胶1:1(v:v)混合。以200ul/只体积，接种于6～8周龄雌性NSG小鼠右侧前腋皮下，以建立胶质瘤异种移植小鼠模型。

[0196] b.每天观察小鼠的健康状况及成瘤情况，约14天后瘤体积达到100‑300mm3。

[0197] c.将小鼠平均分为6组，C10‑HM5/C10‑HM3/A10‑HM4/UTD/Temozolomide(临床常规7
用小分子药)/PBS，每组8只。每只小鼠尾静脉注射1×10 个CART细胞进行单次治疗(低于CN113980138A给药剂量)。

[0198] d.给药后，每天观察小鼠一般症状，共40天，实验终末安乐死处死小鼠并进行解剖。每隔3‑4天测量U87移植瘤体积的大小，记录每组小鼠瘤体积的变化和存活情况，并绘制瘤体积随时间的生长曲线和小鼠存活曲线。结果显示C10‑HM5/C10‑HM3/A10‑HM4 CAR‑T细胞均能有效抑制U87细胞增殖，图9。且在对照组UTD/Temozolomide/PBS小鼠全部死亡时，只有C10‑HM5/C10‑HM3 CAR‑T治疗组小鼠全部存活40d以上，靶向EPHA2 CAR‑T细胞在动物体内的抗肿瘤活性显著(在12‑16天，实验组小鼠移植瘤几乎被完全抑制，瘤体积已经几乎测量不到，结果优于CN113980138A)。图10。抗体C10‑HM3的CDR1氨基酸序列如(SEQ ID NO:46)所示；CDR2氨基酸序列如(SEQ ID NO:47)所示；CDR3氨基酸序列如(SEQ ID NO:48)所示；抗体C10‑HM5的CDR1氨基酸序列如(SEQ ID NO:49)所示；CDR2氨基酸序列如(SEQ ID NO:50)所示；CDR3氨基酸序列如(SEQ ID NO:51)所示；抗体A10‑HM4的CDR1氨基酸序列如(SEQ ID NO:52)所示；CDR2氨基酸序列如(SEQ ID NO:53)所示；CDR3氨基酸序列如(SEQ ID NO:54)所示。以C10‑HM3 CAR‑T为例，进一步摸索CAR‑T细胞治疗剂量。

[0199] (6)靶向EPHA2 CAR‑T细胞在动物体内抗肿瘤活性剂量

[0200] 为了进一步检测EPHA2‑CAR T细胞在体内抗肿瘤活性剂量，我们将U87细胞

[0201] 注射到6～8周龄雌性NSG小鼠皮下，左侧腋下皮下注射1.5×106个U87细胞，建立3
了胶质瘤异种移植小鼠模型。U87移植瘤体积达到100‑300mm时，将小鼠分为5组，C10‑HM3‑
6 6
1E6/C10‑HM3‑2E6/C10‑HM3‑4E6/UTD/PBS，每组8只。每只小鼠尾静脉注射1×10/2×10 /4
6
×10 个CART细胞进行单次治疗。给药后，密切观察小鼠一般症状，每周2‑3次测量小鼠U87移植瘤体积大小，记录每组小鼠瘤体积的变化和存活情况，并绘制瘤体积随时间的生长曲线和小鼠存活曲线，实验终末安乐死处死小鼠并进行解剖。结果显示C10‑HM3‑1E6/C10‑HM3‑2E6/C10‑HM3‑4E6 CAR‑T细胞均能有效抑制U87细胞增殖，图11。且在对照组UTD/PBS小鼠全部死亡时，三个不同剂量的CAR‑T治疗组小鼠全部存活40d以上，即时是最低治疗剂量1
6
×10也表现了靶向EPHA2 CAR‑T细胞在动物体内的抗肿瘤活性显著，(在12天，实验组小鼠移植瘤已被完全抑制，瘤体积已经测量不到)，图12。降低CART治疗剂量后，动物治疗药效结果依然很好，说明药效强，将来与同等产品比及有可能会有成本低、安全性高的优势。在D3/D7/D14/D28采血，均能检测到检测CART细胞，说明EPHA2 CAR‑T细胞在动物体内存续性不错。为下一步临床试验研究奠定了良好的基础。

[0202] 实施例中涉及的氨基酸及核苷酸序列

[0203] (1)EPHA2蛋白序列

[0204] AQGKEVVLLDFAAAGGELGWLTHPYGKGWDLMQNIMNDMPIYMYSVCNVMSGDQDNWLRTNWVYRGEAERIFIELKFTVRDCNSFPGGASSCKETFNLYYAESDLDYGTNFQKRLFTKIDTIAPDEITVSSDFEARHVKLNVEERSVGPLTRKGFYLAFQDIGACVALLSVRVYYKKCPELLQGLAHFPETIAGSDAPSLATVAGTCVDHAVVPPGGEEPRMHCAVDGEWLVPIGQCLCQAGYEKVEDACQACSPGFFKFEASESPCLECPEHTLPSPEGATSCECEEGFFRAPQDPASMPCTRPPSAPHYLTAVGMGAKVELRWTPPQDSGGREDIVYSVTCEQCWPESGECGPCEASVRYSEPPHGLTRTSVTVSDLEPHMNYTFTVEARNGVSGLVTSRSFRTASVSINQTEPPKVRLEGRSTTSLSVSWSIPPPQQSRVWKYEVTYRKKGDSNSYNVRRTEGFSVTLDDLAPDTTYLVQVQALTQEGQGAGSKVHEFQTLSPEGSGNLAV

[0205] (2)EPHA2核酸序列

[0206] GCTCAGGGAAAAGAAGTGGTGCTGCTGGACTTTGCTGCCGCTGGCGGAGAACTTGGATGGCTGACACACCCTTACGGCAAAGGCTGGGACCTGATGCAGAACATCATGAACGACATGCCCATCTACATGTACAGCGTGTGCAACGTGATGAGCGGCGACCAGGACAATTGGCTGAGGACCAACTGGGTGTACAGAGGCGAGGCCGAGCGGATCTTCATCGAGCTGAAGTTCACCGTGCGGGACTGCAACAGCTTTCCTGGCGGAGCCAGCAGCTGCAAAGAGACATTCAACCTGTACTACGCCGAGAGCGACCTGGACTACGGCACCAACTTCCAGAAGCGGCTGTTCACCAAGATCGACACAATCGCCCCTGACGAGATCACCGTGTCCAGCGATTTTGAGGCCCGGCACGTGAAGCTGAACGTGGAAGAAAGAAGCGTGGGCCCTCTGACCAGAAAGGGCTTCTACCTGGCCTTCCAGGATATCGGAGCCTGTGTGGCACTGCTGTCTGTGCGGGTGTACTACAAGAAGTGCCCCGAGCTGCTGCAAGGCCTGGCTCACTTTCCTGAGACAATCGCCGGAAGCGACGCCCCATCTCTGGCTACAGTTGCCGGCACATGTGTGGATCATGCCGTGGTTCCACCTGGCGGCGAGGAACCTAGAATGCACTGTGCTGTGGATGGCGAGTGGCTGGTGCCTATCGGACAGTGTCTGTGTCAGGCCGGCTACGAGAAGGTGGAAGATGCCTGTCAGGCCTGCTCTCCCGGCTTCTTCAAGTTTGAGGCCAGCGAGAGCCCCTGCCTGGAATGTCCTGAACACACCCTGCCATCTCCAGAGGGCGCCACATCTTGCGAGTGCGAGGAAGGCTTCTTTCGGGCCCCTCAGGATCCAGCCAGCATGCCTTGTACCAGACCTCCAAGCGCTCCCCACTATCTGACAGCCGTTGGAATGGGCGCCAAAGTGGAACTGAGATGGACCCCTCCACAGGACAGCGGCGGCAGAGAAGATATCGTGTACTCCGTGACCTGCGAGCAGTGCTGGCCTGAGTCTGGCGAATGTGGACCTTGTGAAGCCAGCGTGCGGTACTCTGAACCTCCTCACGGACTGACAAGAACCAGCGTGACCGTGTCCGACCTGGAACCTCACATGAACTACACCTTCACCGTGGAAGCCCGGAATGGCGTGTCCGGACTGGTCACCAGCAGAAGCTTTAGAACCGCCAGCGTGTCCATCAACCAGACCGAGCCTCCAAAAGTGCGGCTGGAAGGCAGAAGCACCACAAGCCTGTCCGTGTCTTGGAGCATCCCTCCACCTCAGCAGAGCAGAGTGTGGAAGTACGAAGTGACCTACCGGAAGAAGGGCGACAGCAACAGCTACAACGTGCGGAGAACCGAGGGCTTTAGCGTGACCCTGGATGATCTGGCCCCTGACACCACATACCTGGTGCAGGTTCAGGCCCTGACACAAGAAGGACAAGGCGCCGGATCTAAGGTGCACGAGTTCCAGACACTGAGCCCTGAAGGCAGCGGAAACCTGGCTGTG

[0207] (3)EPHA2_huFc蛋白序列

[0208] AQGKEVVLLDFAAAGGELGWLTHPYGKGWDLMQNIMNDMPIYMYSVCNVMSGDQDNWLRTNWVYRGEAERIFIELKFTVRDCNSFPGGASSCKETFNLYYAESDLDYGTNFQKRLFTKIDTIAPDEITVSSDFEARHVKLNVEERSVGPLTRKGFYLAFQDIGACVALLSVRVYYKKCPELLQGLAHFPETIAGSDAPSLATVAGTCVDHAVVPPGGEEPRMHCAVDGEWLVPIGQCLCQAGYEKVEDACQACSPGFFKFEASESPCLECPEHTLPSPEGATSCECEEGFFRAPQDPASMPCTRPPSAPHYLTAVGMGAKVELRWTPPQDSGGREDIVYSVTCEQCWPESGECGPCEASVRYSEPPHGLTRTSVTVSDLEPHMNYTFTVEARNGVSGLVTSRSFRTASVSINQTEPPKVRLEGRSTTSLSVSWSIPPPQQSRVWKYEVTYRKKGDSNSYNVRRTEGFSVTLDDLAPDTTYLVQVQALTQEGQGAGSKVHEFQTLSPEGSGNLAVHHHHHHDDDDKMDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

[0209] (4)EPHA2_huFc核酸序列

[0210] GCTCAGGGAAAAGAAGTGGTGCTGCTGGACTTTGCTGCCGCTGGCGGAGAACTTGGATGGCTGACACACCCTTACGGCAAAGGCTGGGACCTGATGCAGAACATCATGAACGACATGCCCATCTACATGTACAGCGTGTGCAACGTGATGAGCGGCGACCAGGACAATTGGCTGAGGACCAACTGGGTGTACAGAGGCGAGGCCGAGCGGATCTTCATCGAGCTGAAGTTCACCGTGCGGGACTGCAACAGCTTTCCTGGCGGAGCCAGCAGCTGCAAAGAGACATTCAACCTGTACTACGCCGAGAGCGACCTGGACTACGGCACCAACTTCCAGAAGCGGCTGTTCACCAAGATCGACACAATCGCCCCTGACGAGATCACCGTGTCCAGCGATTTTGAGGCCCGGCACGTGAAGCTGAACGTGGAAGAAAGAAGCGTGGGCCCTCTGACCAGAAAGGGCTTCTACCTGGCCTTCCAGGATATCGGAGCCTGTGTGGCACTGCTGTCTGTGCGGGTGTACTACAAGAAGTGCCCCGAGCTGCTGCAAGGCCTGGCTCACTTTCCTGAGACAATCGCCGGAAGCGACGCCCCATCTCTGGCTACAGTTGCCGGCACATGTGTGGATCATGCCGTGGTTCCACCTGGCGGCGAGGAACCTAGAATGCACTGTGCTGTGGATGGCGAGTGGCTGGTGCCTATCGGACAGTGTCTGTGTCAGGCCGGCTACGAGAAGGTGGAAGATGCCTGTCAGGCCTGCTCTCCCGGCTTCTTCAAGTTTGAGGCCAGCGAGAGCCCCTGCCTGGAATGTCCTGAACACACCCTGCCATCTCCAGAGGGCGCCACATCTTGCGAGTGCGAGGAAGGCTTCTTTCGGGCCCCTCAGGATCCAGCCAGCATGCCTTGTACCAGACCTCCAAGCGCTCCCCACTATCTGACAGCCGTTGGAATGGGCGCCAAAGTGGAACTGAGATGGACCCCTCCACAGGACAGCGGCGGCAGAGAAGATATCGTGTACTCCGTGACCTGCGAGCAGTGCTGGCCTGAGTCTGGCGAATGTGGACCTTGTGAAGCCAGCGTGCGGTACTCTGAACCTCCTCACGGACTGACAAGAACCAGCGTGACCGTGTCCGACCTGGAACCTCACATGAACTACACCTTCACCGTGGAAGCCCGGAATGGCGTGTCCGGACTGGTCACCAGCAGAAGCTTTAGAACCGCCAGCGTGTCCATCAACCAGACCGAGCCTCCAAAAGTGCGGCTGGAAGGCAGAAGCACCACAAGCCTGTCCGTGTCTTGGAGCATCCCTCCACCTCAGCAGAGCAGAGTGTGGAAGTACGAAGTGACCTACCGGAAGAAGGGCGACAGCAACAGCTACAACGTGCGGAGAACCGAGGGCTTTAGCGTGACCCTGGATGATCTGGCCCCTGACACCACATACCTGGTGCAGGTTCAGGCCCTGACACAAGAAGGACAAGGCGCCGGATCTAAGGTGCACGAGTTCCAGACACTGAGCCCTGAAGGCAGCGGAAACCTGGCTGTGCACCATCACCATCACCATGATGACGATGACAAGATGGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA

[0211] (5)A5‑VHH氨基酸序列

[0212] QLKVVESGGGLVQPGGSLKLSCAASQSIFDFNAMDWYRQAPGKQRELVARIENGGNTSYYNSVQGRFAISRDNVKNTVYLQMNELKPEDTAVYFCCALRTKAWGPDEYYWGQGTQVTVSS

[0213] (6)A5‑VHH核酸序列

[0214] CAGCTGAAGGTTGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAAGCTGTCTTGTGCCGCCAGCCAGAGCATCTTCGACTTCAACGCCATGGACTGGTACAGACAGGCCCCTGGCAAACAGAGAGAGCTGGTCGCCAGAATCGAGAACGGCGGCAACACCAGCTACTACAACAGCGTGCAGGGCAGATTCGCCATCAGCCGGGACAACGTGAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACGAGCTGAAGCCCGAGGATACCGCCGTGTACTTCTGTTGTGCCCTGCGGACAAAAGCCTGGGGACCCGATGAGTACTATTGGGGCCAGGGCACCCAAGTGACCGTGTCATCT

[0215] (7)A2‑VHH氨基酸序列

[0216] QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASTSIFNFNAMDWYRQAPGKERELVARIENGGNTSYTNSVQGRFTISRDSVKNTVYLQMNALKPEDTAVYFCCALRTKAWGPDEFHWGQGAQVTVSS

[0217] (8)A2‑VHH核酸序列

[0218] CAGGTTCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCACCAGCATCTTCAACTTCAACGCCATGGACTGGTACAGACAGGCCCCTGGCAAAGAGAGAGAGCTGGTCGCCAGAATCGAGAACGGCGGCAATACCAGCTACACCAACAGCGTGCAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAGCGTGAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACGCCCTGAAGCCTGAGGATACCGCCGTGTACTTCTGCTGTGCCCTGAGGACAAAAGCCTGGGGACCCGATGAGTTTCACTGGGGACAAGGCGCCCAAGTGACCGTGTCATCT

[0219] (9)C10‑VHH氨基酸序列

[0220] AVQLVESGGGLVQPGGSLRLACVASGRTQSTYNTGWFRQAPGKEREFVASITWSSDNWYHADSVRGRFTISRDNAKNAVYLQMNSLKPEDTAVYYCATSTAWSTLATRYDNWGQGAQVTVSS

[0221] (10)C10‑VHH核酸序列

[0222] GCTGTTCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGGCCTGTGTGGCCTCTGGCAGAACCCAGAGCACATACAACACCGGCTGGTTCAGACAGGCCCCTGGCAAAGAGAGAGAGTTCGTCGCCAGCATCACCTGGTCCAGCGACAACTGGTATCACGCCGATTCTGTGCGGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAATGCCAAGAACGCCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCTGAGGACACAGCCGTGTACTACTGTGCCACCAGCACCGCCTGGTCTACCCTGGCCACCAGATACGATAATTGGGGCCAGGGCGCCCAAGTGACCGTTTCTTCT

[0223] (11)A12‑VHH氨基酸序列

[0224] MAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGVIFSRHDMAWYRQAAGKQREVVATIGTGPIITYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCYIPRAWGSDYWGQGTQVTVSS

[0225] (12)A12‑VHH核酸序列

[0226] ATGGCTCAGGTGCAGCTTGTTGAATCTGGCGGCGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCTGCCAGCGGCGTGATCTTCAGCAGACACGACATGGCCTGGTACAGACAGGCCGCTGGAAAGCAGAGAGAGGTGGTCGCCACAATCGGCACAGGCCCCATCATCACATACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCTGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCTACATCCCTAGAGCCTGGGGCAGCGATTATTGGGGCCAGGGAACACAAGTGACCGTGTCCTCT

[0227] (13)A10‑VHH氨基酸序列

[0228] EVQLAESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIDFSISDMAWYRQAPGKQREVVAFVSSGNLIQYSESAKGRFTISRDNAKNSVHLEMNNVKPEDTGVYLCYARTYSNGLRIHWGQGTQVTVST

[0229] (14)A10‑VHH核酸序列

[0230] GAAGTTCAGCTGGCTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCTGGCATCGACTTCAGCATCAGCGACATGGCCTGGTACAGACAGGCCCCTGGCAAGCAGAGAGAAGTGGTCGCCTTTGTGTCCAGCGGCAACCTGATCCAGTACAGCGAGTCTGCCAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCGTGCACCTGGAAATGAACAACGTGAAGCCCGAGGACACCGGCGTGTACCTGTGTTACGCCAGAACCTACAGCAACGGCCTGAGAATCCACTGGGGCCAGGGAACCCAAGTGACCGTGTCTACA

[0231] (15)C10‑CDR1氨基酸序列

[0232] GRTQSTYN

[0233] (16)C10‑CDR2氨基酸序列

[0234] ITWSSDNW

[0235] (17)C10‑CDR3氨基酸序列

[0236] ATSTAWSTLATRYDN

[0237] (18)A10‑CDR1氨基酸序列

[0238] GIDFSISD

[0239] (19)A10‑CDR2氨基酸序列

[0240] VSSGNL

[0241] (20)A10‑CDR3氨基酸序列

[0242] YARTYSNGLRIH

[0243] (21)C10‑HM1氨基酸序列

[0244] EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRTQSTYNTGWFRQAPGKGREFVASITWSSDNWYHADSVKGRFTISRDNAKNAVYLQMNSLRAEDTAVYYCATSTAWSTLATRYDNWGQGTTVTVSS

[0245] (22)C10‑HM1核酸序列

[0246] GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGCGGACTTGTGAAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCTCTGGCAGAACCCAGAGCACATACAATACCGGCTGGTTCAGACAGGCCCCTGGCAAGGGCAGAGAATTTGTGGCCAGCATCACCTGGTCCAGCGACAACTGGTATCACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACGCCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGTGCCACAAGCACCGCCTGGTCTACCCTGGCCACCAGATACGATAATTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTTTCTTCT

[0247] (23)C10‑HM2氨基酸序列

[0248] AVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCVASGRTQSTYNTGWFRQAPGKGREFVASITWSSDNWYHADSVKGRFTISRDNAKNAVYLQMNSLRAEDTAVYYCATSTAWSTLATRYDNWGQGTTVTVSS

[0249] (24)C10‑HM2核酸序列

[0250] GCTGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGCGGACTTGTGAAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGTGGCCTCTGGCAGAACCCAGAGCACCTACAATACCGGCTGGTTCAGACAGGCCCCTGGCAAGGGCAGAGAATTTGTGGCCAGCATCACCTGGTCCAGCGACAACTGGTATCACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACGCCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGTGCCACAAGCACCGCCTGGTCTACCCTGGCCACCAGATACGATAATTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTTTCTTCT

[0251] (25)C10‑HM3氨基酸序列

[0252] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTQSTYNTGWFRQAPGKGREFVASITWSSDNWYHADSVKGRFTISRDNAKNAVYLQMNSLRAEDTAVYYCATSTAWSTLATRYDNWGQGTTVTVSS

[0253] (26)C10‑HM3核酸序列

[0254] GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCTGGCAGAACCCAGAGCACCTATAATACCGGCTGGTTCAGACAGGCCCCTGGCAAGGGCAGAGAATTTGTGGCCAGCATCACCTGGTCCAGCGACAACTGGTATCACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACGCCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGTGCCACAAGCACCGCCTGGTCTACCCTGGCCACCAGATACGATAATTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTTTCTTCT

[0255] (27)C10‑HM4氨基酸序列

[0256] AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGRTQSTYNTGWFRQAPGKGREFVASITWSSDNWYHADSVKGRFTISRDNAKNAVYLQMNSLRAEDTAVYYCATSTAWSTLATRYDNWGQGTTVTVSS

[0257] (28)C10‑HM4核酸序列

[0258] GCTGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGTGGCCTCTGGCAGAACCCAGAGCACCTACAATACCGGCTGGTTCAGACAGGCCCCTGGCAAGGGCAGAGAATTTGTGGCCAGCATCACCTGGTCCAGCGACAACTGGTATCACGCCGACAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACGCCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGTGCCACAAGCACCGCCTGGTCTACCCTGGCCACCAGATACGATAATTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTTTCTTCT

[0259] (29)C10‑HM5氨基酸序列

[0260] EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGRTQSTYNTGWFRQAPGKGREFVASITWSSDNWYHADSVRGRFTISRDNAKNAVYLQMNSLRAEDTAVYYCATSTAWSTLATRYDNWGQGTTVTVSS

[0261] (30)C10‑HM5核酸序列

[0262] GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGCGGACTTGTGAAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCTCTGGCAGAACCCAGAGCACATACAATACCGGCTGGTTCAGACAGGCCCCTGGCAAGGGCAGAGAATTTGTGGCCAGCATCACCTGGTCCAGCGACAACTGGTATCACGCCGATTCTGTGCGGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAATGCCAAGAACGCCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGTGCCACAAGCACCGCCTGGTCTACCCTGGCCACCAGATACGATAATTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTTTCTTCT

[0263] (31)A10‑HM1氨基酸序列

[0264] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIDFSISDMAWYRQAPGKGREWVAYVSSGNLIQYADSVKGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRAEDTAVYYCYARTYSNGLRIHWGQGTLVTVSS

[0265] (32)A10‑HM1核酸序列

[0266] GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCATCGACTTCAGCATCTCTGACATGGCCTGGTACAGACAGGCCCCTGGCAAGGGCAGAGAATGGGTCGCATATGTGTCCAGCGGCAACCTGATCCAGTACGCCGATAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTTACGCCCGGACCTACAGCAACGGCCTGAGAATCCATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTTTCTTCT

[0267] (33)A10‑HM2氨基酸序列

[0268] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIDFSISDMAWYRQAPGKGREVVAFVSSGNLIQYADSVKGRFTISRDNAKNSVHLQMNSLRAEDTAVYLCYARTYSNGLRIHWGQGTLVTVSS

[0269] (34)A10‑HM2核酸序列

[0270] GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCATCGACTTCAGCATCTCTGACATGGCCTGGTACAGACAGGCCCCTGGCAAGGGAAGAGAAGTGGTGGCCTTTGTGTCCAGCGGCAACCTGATCCAGTACGCCGATAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACTCCGTGCACCTCCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGATACCGCCGTGTACCTGTGTTACGCCCGGACCTACAGCAACGGCCTGAGAATCCATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTTTCTTCT

[0271] (35)A10‑HM3氨基酸序列

[0272] EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGIDFSISDMAWYRQAPGKGREWVSFVSSGNLIQYADSVKGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRAEDTAVYLCYARTYSNGLRIHWGQGTLVTVSS

[0273] (36)A10‑HM3核酸序列

[0274] GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGCGGACTTGTGAAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCTCTGGCATCGACTTCAGCATCAGCGACATGGCCTGGTACAGACAGGCCCCTGGCAAGGGCAGAGAATGGGTGTCCTTTGTGTCCAGCGGCAACCTGATCCAGTACGCCGATAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTATCTGTGTTACGCCCGGACCTACAGCAACGGCCTGAGAATCCATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTTTCTTCT

[0275] (37)A10‑HM4氨基酸序列

[0276] EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGIDFSISDMAWYRQAPGKGREVVAFVSSGNLIQYADSVKGRFTISRDNAKNSVHLQMNSLRAEDTAVYLCYARTYSNGLRIHWGQGTLVTVSS

[0277] (38)A10‑HM4核酸序列

[0278] GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGCGGACTTGTGAAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCTCTGGCATCGACTTCAGCATCAGCGACATGGCCTGGTACAGACAGGCCCCTGGCAAGGGAAGAGAAGTGGTGGCCTTTGTGTCCAGCGGCAACCTGATCCAGTACGCCGATAGCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACTCCGTGCACCTCCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGATACCGCCGTGTACCTGTGTTACGCCCGGACCTACAGCAACGGCCTGAGAATCCATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTTTCTTCT

[0279] (39)A10‑HM5氨基酸序列

[0280] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIDFSISDMAWYRQAPGKGREVVAFVSSGNLIQYADSAKGRFTISRDNAKNSVHLQMNSLRAEDTAVYLCYARTYSNGLRIHWGQGTLVTVSS

[0281] (40)A10‑HM5核酸序列

[0282] GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCATCGACTTCAGCATCTCTGACATGGCCTGGTACAGACAGGCCCCTGGCAAGGGAAGAGAAGTGGTGGCCTTTGTGTCCAGCGGCAACCTGATCCAGTACGCCGATTCTGCCAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACTCCGTGCACCTCCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGATACCGCCGTGTACCTGTGTTACGCCCGGACCTACAGCAACGGCCTGAGAATCCATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTTTCTTCT

[0283] (41)CD8α信号肽

[0284] ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCC

[0285] (42)CD8铰链区

[0286] ACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGAT

[0287] (43)CD8跨膜区

[0288] ATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGT

[0289] (44)4‑1BB

[0290] AAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTG

[0291] (45)CD3ξ

[0292] CGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG

[0293] (46)CD10‑HM3‑CDR1氨基酸序列

[0294] GRTQSTYN

[0295] (47)C10‑HM3‑CDR2氨基酸序列

[0296] ITWSSDNW

[0297] (48)C10‑HM3‑CDR3氨基酸序列

[0298] ATSTAWSTLATRYDN

[0299] (49)C10‑HM5‑CDR1氨基酸序列

[0300] GRTQSTYN

[0301] (50)C10‑HM5‑CDR2氨基酸序列

[0302] ITWSSDNW

[0303] (51)C10‑HM5‑CDR3氨基酸序列

[0304] ATSTAWSTLATRYDN

[0305] (52)A10‑HM4‑CDR1氨基酸序列

[0306] GIDFSISD

[0307] (53)A10‑HM4‑CDR2氨基酸序列

[0308] VSSGNL

[0309] (54)A10‑HM4‑CDR3氨基酸序列

[0310] YARTYSNGLRIH