一种脾脏中高表达的阳离子脂质化合物、包含其的组合物及用途

摘要

本发明提供一种式(I)化合物或其N‑氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，还提供了包含前述化合物的组合物以及它们用于递送治疗剂或预防剂的用途。

权利要求

1.下式化合物或其药学上可接受的盐，

。

2.下式化合物或其药学上可接受的盐，

。

3.一种组合物，其包含载体，所述载体包括阳离子脂质，所述阳离子脂质包括权利要求

1 2中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。

~

4.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述阳离子脂质占载体的摩尔比为25% 75%。

~

5.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述载体还包含中性脂质。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述阳离子脂质与所述中性脂质的摩尔比为1:

1 15:1。

~

7. 根据权利要求6所述的组合物，其中，所述阳离子脂质与所述中性脂质的摩尔比为

4.9: 1。

8.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述中性脂质包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、神经酰胺、甾醇及其衍生物中的一种或多种。

9. 根据权利要求8所述的组合物，其中，所述中性脂质选自以下中的一种或多种：1,2‑二亚油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(DLPC)、1,2‑二肉豆蔻酰基‑sn‑甘油‑磷酸胆碱(DMPC)、

1,2‑二油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(DOPC)、1,2‑二棕榈酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(DPPC)、1,2‑二硬脂酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(DSPC)、1,2‑双十一烷酰基‑sn‑甘油‑磷酸胆碱(DUPC)、1‑棕榈酰基‑2‑油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(POPC)、1,2‑二‑O‑十八碳烯基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(18:0 Diether PC)、1‑油酰基‑2‑胆固醇基半琥珀酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(OChemsPC)、1‑十六烷基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2‑二亚麻酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱、1,2‑二花生四烯酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱、1,2‑双二十二碳六烯酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱、1,2‑二油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2‑二植烷酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺(ME 16.0 PE)、1,2‑二硬脂酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺、1,2‑二亚油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺、1,2‑二亚麻酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺、1,2‑二花生四烯酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺、1,2‑双二十二碳六烯酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺、1,2‑二油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸‑rac‑(1‑甘油)钠盐(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基‑磷脂酰‑乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、1‑硬脂酰基‑2‑油酰基‑硬脂酰乙醇胺(SOPE)、1‑硬脂酰基‑2‑油酰基‑磷脂酰胆碱(SOPC)、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)以及其混合物。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中，所述中性脂质为1,2‑二油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺(DOPE)和/或1,2‑二硬脂酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(DSPC)。

11.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述载体还包含结构性脂质。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中，所述阳离子脂质与所述结构性脂质的摩尔比为0.6:1 3:1。

~

13.根据权利要求11所述的组合物，其中，所述结构性脂质选自以下中的一种或多种：胆固醇、非甾醇、谷固醇、麦角固醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、番茄碱、熊果酸、α‑生育酚、皮质类固醇。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中，所述结构性脂质为胆固醇。

15.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述载体还包含聚合物共轭脂质。

16.根据权利要求15所述的组合物，其中，所述聚合物共轭脂质占载体的摩尔比为0.5%

10%。

~

17.根据权利要求16所述的组合物，其中，所述聚合物共轭脂质占载体的摩尔比为

1.5%。

18.根据权利要求15所述的组合物，其中，所述聚合物共轭脂质选自以下中的一种或多种：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油。

19.根据权利要求18所述的组合物，其中，所述聚合物共轭脂质选自以下中的一种或多种：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇2000（DSPE‑PEG2000），二肉豆蔻酰甘油‑3‑甲氧基聚乙二醇2000（DMG‑PEG2000）和甲氧基聚乙二醇双十四烷基乙酰胺（ALC‑0159）。

20.根据权利要求3所述的组合物，其中所述载体包括阳离子脂质、中性脂质、结构脂质以及聚合物共轭脂质。

21.根据权利要求20所述的组合物，其中，所述阳离子脂质：中性脂质：结构脂质：聚合物共轭脂质的摩尔用量比为（25 75）:（5 25）:（15 65）:（0.5 10）。

~ ~ ~ ~

22.根据权利要求21所述的组合物，其中，所述阳离子脂质：中性脂质：结构脂质：聚合物共轭脂质的摩尔用量比为49:10:39.5:1.5。

23.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述组合物为纳米颗粒制剂，所述纳米颗粒制剂的平均粒径为10nm 210nm；所述纳米颗粒制剂的多分散系数（PDI）≤50%。

~

24.根据权利要求23所述的组合物，其中，所述纳米颗粒制剂的平均粒径为100nm~

205nm；所述纳米颗粒制剂的多分散系数（PDI）≤30%。

25.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述阳离子脂质还包括一种或多种其它可电离的脂质化合物。

26.根据权利要求3所述的组合物，其中，还包含治疗剂或预防剂。

27.根据权利要求26所述的组合物，其中，所述载体与所述治疗剂或预防剂的质量比为

10:1 30:1。

~

28.根据权利要求27所述的组合物，其中，所述载体与所述治疗剂或预防剂的质量比为

12.5:1 25:1。

~

29.根据权利要求28所述的组合物，其中，所述载体与所述治疗剂或预防剂的质量比为

15:1。

30.根据权利要求26所述的组合物，其中，所述治疗剂或预防剂包括核酸分子、小分子化合物、多肽或蛋白质中的一种或多种。

31.根据权利要求26所述的组合物，其中，所述治疗剂或预防剂是能够引起免疫响应的疫苗或化合物。

32.根据权利要求26所述的组合物，其中，所述治疗剂或预防剂是核酸。

33.根据权利要求32所述的组合物，其中，所述治疗剂或预防剂是核糖核酸(RNA)。

34.根据权利要求32所述的组合物，其中，所述治疗剂或预防剂是脱氧核糖核酸(DNA)。

35.根据权利要求33所述的组合物，其中，所述RNA选自由以下组成的组：小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、Dicer‑底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、信使RNA(mRNA)以及其混合物。

36.根据权利要求33所述的组合物，其中，所述RNA是mRNA。

37.根据权利要求3‑36中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包括一种或多种可药用的赋形剂。

38.一种如权利要求1‑2中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或者如权利要求3‑37中任一项所述的组合物在制备核酸药物、基因疫苗、小分子药物、多肽或蛋白质药物中的用途。

39.一种如权利要求1‑2中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或者如权利要求3‑37中任一项所述的组合物在制备用于治疗有需要哺乳动物的疾病或病症的药物中的用途，所述疾病或病症选自由以下组成的组：感染性疾病、癌症和增生性疾病、遗传性疾病、自体免疫性疾病、糖尿病、神经退化性疾病、心血管和肾血管疾病以及代谢性疾病。

40.根据权利要求39所述的用途，其中，所述感染性疾病选自：由冠状病毒、流感病毒或HIV病毒引起的疾病，小儿肺炎，裂谷热，黄热病，狂犬病，或疱疹。

41.根据权利要求39‑40中任一项所述的用途，其中，所述药物的施用对象是人。

42.根据权利要求39‑40中任一项所述的用途，其中，所述药物的施用途径为经静脉内、肌肉内、皮内、皮下、鼻内或吸入。

43.根据权利要求42所述的用途，其中，所述药物的施用途径为皮下。

44.根据权利要求39‑40中任一项所述的用途，其中，所述药物的施用剂量为0.001~

10mg/kg。

说明书

一种脾脏中高表达的阳离子脂质化合物、包含其的组合物及

用途

技术领域

[0001] 本发明属于医药领域，具体涉及一种哌嗪基的阳离子脂质化合物、包含其的组合物及用途。

背景技术

[0002] 生物活性物质如小分子药物、多肽、蛋白质和核酸尤其是核酸的有效靶向递送是一个持久的医学难题。核酸治疗剂因低细胞渗透性和对某些核酸分子(包括RNA)降解的高敏感性而面临很大挑战。

[0003] 证实，含阳离子脂质的组合物、脂质体和脂质体复合物(lipoplex)作为运输媒介物，有效地将生物活性物质如小分子药物、多肽、蛋白质和核酸运送至细胞和/或细胞内隔室中。这些组合物一般包含一种或多种“阳离子性”和/或氨基(可离子化)脂质、包括中性脂质、结构性脂质以及聚合物共轭脂质。阳离子性和/或可离子化脂质包括例如可容易地质子化的含胺脂质。尽管已经展示多种此类含脂质的纳米粒子组合物，但安全性、功效和特异性仍有待改良。值得注意的是，脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticle，LNP）复杂性的增加使其生产复杂化，并可能增加其毒性，这是一个可能限制其临床应用的主要担忧。例如，LNP siRNA颗粒(如patisiran)需要预先使用类固醇和抗组胺药来消除不必要的免疫反应（T. Coelho, D. Adams, A. Silva, et al., Safety and efficacy of RNAi therapy for transthyretin amyloidosis, N Engl J Med, 369 (2013) 819‑829.）。因此，需要开发有助于将治疗剂和/或预防剂如核酸递送至细胞的改进的阳离子脂质化合物，及包含其的组合物的需求。

发明内容

[0004] 本发明提供了一种基于哌嗪基的阳离子脂质化合物，包括其药物可接受的盐和其立体异构体或互变异构体。丰富了阳离子脂质化合物的种类，为核酸药物、基因疫苗、小分子药物、多肽或蛋白质药物的有效递送提供更多选择。当与其它脂质成分形成脂质纳米颗粒后，能够有效地递送mRNA或药物分子到细胞内发挥生物功能。

[0005] 本公开一方面提供一种基于哌嗪基的阳离子脂质化合物，其为式(I)化合物，或其N‑氧化物、溶剂合物、药学上可接受的
盐或立体异构体，其中：G1为C1 10亚烷基；G2为C1 10亚烷基；L1为‑C(O)O‑或‑C(O)N(Ra)‑；L2~ ~
为‑C(O)O‑或‑C(O)N(Ra)‑；R1为未取代的C1225支链烷基或未取代的C615直链烷基或Rb‑S‑Rc~ ~
或Rb‑S‑S‑Rc；R2为未取代的C12 25支链烷基或未取代的C6 15直链烷基或Rb‑S‑Rc或Rb‑S‑S‑Rc；
~ ~
Ra为H或未取代的C512直链烷基；Rb为C110亚烷基；Rc为未取代的C116直链烷基。
~ ~ ~

[0006] 例如，式(I)化合物具有以下结构中的一种：

[0007] ，

[0008] ，

[0009] ，

[0010] ，

[0011] ，

[0012] ，

[0013] 。

[0014] 本发明的又一方面提供一种组合物，其包含载体，所述载体包括阳离子脂质，所述阳离子脂质包括上述的式(I)化合物或其N‑氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体。在一种实施方案中，组合物还包含治疗剂或预防剂。

[0015] 本发明的又一方面提供上述阳离子脂质或组合物，其用于向有需要的患者 递送治疗剂或预防剂。

[0016] 本发明的又一方面提供治疗或预防疾病或病症的方法，包括向有需要的患者或受试者给药治疗或预防有效量的上述组合物。

[0017] 本发明的又一方面提供上述的式(I)化合物或其N‑氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体或者上述的组合物在制备核酸药物、基因疫苗、小分子药物、多肽或蛋白质药物中的用途。

[0018] 本发明的又一方面提供上述的式(I)化合物或其N‑氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体或者上述的组合物在制备用于治疗有需要哺乳动物的疾病或病症的药物中的用途。

附图说明

[0019] 为了更清楚地说明本公开实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本公开的一些实施例，而非对本发明的限制。

[0020] 图1显示基于YK‑506制备的eGFP‑mRNA的LNP制剂的细胞转染实验结果，其中：a为293T细胞明场图，b为293T细胞荧光图。

[0021] 图2显示由不同的阳离子脂质制备的Fluc‑mRNA的LNP制剂的荧光吸收强度。

[0022] 图3显示由不同的阳离子脂质制备的Fluc‑mRNA的LNP制剂加入细胞培养液中培养24 h后的细胞存活率。

[0023] 图4显示基于YK‑506、YK‑504和YK‑501阳离子脂质制备的Fluc‑mRNA的LNP制剂的小鼠活体成像实验结果，其中：a为基于YK‑506、YK‑504和YK‑501阳离子脂质制备的Fluc‑mRNA的LNP制剂的活体小鼠，b为基于YK‑506制备的Fluc‑mRNA的LNP制剂安乐死后打开腹腔的小鼠，c为基于YK‑506制备的Fluc‑mRNA的LNP制剂的小鼠脏器（心、肝、脾、肺、肾）荧光图。

具体实施方式

[0024] 为使本公开实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本公开实施例的附图，对本公开实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本公开的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本公开的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

[0025] 本发明可在不偏离本发明基本属性的情况下以其它具体形式来实施。应该理解的是，在不冲突的前提下，本发明的任一和所有实施方案都可与任一其它实施方案或多个其它实施方案中的技术特征进行组合以得到另外的实施方案。本发明包括这样的组合得到的另外的实施方案。

[0026] 本公开中提及的所有出版物和专利在此通过引用以它们的全部内容纳入本公开。如果通过引用纳入的任何出版物和专利中使用的用途或术语与本公开中使用的用途或术
语冲突，那么以本公开的用途和术语为准。

[0027] 本文所用的章节标题仅用于组织文章的目的，而不应被解释为对所述主题的限制。

[0028] 除非另有规定，本文使用的所有技术术语和科学术语具有要求保护主题所属领域的通常含义。倘若对于某术语存在多个定义，则以本文定义为准。

[0029] 除了在工作实施例中或另外指出之外，在说明书和权利要求中陈述的定量性质量如剂量的所有数字应理解为在所有情况中被术语“约”修饰。还应理解的是，本申请列举的任何数字范围意在包括该范围内的所有的子范围和该范围或子范围的各个端点的任何组合。

[0030] 本公开中使用的“包括”、“含有”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的要素涵盖出现在该词后面列举的要素及其等同，而不排除未记载的要素。本文所用的术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…组成”、或“由…组成”。

[0031] 术语“药学上可接受的”在本申请中是指：化合物或组合物在化学上和/或在毒理学上与构成制剂的其它成分和/或与用其预防或治疗疾病或病症的人类或哺乳动物相容。

[0032] 术语“受试者”或“患者”在本申请中包括人类和哺乳动物。

[0033] 本文所用的术语“治疗”是指给患有疾病或者具有所述疾病的症状的患者或受试者施用一种或多种药物物质，用以治愈、缓解、减轻、改善或影响所述疾病或者所述疾病的症状。在本申请的上下文中，除非作出相反的具体说明，术语“治疗”也可包括预防。

[0034] 术语“溶剂合物”在本申请中指的是通过组合式(I)化合物或其药学上可接受的盐和溶剂(例如乙醇或水)而形成的复合物。应理解的是，在治疗疾病或病症中使用的式I化合物的任何溶剂合物尽管可能提供不同的性质(包括药代动力学性质)，但是一旦吸收至受试者中，会得到式I化合物，使得式I化合物的使用分别涵盖式I化合物的任何溶剂合物的使用。

[0035] 术语“水合物”指的是上述术语“溶剂合物”中溶剂为水的情形。

[0036] 应进一步理解，式I化合物或其药学上可接受的盐可以溶剂合物形式分离，并且因此任何所述溶剂合物皆包括于本发明的范围内。例如，式I化合物或其药学上可接受的盐可以未溶剂化形式以及与药学上可接受的溶剂(诸如，水、乙醇等)形成的溶剂化形式存在。

[0037] 术语“药学上可接受的盐”是指本公开化合物的相对无毒、无机酸或有机酸加成盐。例如，参见S. M. Berge等人“Pharmaceutical Salts”，J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1‑19。其中，无机酸例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸或硝酸等；有机酸例如甲酸、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一酸、月桂酸、苯甲酸、水杨酸、2‑(4‑羟基苯甲酰基)‑苯甲酸、樟脑酸、肉桂酸、环戊烷丙酸、二葡萄糖酸、3‑羟基‑2‑萘甲酸、烟酸、巴莫酸、果胶酯酸、3‑苯基丙酸、苦味酸、特戊酸、2‑羟基乙磺酸、衣康酸、胺基磺酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、苯磺酸、对‑甲苯磺酸、甲磺酸、2‑萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、己二酸、海藻酸、马来酸、富马酸、D‑葡萄糖酸、扁桃酸、抗坏血酸、葡庚糖酸、甘油磷酸、天冬胺酸、磺基水杨酸等。例如，可使用HCl（或盐酸）、HBr（或氢溴酸溶液）、甲磺酸、硫酸、酒石酸或富马酸与式I所示的化合物形成药学上可接受的盐。

[0038] 本公开的式(I)的含氮化合物可通过用氧化剂(例如间氯过氧苯甲酸、过氧化氢、臭氧)处理而转化成N‑氧化物。因此，在价态和结构允许的条件下，本申请要求保护的化合物不但包括结构式所示的含氮化合物，而且还包括其N‑氧化物衍生物。

[0039] 本公开的某些化合物可以以一种或多种立体异构体的形式存在。立体异构体包括几何异构体、非对映异构体和对映异构体。因此，本公开要求保护的化合物还包括外消旋混合物、单一的立体异构体和具有光学活性的混合物。本领域技术人员应该理解的是，一种立体异构体可能比其它立体异构体具有更好的功效和/或更低的副作用。单一的立体异构体和具有光学活性的混合物可手性源合成法、手性催化、手性拆分等方法得到。消旋体可通过色谱拆分法或者化学拆分法进行手性拆分。例如，可通过加入手性酒石酸、手性苹果酸等手性酸类拆分试剂与本公开的化合物成盐，利用产物的物理化学性质例如溶解度不同进行分离。

[0040] 本发明还包括本公开化合物所有适合的同位素变体。同位素变体定义为这样的化合物，其中至少一个原子被具有相同原子序数但其原子质量不同于自然界中常见的或主要存在的原子质量的原子替代。可以引入到本公开化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮和2 3 11 13 14 15 17 18
氧的同位素，分别例如H(氘)、H(氚)、C、C、C、N、O和 O。

[0041] 术语“烷基”在本公开中是指包括具有规定碳原子数的支链和直链饱和脂族一价烃基。术语“亚烷基”在本公开中是指包括具有规定碳原子数的支链和直链饱和脂族二价烃基。Cnm是指包括具有n至m个碳原子数的基团。例如C25亚烷基包括C2亚烷基、C3亚烷基、C4亚~ ~烷基、C5亚烷基。

[0042] 烷基(或亚烷基)可未经取代，或烷基(或亚烷基)可经取代，其中至少一个氢被另一种化学基团代替。

[0043] “治疗有效量”为当给予患者时能改善疾病或症状的治疗剂的量。“预防有效量”为当给予受试者时能预防疾病或症状的预防剂的量。构成“治疗有效量”的治疗剂的量或“预防有效量”的预防剂的量随着治疗剂/预防剂、疾病状态及其严重性、待治疗/预防的患者/受试者的年龄、体重等而变化。本领域普通技术人员可根据其知识以及本公开常规地确定治疗有效量和预防有效量。

[0044] 在本申请中，当化合物的名称与结构式不一致时，以结构式为准。

[0045] 应理解，本申请所用的术语“本公开化合物”根据语境可包括：式(I)化合物，其N‑氧化物、其溶剂合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体，以及它们的混合物。

[0046] 本文所用术语阳离子脂质是指在选定的pH值带正电荷的脂质。

[0047] 阳离子脂质体易于与带负电荷的核酸结合，即通过静电力与核酸中存在的带负电的磷酸基团相互作用，形成脂质纳米颗粒(LNP)。LNP是目前主流的递送载体之一。

[0048] 筛选合适的阳离子脂质化合物，能同时具有高的转染效率和对细胞的低毒性，在小鼠脾脏高表达是非常困难的事情。本公开通过独特的设计，发现了一些化合物，例如YK‑506和YK‑504，相对于现有技术中结构类似的阳离子脂质，例如MC3、C12‑200、MIC3和PPZ‑A12，能够以显著提高的细胞转染效率、显著降低的细胞毒性及在动物脾脏显著提高的表达程度来递送核酸，从而实现mRNA疫苗体内快速诱导免疫应答、产生抗体。在不改变疫苗组分的情况下显著提升预防效果，具有重要的临床意义。对于开发治疗例如淋巴瘤、白血病等脾脏受损或异常所引起的疾病有很好的靶向效果。

[0049] 简单来说，本发明至少基于以下发现：

[0050] 本公开的阳离子脂质化合物可用于递送核酸分子、小分子化合物、多肽或蛋白质。相对于已知的阳离子脂质化合物，本公开的阳离子脂质化合物表现出较高的转染效率和较小的细胞毒性，在动物脾脏表达量显著提高，提高了递送效率，具有重要的临床意义。

[0051] 1．设计的一系列阳离子脂质化合物，其中包括YK‑506和YK‑504，与现有技术代表性阳离子脂质相比，有的化学结构有巨大差异，例如MC3（Dlin‑MC3‑DMA）；有的结构类似，例如C12‑200、MIC3和PPZ‑A12。

[0052] MC3是阿里拉姆制药公司（Alnylam Pharmaceuticals，Inc.）在CN102625696B（说明书第6页）中公开的阳离子脂质化合物。

[0053] C12‑200是麻省理工学院（MIT）在WO2010/053572A2（说明书第157页）中公开。

[0054] MIC3是四川大学宋相荣等报道的阳离子脂质（Kepan Chen, Xiangrong Song, et al.,  mRNA Vaccines Against SARS‑CoV‑2 Variants Delivered  by Lipid Nanoparticles Based on Novel Ionizable Lipids, Adv Funct Mat, 2022,2204692正
文第3页）。

[0055] PPZ‑A12是由美国佐治亚理工学院James Dahlman等报道的阳离子脂质（Huanzhen Ni, James E. Dahlman, et al., Piperazine‑derived lipid nanoparticles deliver mRNA to immune cells in vivo, Nat. Commun.2022, 13：4766正文第3页）。

[0056] 因此，无法根据上述现有技术公开的阳离子脂质化合物，推测出由本申请设计的此系列化合物制备的LNP制剂的细胞转染效率、细胞毒性，以及在动物脾脏的表达情况。

[0057] 本申请设计的一系列阳离子脂质化合物和其它现有技术代表性阳离子脂质化学结构如下：

[0058] 表1 本申请设计和现有技术代表性阳离子脂质

[0059]

[0060] 2．在设计的此系列化合物中，由YK‑506和YK‑504制备的LNP制剂，与现有技术中代表性和结构类似的阳离子脂质相比，细胞转染效率显著提高、细胞毒性显著降低、mRNA在小鼠肝和脾中表达量显著提高。例如，细胞转染效率YK‑506可达MC3的4.83倍、C12‑200的2.94倍、MIC3的4.00倍和PPZ‑A12的3.73倍；细胞存活率YK‑506可比MC3高25%、比C12‑200高18%、比MIC3高33%、比PPZ‑A12高41%；mRNA在小鼠脾脏中表达量，YK‑506是C12‑200的5.94倍，而MC3在脾脏中不表达。

[0061] 3．在本申请设计的化学结构差异很小的一系列化合物中，由YK‑506和YK‑504制备的LNP制剂，同其它化合物相比，细胞转染效率显著提高、细胞毒性显著降低，mRNA在小鼠脾脏的表达量显著提高。例如，YK‑506细胞转染效率可达YK‑501的100倍和YK‑503的130倍，细胞毒性可比YK‑505降低52%，mRNA在小鼠脾脏的表达量可达YK‑501的200倍以上。

[0062] 4．本公开通过独特的设计和筛选，发现了一些化合物，例如YK‑506和YK‑504，相对于现有技术结构类似的其它化合物，能够以显著提高的细胞转染效率、显著降低的细胞毒性和在动物体内脾脏中显著提高的表达量，提高了递送效率，取得了预料不到的技术效果。通过提高在物体内脾脏（体内最大的二级淋巴器官）表达量，能够实现mRNA疫苗体内快速诱导免疫应答、产生抗体。在不改变疫苗组分的情况下显著提升预防效果，具有重要的临床意义。对于开发治疗例如淋巴瘤、白血病等脾脏受损或异常所引起的疾病有很好的靶向效果。

[0063] 总之，本公开通过独特的设计和筛选，发现了一些化合物，例如YK‑506和YK‑504。这些化合物相对于现有技术代表性以及结构类似的阳离子脂质，细胞转染效率显著提高、细胞毒性显著降低，并且在动物脾脏表达量显著提高，提高了递送效率。

[0064] 具体如下：

[0065] 1．本申请设计的化合物，化学结构与现有技术代表性阳离子脂质相比，有的差异巨大，例如MC3；有的结构类似，例如C12‑200、MIC3和PPZ‑A12。

[0066] 1）与现有技术代表性阳离子脂质MC3相比，本申请设计的化合物化学结构完全不同，差异巨大。MC3无哌嗪基，而本申请设计的化合物均有哌嗪基；MC3只有1个支链结构疏水尾，而本申请设计的化合物有2个疏水尾；MC3的尾部结构中含有双键，而本申请设计的化合物尾部结构无双键，并且其它基团也均有较大差异。

[0067] 2）与现有技术包含哌嗪基的阳离子脂质，例如C12‑200、MIC3和PPZ‑A12相比，本申请设计的化合物化学结构类似，仅个别基团稍有差别。

[0068] 2．体外细胞转染效率比现有技术中代表性阳离子脂质和结构类似的化合物显著提高。

[0069] 1）由YK‑506和YK‑504制备的LNP制剂细胞转染效率最高，相比于现有技术中代表性和结构类似的阳离子脂质活性显著提高。例如，YK‑506细胞转染效率，可达MC3的4.83倍、C12‑200的2.94倍、MIC3的4.00倍和PPZ‑A12的3.73倍。

[0070] 2）与结构类似、L1和L2基团均为‑C(O)O‑的化合物相比，YK‑506和YK‑504的细胞转染效率最高。例如，YK‑506的细胞转染效率，可达YK‑501的100倍、YK‑502和YK‑505的40倍。

[0071] 3）与结构类似、L1基团为‑C(O)O‑、L2基团为‑C(O)N((CH2)9CH3)‑的化合物相比，YK‑506和YK‑504细胞转染效率显著提高。例如，YK‑506细胞转染效率可达YK‑503的130倍。

[0072] 4）与结构类似、L1和L2基团均为‑C(O)NH‑、R1和R2均含‑S‑S‑基团的化合物相比，YK‑506和YK‑504细胞转染效率显著提高。例如，YK‑506细胞转染效率可达YK‑507的100倍。

[0073] 3．细胞毒性比现有技术中代表性阳离子脂质和结构类似的化合物显著降低。

[0074] 1）由YK‑504、YK‑506制备的LNP制剂细胞毒性最低，与现有技术中代表性阳离子脂质相比，细胞存活率显著提高。例如，YK‑506的细胞存活率，可比MC3高25%、比C12‑200高18%、比MIC3高33%、比PPZ‑A12高41%。

[0075] 2）与结构类似、L1和L2基团均为‑C(O)O‑的化合物相比，YK‑506和YK‑504细胞毒性最低，细胞存活率显著提高。例如，YK‑506的细胞存活率可比YK‑501高35%、比YK‑502高39%、比YK‑505高52%。

[0076] 3）与结构类似、L1基团为‑C(O)O‑、L2基团为‑C(O)N((CH2)9CH3)‑的化合物相比，YK‑506和YK‑504细胞毒性最低，细胞存活率显著提高。例如，YK‑506和YK‑504的细胞存活率分别比YK‑503高44%和28%。

[0077] 4）与结构类似、L1和L2基团均为‑C(O)NH‑、R1和R2均含‑S‑S‑基团的化合物相比，YK‑506和YK504细胞毒性最低，细胞存活率显著提高。例如，YK‑506和YK‑504的细胞存活率分别比YK‑507高40%和24%。

[0078] 4．mRNA在动物脾脏表达量比现有技术中代表性阳离子脂质和结构类似的化合物显著提高。

[0079] 1）由YK‑506和YK‑504制备的LNP制剂，相比于现有技术中代表性阳离子脂质，mRNA在小鼠脾脏表达量显著提高。例如，MC3在脾脏不表达，而YK‑506和YK‑504均大量表达，YK‑506在脾脏表达量可达C12‑200的5.94倍。

[0080] 2）与结构类似、个别基团稍有区别的化合物相比，由YK‑506和YK‑504制备的LNP制剂，mRNA在小鼠脾脏的表达强度最高。例如，YK‑506在脾脏表达量可达YK‑501的200倍以上。

[0081] 通过提高在动物体内脾脏（体内最大的二级淋巴器官）表达量，能够实现mRNA疫苗体内快速诱导免疫应答、产生抗体。在不改变疫苗组分的情况下显著提升预防效果，具有重要的临床意义。对于开发治疗例如淋巴瘤、白血病等脾脏受损或异常所引起的疾病有很好的靶向效果。

[0082] 本公开一方面提供一种新的用于递送治疗剂或预防剂的阳离子脂质化合物。本公开的阳离子脂质化合物可用于递送核酸分子、小分子化合物、多肽或蛋白质。相对于已知的阳离子脂质化合物，本公开的阳离子脂质化合物表现出较高的转染效率、较低的细胞毒性和在动物脾脏的高表达，提高了递送效率和安全性。

[0083] 本公开提供一种阳离子脂质，其为式(I)化合物

[0084] ，或其N‑氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中

[0085] G1为C110亚烷基；~

[0086] G2为C110亚烷基；~

[0087] L1为‑C(O)O‑或‑C(O)N(Ra)‑；

[0088] L2为‑C(O)O‑或‑C(O)N(Ra)‑；

[0089] R1为未取代的C1225支链烷基或未取代的C615直链烷基或Rb‑S‑Rc或Rb‑S‑S‑Rc；~ ~

[0090] R2为未取代的C1225支链烷基或未取代的C615直链烷基或Rb‑S‑Rc或Rb‑S‑S‑Rc；~ ~

[0091] Ra为H或未取代的C512直链烷基；~

[0092] Rb为C110亚烷基；~

[0093] Rc为未取代的C116直链烷基。~

[0094] 在一种实施方案中，G1为未取代的C5亚烷基或C2亚烷基或C7亚烷基或C3亚烷基。例如，G1为未取代的C5亚烷基。又例如，G1为未取代的C7亚烷基。

[0095] 在一种实施方案中，G2为未取代的C5亚烷基或C2亚烷基或C7亚烷基或C3亚烷基。例如，G2为未取代的C2亚烷基。又例如，G2为未取代的C3亚烷基。

[0096] 在一种实施方案中，G1为未取代的C5亚烷基，G2为未取代的C2亚烷基。在另一种实施方案中，G1为未取代的C7亚烷基，G2为未取代的C3亚烷基。

[0097] 在一种实施方案中，L1为‑C(O)O‑、‑C(O)NH‑或‑C(O)N((CH2)9CH3)‑。例如，L1为‑C(O)O‑。

[0098] 在一种实施方案中，L2为‑C(O)O‑、‑C(O)NH‑或‑C(O)N((CH2)9CH3)‑。例如，L2为‑C(O)NH‑。

[0099] 在一种实施方案中，R1为未取代的C15支链烷基或未取代的C18支链烷基。例如，R1为： 或 。在另一种实施方案中，R1为‑(CH2)2‑S‑S‑(CH2)11CH3、‑(CH2)2‑S‑(CH2)3CH3、‑(CH2)3‑S‑S‑(CH2)4CH3或‑(CH2)9CH3。

[0100] 在一种实施方案中，R2为未取代的C15支链烷基或未取代的C18支链烷基。例如，R2为： 或 。在另一种实施方案中，R2为‑(CH2)2‑S‑S‑(CH2)11CH3、‑(CH2)2‑S‑(CH2)3CH3、‑(CH2)3‑S‑S‑(CH2)
4CH3或‑(CH2)9CH3。

[0101] 例如，所述式(I)化合物具有以下结构中的一种：

[0102] ，

[0103] ，

[0104] ，

[0105] ，

[0106] ，

[0107] ，

[0108] 。

[0109] 在一种优选的实施方案中，所述式(I)化合物是

[0110]或 。

[0111] 在一种更优选的实施方案中，所述式(I)化合物是。

[0112] 本公开的又一方面提供一种组合物，其包含载体，所述载体包括阳离子脂质，所述阳离子脂质包括上述的式(I)化合物或其N‑氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体。

[0113] 在一些实施方案中，所述组合物为纳米颗粒制剂，所述纳米颗粒制剂的平均尺寸为100nm 210nm，优选为140nm 205nm；所述纳米颗粒制剂的多分散系数≤50%，优选≤30%，~ ~更优选≤25%。

[0114] 阳离子脂质

[0115] 在本公开的组合物/载体的一种实施方式中，所述阳离子脂质为选自上述的式(I)化合物或其N‑氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体中的一种或多种。在一些实施方案中，所述阳离子脂质为选自上述的式(I)化合物。例如，阳离子脂质为化合物YK‑501、YK‑502、YK‑503、YK‑504、YK‑505、YK‑506或YK‑507。在一些优选的实施方案中，所述阳离子脂质为化合物YK‑506。在另一些优选的实施方案中，所述阳离子脂质为化合物YK‑504。

[0116] 在一些实施方案中，所述阳离子脂质占载体的摩尔比为25% 75%，例如35%、45%、~49%、50%、51%、55%、60%、65%。

[0117] 该载体可用于递送活性成分例如治疗剂或预防剂。活性成分可包封在载体内或者与载体结合。

[0118] 例如，所述治疗剂或预防剂包括核酸分子、小分子化合物、多肽或蛋白质中的一种或多种。所述核酸包括但不限于单链DNA、双链DNA和RNA。适宜的RNA包括但不限于小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、Dicer‑底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、信使RNA(mRNA)以及其混合物。

[0119] 中性脂质

[0120] 载体可包含中性脂质。中性脂质在本公开中是指在选定的pH值不带电荷或者以两性离子形式存在的起辅助作用的脂质。中性脂质可能通过促进脂质相变来调节纳米颗粒流动性成脂质双层结构并提高效率，同时还可能影响靶器官的特异性。

[0121] 在一些实施方案中，所述阳离子脂质与所述中性脂质的摩尔比为1:1 15:1，例如~14:1、13:1、12:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5.1:1、5:1、4.9:1、4:1、3:1、2:1。在一些优选的实施方案中，所述阳离子脂质与所述中性脂质的摩尔比为4.9:1。

[0122] 例如，中性脂质可包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、神经酰胺、甾醇及其衍生物中的一种或多种。

[0123] 包含阳离子脂质的组合物的载体组分可以包括一种或多种中性脂质‑磷脂，如一种或多种(多)不饱和脂质。磷脂可以组装成一个或多个脂质双层。一般来说，磷脂可以包括磷脂部分和一个或多个脂肪酸部分。

[0124] 中性脂质部分可以选自由以下组成的非限制性组：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2‑溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂。脂肪酸部分可以选自由以下组成的非限制性组：月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻烯酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α‑亚麻酸、芥酸、植烷酸、花生酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、山萮酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。还涵盖包括带有修饰和取代的天然物种的非天然物种，所述修饰和取代包括分支、氧化、环化和炔烃。例如，磷脂可以用一种或多种炔烃(例如一个或多个双键被三键置换的烯基)官能化或与该一种或多种炔烃交联。在适当反应条件下，炔基在暴露于叠氮化物时可能经历铜催化的环加成反应。这些反应可用于使组合物的脂质双层官能化以促进膜渗透或细胞识别，或将组合物与有用组分如靶向或成像部分(例如染料)偶联。

[0125] 可用于这些组合物中的中性脂质可以选自由以下组成的非限制性组：1,2‑二亚油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(DLPC)、1,2‑二肉豆蔻酰基‑sn‑甘油‑磷酸胆碱(DMPC)、1,2‑二油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(DOPC)、1,2‑二棕榈酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(DPPC)、1,2‑二硬脂酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(DSPC)、1,2‑双十一烷酰基‑sn‑甘油‑磷酸胆碱(DUPC)、1‑棕榈酰基‑2‑油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(POPC)、1,2‑二‑O‑十八碳烯基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(18:0 Diether PC)、1‑油酰基‑2‑胆固醇基半琥珀酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(OChemsPC)、1‑十六烷基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2‑二亚麻酰基‑sn‑甘油‑
3‑磷酸胆碱、1,2‑二花生四烯酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱、1,2‑双二十二碳六烯酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸胆碱、1,2‑二油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2‑二植烷酰基‑sn‑甘油‑
3‑磷酸乙醇胺(ME 16.0 PE)、1,2‑二硬脂酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺、1,2‑二亚油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺、1,2‑二亚麻酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺、1,2‑二花生四烯酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺、1,2‑双二十二碳六烯酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺、1,2‑二油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸‑rac‑(1‑甘油)钠盐(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基‑磷脂酰‑乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、1‑硬脂酰基‑2‑油酰基‑硬脂酰乙醇胺(SOPE)、
1‑硬脂酰基‑2‑油酰基‑磷脂酰胆碱(SOPC)、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)以及其混合物。

[0126] 在一些实施方案中，中性脂质包括DSPC。在某些实施方案中，中性脂质包括DOPE。在一些实施方案中，中性脂质包括DSPC和DOPE两种。

[0127] 结构性脂质

[0128] 包含阳离子脂质的组合物的载体还可以包括一种或多种结构性脂质。结构性脂质在本公开中是指通过填充脂质之间的间隙来增强纳米颗粒的稳定性的脂质。

[0129] 在一些实施方案中，所述阳离子脂质与所述结构性脂质的摩尔比为约0.6:1 3:1，~例如，约1.0:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2.0:1。在一些优选实施方案中，所述阳离子脂质与所述结构性脂质的摩尔比为49:39.5。

[0130] 结构性脂质可以选自但不限于由以下组成的组：胆固醇、非甾醇、谷固醇、麦角固醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、番茄碱、熊果酸、α‑生育酚、皮质类固醇以及其混合物。在一些实施方案中，结构性脂质是胆固醇。在一些实施方案中，结构性脂质包括胆固醇和皮质类固醇(如泼尼松龙(prednisolone)、地塞米松、泼尼松(prednisone)和氢化可的松(hydrocortisone))或其组合。

[0131] 聚合物共轭脂质

[0132] 包含阳离子脂质的组合物的载体还可以包括一种或多种聚合物共轭脂质。聚合物共轭脂质主要是指聚乙二醇(PEG)修饰的脂质。亲水性PEG稳定LNP，通过限制脂质融合来调节纳米颗粒大小，并通过减少与巨噬细胞的非特异性相互作用来增加纳米颗粒的半衰期。

[0133] 在一些实施方案中，所述聚合物共轭脂质选自以下中的一种或多种：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油。PEG修饰的PEG分子量通常为350 5000Da。~

[0134] 例如，所述聚合物共轭脂质选自以下中的一种或多种：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇2000（DSPE‑PEG2000），二肉豆蔻酰甘油‑3‑甲氧基聚乙二醇2000（DMG‑PEG2000）和甲氧基聚乙二醇双十四烷基乙酰胺（ALC‑0159）。

[0135] 在本公开的组合物/载体的一种实施方案中，所述聚合物共轭脂质是DMG‑PEG2000。

[0136] 在本公开的组合物/载体的一种实施方案中，载体包括中性脂质、结构性脂质以及聚合物共轭脂质，所述阳离子脂质、所述中性脂质、所述结构性脂质、以及所述聚合物共轭脂质的摩尔比为（25 75）:（5 25）:（15 65）:（0.5 10），例如（35 49）:（4.5 15）:（35 55）:（1~ ~ ~ ~ ~ ~ ~5）。
~

[0137] 在本公开的组合物/载体的一种实施方案中，载体包括中性脂质、结构性脂质以及聚合物共轭脂质，所述阳离子脂质、所述中性脂质、所述结构性脂质、以及所述聚合物共轭脂质的摩尔比为49:10:39.5:1.5。

[0138] 治疗剂和/或预防剂

[0139] 组合物可以包括一种或多种治疗剂和/或预防剂。在一些实施方案中，载体与所述治疗剂或预防剂的质量比为10:1 30:1，例如12.5:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、~21:1、22:1、23:1、24:1、25:1。

[0140] 在一些实施方案中，载体与所述治疗剂或预防剂的质量比为12.5:1 25:1，优选为~15:1。

[0141] 所述治疗剂或预防剂包括但不限于核酸分子、小分子化合物、多肽或蛋白质中的一种或多种。

[0142] 例如，所述治疗剂或预防剂是能够引起免疫响应的疫苗或化合物。

[0143] 本公开的载体可将治疗剂和/或预防剂递送至哺乳动物细胞或器官，因此本公开还提供治疗有需要哺乳动物的疾病或病症的方法，这些方法包括向哺乳动物施用包括治疗剂和/或预防剂的组合物和/或使哺乳动物细胞与该组合物接触。

[0144] 治疗剂和/或预防剂包括生物活性物质并且替代地称为“活性剂”。治疗剂和/或预防剂可以是在递送至细胞或器官后在该细胞或器官中或者其它身体组织或系统中引起所希望的变化的物质。此类物种可用于治疗一种或多种疾病、病症或病况。在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是可用于治疗特定疾病、病症或病况的小分子药物。可用于组合物的药物的实例包括但不限于抗赘生剂(例如长春新碱(vincristine)、多柔比星
(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、喜树碱(camptothecin)、顺铂(cisplatin)、博莱霉素(bleomycin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、甲氨蝶呤和链脲佐菌素
(streptozotocin))、抗肿瘤剂(例如放线菌素D(actinomycin D)、长春新碱、长春碱
(vinblastine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、蒽环霉素(anthracycline)、烷化剂、铂类化合物、抗代谢物以及核苷类似物，如甲氨蝶呤以及嘌呤和嘧啶类似物)、抗感染剂、局部麻醉剂(例如地布卡因(dibucaine)和氯丙嗪(chlorpromazine))、β‑肾上腺素能阻断剂(例如普萘洛尔(propranolol)、第莫洛(timolol)和拉贝洛尔(labetalol))、抗高血压剂(例如可乐定(clonidine)和肼酞嗪(hydralazine))、抗抑郁剂(例如丙咪嗪
(imipramine)、阿米替林(amitriptyline)和多虑平(doxepin))、抗痉挛剂(例如苯妥英
(phenytoin))、抗组胺(例如苯海拉明(diphenhydramine)、氯苯那敏(chlorpheniramine)和异丙嗪(promethazine))、抗生素/抗细菌剂(例如庆大霉素(gentamycin)、环丙沙星
(ciprofloxacin)和头孢西丁(cefoxitin))、抗真菌剂(例如咪康唑(miconazole)、特康唑(terconazole)、益康唑(econazole)、异康唑(isoconazole)、布康唑(butaconazole)、克霉唑(clotrimazole)、伊曲康唑(itraconazole)、制霉菌素(nystatin)、奈替芬(naftifine)和两性霉素B(amphotericin B))、抗寄生虫剂、激素、激素拮抗剂、免疫调节剂、神经递质拮抗剂、抗青光眼药、维生素、镇静剂以及成像剂。

[0145] 在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是细胞毒素、放射性离子、化学治疗剂、疫苗、引起免疫响应的化合物和/或另一治疗剂和/或预防剂。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何试剂。实例包括但不限于紫杉酚(taxol)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱(colchicine)、多柔比星、柔红霉素(daunorubicin)、二羟基蒽二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光辉霉素(mithramycin)、放线菌素D、1‑去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔、嘌呤霉素、类美登素(maytansinoid)如美登醇(maytansinol)、拉奇霉素(rachelmycin)(CC‑1065)，以及其类似物或同系物。放射性离子包括但不限于碘(例如碘125或碘131)、锶89、磷、钯、铯、铱、磷酸根、钴、钇90、钐153和镨。疫苗包括能够提供针对与感染性疾病如流感、麻疹、人乳头瘤病毒(HPV)、狂犬病、脑膜炎、百日咳、破伤风、瘟疫、肝炎和肺结核相关的一种或多种病况的免疫性的化合物和制剂并且可以包括编码感染性疾病源性抗原和/或表位的mRNA。疫苗还可以包括引导针对癌细胞的免疫响应的化合物和制剂并且可以包括编码肿瘤细胞源性抗原、表位和/或新表位的mRNA。引起免疫响应的化合物可以包括疫苗、皮质类固醇(例如地塞米松)和其它物种。在一些实施方案中，通过包括根据式(I)、(IA)、(IB)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)或(III)的化合物(例如化合物3、18、20、25、26、29、30、60、108‑112或122)的组合物肌肉内施用能够引起免疫响应的疫苗和/或化合物。其它治疗剂和/或预防剂包括但不限于抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6‑巯基嘌呤、6‑硫鸟嘌呤、阿糖胞苷和5‑氟尿嘧啶达卡巴嗪(dacarbazine))、烷化剂(例如氮芥(mechlorethamine)、噻替哌(thiotepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、拉奇霉素(CC‑1065)、美法兰(melphalan)、卡莫司汀(carmustine，BSNU)、罗莫司丁(lomustine，CCNU)、环磷酰胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二氯二胺络铂(II)(DDP)、顺铂)、蒽环霉素(例如柔红霉素(以前称为道诺霉素(daunomycin))和多柔比星)、抗生素(例如更生霉素
(dactinomycin)(以前称为放线菌素)、博莱霉素、光辉霉素(mithramycin)和安曲霉素
(anthramycin，AMC))以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱、长春碱、紫杉酚和类美登素)。

[0146] 在其它实施方案中，治疗剂和/或预防剂是蛋白质。可用于本公开中的纳米粒子中的治疗性蛋白质包括但不限于庆大霉素、阿米卡星(amikacin)、胰岛素、促红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(G‑CSF)、粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子(GM‑CSF)、因子VIR、黄体激素释放激素(LHRH)类似物、干扰素、肝素、乙型肝炎表面抗原、伤寒疫苗和霍乱疫苗。

[0147] 在一些实施方案中，治疗剂是多核苷酸或核酸(例如核糖核酸或脱氧核糖核酸)。术语“多核苷酸”的最广泛含义包括呈寡核苷酸链或可以并入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。根据本公开使用的示例性多核苷酸包括但不限于以下一种或多种：脱氧核糖核酸(DNA)；核糖核酸(RNA)，包括信使mRNA(mRNA)、其杂交体；RNAi诱导因子；RNAi因子；
siRNA；shRNA；miRNA；反义RNA；核糖酶；催化性DNA；诱导三股螺旋形成的RNA；适体等。在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是RNA。可用于本文所描述的组合物和方法中的RNA可以选自由但不限于以下组成的组：shortmer、antagomir、反义RNA、核糖酶、小干扰RNA
(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、Dicer‑底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、转运RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)及其混合物。在某些实施方案中，RNA是mRNA。

[0148] 在某些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是mRNA。mRNA可以编码任何所关注多肽，包括任何天然或非天然存在或以其它方式修饰的多肽。由mRNA编码的多肽可以具有任何大小并且可以具有任何二级结构或活性。在一些实施方案中，由mRNA编码的多肽当在细胞中表达时可以具有治疗作用。

[0149] 在其它实施方案中，治疗剂和/或预防剂是siRNA。siRNA能够选择性降低所关注基因的表达或下调该基因的表达。例如，siRNA的选择可以使得在将包括该siRNA的组合物施用给有需要受试者后使与特定疾病、病症或病况有关的基因沉默。siRNA可以包含与编码所关注基因或蛋白质的mRNA序列互补的序列。在一些实施方案中，siRNA可以是免疫调节性siRNA。

[0150] 在某些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是sgRNA和/或cas9 mRNA。sgRNA和/或cas9 mRNA可以用作基因编辑工具。例如，sgRNA‑cas9复合物可以影响细胞基因的mRNA翻译。

[0151] 在一些实施方案中，治疗剂和/或预防剂是shRNA或者其编码载体或质粒。shRNA可以在将适当构建体递送至核中后在目标细胞内部产生。与shRNA相关的构建体和机制是相关领域中众所周知的。

[0152] 疾病或病症

[0153] 本公开的组合物/载体可以向受试者或患者递送治疗剂或预防剂。所述治疗剂或预防剂包括但不限于核酸分子、小分子化合物、多肽或蛋白质中的一种或多种。因此，本公开的组合物可用于制备核酸药物、基因疫苗、小分子药物、多肽或蛋白质药物。由于上述治疗剂或预防剂的种类广泛，本公开的组合物可用于治疗或预防多种疾病或病症。

[0154] 在一些实施方案中，所述疾病或病症以功能失常或异常的蛋白质或多肽活性为特征。

[0155] 例如，所述疾病或病症选自由以下组成的组：感染性疾病、癌症和增生性疾病、遗传性疾病、自体免疫性疾病、糖尿病、神经退化性疾病、心血管和肾血管疾病以及代谢性疾病。

[0156] 在一些实施方案中，所述感染性疾病选自由冠状病毒，流感病毒，或HIV病毒引起的疾病、小儿肺炎，裂谷热，黄热病，狂犬病，多种疱疹。

[0157] 其它组分

[0158] 组合物可以包括一种或多种除前述部分中所描述的那些外的组分。例如，组合物可以包括一个或多个疏水性小分子，如维生素(例如维生素A或维生素E)或固醇。

[0159] 组合物还可以包括一个或多个渗透性增强分子、碳水化合物、聚合物、表面改变剂或其它组分。渗透性增强分子可以是例如美国专利申请公布第2005/0222064号所描述的分子。碳水化合物可以包括简单糖(例如葡萄糖)和多糖(例如糖原以及其衍生物和类似物)。

[0160] 表面改变剂可以包括但不限于阴离子性蛋白质(例如牛血清白蛋白)、表面活性剂(例如阳离子性表面活性剂，如二甲基双十八烷基溴化铵)、糖或糖衍生物(例如环糊精)、核酸、聚合物(例如肝素、聚乙二醇和泊洛沙姆)、粘液溶解剂(例如乙酰半胱氨酸、艾蒿、菠萝蛋白酶(bromelain)、木瓜蛋白酶、大青(clerodendrum)、溴己新(bromhexine)、羧甲司坦(carbocisteine)、依普拉酮(eprazinone)、美司钠(mesna)、氨溴索(ambroxol)、索布瑞醇(sobrerol)、多米奥醇(domiodol)、来托司坦(letosteine)、司替罗宁(stepronin)、硫普罗宁(tiopronin)、凝溶胶蛋白(gelsolin)、胸腺肽(thymosin)β4、链球菌DNA酶α(dornase alfa)、奈替克新(neltenexine)和厄多司坦(erdosteine))和DNA酶(例如rhDNA酶)。表面改变剂可以被安置在组合物的纳米粒子内和/或表面上(例如通过涂布、吸附、共价连接或其它方法)。

[0161] 组合物还可以包含一种或多种官能化脂质。例如，脂质可以用炔基官能化，该炔基当在适当反应条件下暴露于叠氮化物时可能经历环加成反应。确切地说，脂质双层可以通过这一方式，用一个或多个可有效地促进膜渗透、细胞识别或成像的基团官能化。组合物的表面还可以与一种或多种有用抗体偶联。可用于靶向细胞递送、成像和膜渗透的官能团和偶联物是本领域中众所周知的。

[0162] 除这些组分外，组合物可以包括可用于药物组合物中的任何物质。例如，组合物可以包括一种或多种药学上可接受的赋形剂，赋形剂但不限于一种或多种溶剂、分散介质、稀释剂、分散助剂、悬浮助剂、造粒助剂、崩解剂、填充剂、助流剂、液体媒剂、粘合剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、缓冲剂、润滑剂、油、防腐剂、调味剂、着色剂等。赋形剂例如淀粉、乳糖或糊精。药学上可接受的赋形剂是本领域中众所周知的(参见例如Remington’s The Science and Practice of Pharmacy, 第21版, A.R.Gennaro；Lippincott, Williams&Wilkins, Baltimore, MD, 2006)。

[0163] 稀释剂的实例可以包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、粉末状糖和/或其组合。

[0164] 在一些实施方案中，包括一种或多种本文所述的脂质的组合物还可以包括一种或多种佐剂，例如吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)、CpG寡聚脱氧核糖核苷酸(例如A类或B类)、多聚(I:C)、氢氧化铝和Pam3CSK4。

[0165] 本公开的组合物可以制成固体、半固体、液体或气体的形式的制剂，例如片剂、胶囊剂、软膏剂、酏剂、糖浆、溶液、乳液、悬浮液、注射剂、气溶胶。本公开的组合物可以通过制药领域熟知的方法来制备。例如，无菌注射溶液可通过将所需量的治疗剂或预防剂与所需的上述各种其它成分掺入适当的溶剂例如无菌蒸馏水中，然后过滤灭菌来制备。还可以加入表面活性剂以促进形成均匀的溶液或悬浮液。

[0166] 例如，本公开的组合物的施用方式为经静脉内、肌肉内、皮内、皮下、鼻内或通过吸入。在一些实施方案中，所述组合物的施用方式为皮下。

[0167] 本公开的组合物以治疗有效量给药，所述量不仅可以随所选择的特定试剂而变化，还可以随给药途径，所治疗疾病的性质以及患者的年龄和状况而变化，并且最终可以由主治医师或临床医生自行决定。例如，可将0.001 10mg/kg剂量的所述治疗剂或预防剂施用~
给哺乳动物(例如人)。

[0168] 实施例

[0169] 下面结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明并不限于以下实施例。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0170] 实施例1：阳离子脂质化合物的合成

[0171] 1. 6‑(4‑(4‑(癸氧基)‑4‑氧代丁基)哌嗪‑1‑基)己酸2‑辛基癸酯（YK‑501）的合成[0172] 合成路线如下：

[0173]

[0174] 步骤一：4‑溴丁酸正癸酯（YK‑501‑PM1）的合成

[0175] 将正癸醇（5.00 g，31.59 mmol）和4‑溴丁酸（6.33 g，37.91 mmol）溶于二氯甲烷（40 mL）中，向上述溶液中加入1‑（3‑二甲氨基丙基）‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐（9.08 g，47.39 mmol）及4‑二甲基氨基吡啶（1.93 g，15.80 mmol），于30 35 ℃下搅拌反应24 h。反~
应完毕后将反应液依次用饱和的碳酸氢钠溶液、饱和的食盐水洗涤，并经无水硫酸钠干燥。
将混合物过滤，滤液经过真空减压浓缩。将残余物通过硅胶色谱法纯化，得4‑溴丁酸正癸酯（6.20 g，20.18 mmol，63.9 %）。

[0176] 步骤二：4‑(4‑(癸氧基)‑4‑氧代丁基)哌嗪‑1‑羧酸叔丁酯（YK‑501‑PM2）的合成[0177] 将4‑溴丁酸正癸酯（1.00 g，3.25 mmol）和哌嗪‑1‑甲酸叔丁酯（0.61 g，3.25 mmol）溶于乙腈（10 mL）中，向上述体系中加入碳酸钾（1.35 g，9.75 mmol）后加热至60 ℃搅拌反应3 h，反应完毕后，待反应液冷却至室温后过滤，滤液经过真空减压浓缩。将残余物通过硅胶色谱法纯化，得4‑(4‑(癸氧基)‑4‑氧代丁基)哌嗪‑1‑羧酸叔丁酯（0.80 g，1.94 +mmol，59.7 %）。C23H44N2O4，MS(ES): m/z（M+H）413.4。

[0178] 步骤三：4‑(哌嗪‑1‑基)丁酸癸酯（YK‑501‑PM3）的合成

[0179] 将4‑(4‑(癸氧基)‑4‑氧代丁基)哌嗪‑1‑羧酸叔丁酯（0.60 g，1.45 mmol）溶于二氯甲烷（6 mL）中，向上述体系中加入三氟乙酸（6 mL），于30 35 ℃下搅拌反应1 h。反应完~毕后将反应液依次用饱和的碳酸氢钠溶液、饱和的食盐水洗涤，并经无水硫酸钠干燥。将混合物过滤，滤液经过真空减压浓缩。将残余物通过硅胶色谱法纯化，得4‑(哌嗪‑1‑基)丁酸+
癸酯（315 mg，1.00 mmol，69.0 %）。C18H36N2O2，MS(ES): m/z（M+H）313.3。

[0180] 步骤四：6‑溴己酸2‑辛基癸酯（YK‑501‑PM4）的合成

[0181] 以6‑溴己酸（764 mg，3.92 mmol）和2‑辛基癸醇（1.00 g，3.70 mmol）为原料，按照制备YK‑501‑PM1的方法，得到6‑溴己酸2‑辛基癸酯（1.25 g，2.78 mmol，75.1 %）。

[0182] 步骤五：6‑(4‑(4‑(癸氧基)‑4‑氧代丁基)哌嗪‑1‑基)己酸2‑辛基癸酯（YK‑501）的合成

[0183] 将6‑溴己酸2‑辛基癸酯（448 mg，1.00 mmol）和4‑(哌嗪‑1‑基)丁酸癸酯（315 g，1.00 mmol）溶于乙腈（3 mL）中，向上述体系中加入碳酸钾（414 mg，3.00 mmol），加热至60 ℃搅拌反应5 h，反应完毕后，待反应液冷却至室温后过滤，滤液经过真空减压浓缩。将残余物通过硅胶色谱法纯化，得6‑(4‑(4‑(癸氧基)‑4‑氧代丁基)哌嗪‑1‑基)己酸2‑辛基癸酯+
（102 mg，0.15 mmol，15.0 %）。C42H82N2O4，MS(ES): m/z（M+H）679.7。

[0184] 1H NMR (CDCl3，400 MHz，298 K) δ 4.04 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.95 (d, J =5.8 Hz, 2H), 2.48 (s, 6H), 2.37 – 2.26 (m, 8H), 1.80 (p, J = 7.4 Hz, 2H),
1.69 – 1.55 (m, 5H), 1.50 (dd, J = 15.3, 7.8 Hz, 2H), 1.36 – 1.18 (m, 46H),
0.87 (t, J = 6.7 Hz, 9H)。

[0185] 2. 6,6'‑(哌嗪‑1,4‑二基)二(己酸2‑辛基癸酯)（YK‑502）的合成

[0186] 合成路线如下：

[0187]

[0188] 以哌嗪（21 mg，0.24 mmol）和6‑溴己酸2‑辛基癸酯（269 mg，0.60 mmol）为原料，按照制备YK‑501的方法，得所述目标产物（95 mg，0.12 mmol，50.0 %）。C52H102N2O4，MS(ES): +m/z（M+H）819.9。

[0189] 1H NMR (CDCl3，400 MHz, 298 K) δ 3.96 (d, J = 5.5 Hz, 4H), 2.62 (s,5H), 2.42 (s, 3H), 2.30 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 1.68 – 1.52 (m, 10H), 1.29 (brs, , 64H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 12H)。

[0190] 3. 6‑(4‑(4‑(二癸基氨基)‑4‑氧代丁基)哌嗪‑1‑基)己酸3‑己基壬酯（YK‑503）的合成

[0191] 合成路线如下：

[0192]

[0193] 步骤一：4‑溴丁酰氯（YK‑503‑PM1）的合成

[0194] 将4‑溴丁酸（1.00 g，5.78 mmol）溶于二氯甲烷（10 ml）中，向上述溶液中滴加N,N‑二甲基甲酰胺（100 mg，1.37 mmol），维持体系温度‑5 5 ℃，滴加二氯亚砜（1.39 g，~11.68 mmol），滴加完毕后自然升温至室温，继续反应4 h。反应完毕后将反应液通过真空减压浓缩，得4‑溴丁酰氯（1.07 g，5.78 mmol，100.0 %）。

[0195] 步骤二：4‑溴‑N,N‑二癸基丁酰胺（YK‑503‑PM2）的合成

[0196] 将二癸胺（802 mg，2.70 mmol）和4‑溴丁酰氯（600 mg，3.24 mmol）溶于二氯甲烷（15 mL）中，向上述溶液中加入三乙胺（273 mg，2.70 mmol），于30 35 ℃下搅拌反应2 h。反~应完毕后将反应液用饱和的碳酸氢钠溶液洗涤，并经无水硫酸钠干燥。将混合物过滤，滤液经过真空减压浓缩。将残余物通过硅胶色谱法纯化，得4‑溴‑N,N‑二癸基丁酰胺（1.11 g，
2.49 mmol，92.2 %）。

[0197] 步骤三：4‑(4‑(二癸基氨基)‑4‑氧代丁基)哌嗪‑1‑羧酸叔丁酯（YK‑503‑PM3）的合成

[0198] 以哌嗪‑1‑甲酸叔丁酯（464 mg，2.49 mmol）和4‑溴‑N,N‑二癸基丁酰胺（1.11 g，2.49 mmol）为原料，按照制备YK‑501‑PM2的方法，得4‑(4‑(二癸基氨基)‑4‑氧代丁基)哌+
嗪‑1‑羧酸叔丁酯（929 mg，1.68 mmol，67.5%）。C33H65N3O3，MS(ES): m/z（M+H）552.5。

[0199] 步骤四：N,N‑二癸基‑4‑(哌嗪‑1‑基)丁酰胺（YK‑503‑PM4）的合成

[0200] 以4‑(4‑(二癸基氨基)‑4‑氧代丁基)哌嗪‑1‑羧酸叔丁酯（929 mg，1.68 mmol）为原料，按照制备YK‑501‑PM3的方法，得N,N‑二癸基‑4‑(哌嗪‑1‑基)丁酰胺（604 mg，1.34 +mmol，79.8 %）。C28H57N3O，MS(ES): m/z（M+H）452.5。

[0201] 步骤五：6‑溴己酸3‑己基壬酯（YK‑503‑PM5）的合成

[0202] 以6‑溴己酸（1.03 g，5.28 mmol）和3‑己基壬醇（1.00 g，4.38 mmol）为原料，按照制备YK‑501‑PM1的方法，得6‑溴己酸3‑己基壬酯（1.39 g，3.43 mmol，78.3 %）。

[0203] 步骤六：6‑(4‑(4‑(二癸基氨基)‑4‑氧代丁基)哌嗪‑1‑基)己酸3‑己基壬酯（YK‑503）的合成

[0204] 以6‑溴己酸3‑己基壬酯（496 mg，1.22 mmol）和N,N‑二癸基‑4‑(哌嗪‑1‑基)丁酰胺（300 mg，0.66 mmol）为原料，按照制备YK‑501的方法，得所述目标产物（99 mg，0.13 +mmol，19.7%）。C49H97N3O3，MS(ES): m/z（M+H）776.9。

[0205] 1H NMR (CDCl3, 400 MHz, 298 K) δ 4.07 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 3.31 – 3.24 (m, 2H), 3.23 – 3.14 (m, 2H), 2.63 – 2.46 (m, 6H), 2.41 (s, 2H), 2.31 (dt, J = 14.8, 8.9 Hz, 6H), 1.89 – 1.81 (m, 2H), 1.57 – 1.47 (m, 8H), 1.25 (brs, 55H), 0.87 (t, J = 5.9 Hz, 12H)。

[0206] 4.8‑(4‑(4‑(二癸基氨基)‑4‑氧代丁基)哌嗪‑1‑基)辛酸2‑(丁硫基)乙酯（YK‑504）的合成

[0207] 合成路线如下：

[0208]

[0209] 步骤一：8‑溴辛酸2‑(丁硫基)乙酯（YK‑504‑PM1）的合成

[0210] 以2‑(丁硫基)乙烷‑1‑醇（200 mg，1.49 mmol）和8‑溴辛酸（400 mg，1.79 mmol）为原料，按照制备YK‑501‑PM1的方法，得8‑溴辛酸2‑(丁硫基)乙酯（300 mg，0.88 mmol，59.1 %）。

[0211] 步骤二：8‑(4‑(4‑(二癸基氨基)‑4‑氧代丁基)哌嗪‑1‑基)辛酸2‑(丁硫基)乙酯（YK‑504）的合成

[0212] 以8‑溴辛酸2‑(丁硫基)乙酯（300 mg，0.88 mmol）和N,N‑二癸基‑4‑(哌嗪‑1‑基)丁酰胺（400 mg，0.88 mmol）为原料，按照制备YK‑501的方法，得所述目标产物（133 mg，+0.19 mmol，21.6 %）。C42H83N3O3S，MS(ES): m/z（M+H）710.7。

[0213] 1H NMR (CDCl3,400 MHz, 298 K) δ 4.21 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.31 – 3.24 (m, 2H), 3.23 – 3.16 (m, 2H), 2.72 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.60 – 2.50 (m, 6H), 2.36 – 2.27 (m, 6H), 1.89 – 1.81 (m, 2H), 1.56 (ddd, J = 25.0, 16.5, 7.1 Hz, 
12H), 1.26 (brs, 40H), 0.93 – 0.85 (m, 9H)。

[0214] 5.8‑(4‑(6‑((3‑己基壬基)氧基)‑6‑氧代己基)哌嗪‑1‑基)辛酸3‑(戊基二硫基)丙酯（YK‑505）的合成

[0215] 合成路线如下：

[0216]

[0217] 步骤一：4‑(6‑((3‑己基壬基)氧基)‑6‑氧代己基)哌嗪‑1‑羧酸叔丁酯（YK‑505‑PM1）的合成

[0218] 以哌嗪‑1‑甲酸叔丁酯（220 mg，1.18 mmol）和6‑溴己酸3‑己基壬酯（400 mg，0.98 mmol）为原料，按照制备YK‑501‑PM2的方法，得4‑(6‑((3‑己基壬基)氧基)‑6‑氧代己基)哌+嗪‑1‑羧酸叔丁酯（278 mg，0.54 mmol，45.8 %）。C30H58N2O4，MS(ES): m/z（M+H）511.5。

[0219] 步骤二：6‑(哌嗪‑1‑基)己酸3‑己基壬酯（YK‑505‑PM2）的合成

[0220] 以4‑(6‑((3‑己基壬基)氧基)‑6‑氧代己基)哌嗪‑1‑羧酸叔丁酯（278 mg，0.54 mmol）为原料，按照制备YK‑501‑PM3的方法，得6‑(哌嗪‑1‑基)己酸3‑己基壬酯（120 mg，+0.29 mmol，53.7 %）。C25H50N2O2，MS(ES): m/z（M+H）411.4。

[0221] 步骤三：3‑(戊基二硫基)丙‑1‑醇（YK‑505‑PM3）的合成

[0222] 将3‑巯基丙醇（1.00 g，10.85 mmol）和戊烷‑1‑硫醇（1.13 g，10.85 mmol）溶于二氯甲烷和甲醇（体积比1:1）的混合溶剂（100 mL）中，氮气保护下，加入吡啶（1.71 g，21.60 mmol），并将碘粒（2.74 g，10.85 mmol）分批少量多次加入至上述体系中，碘粒加入完毕后，于30 35 ℃下搅拌反应20 h。反应完毕后将反应液用饱和的食盐水洗涤，并经无水硫酸钠~干燥。将混合物过滤，滤液经过真空减压浓缩。将残余物通过硅胶色谱法纯化，得3‑(戊基二硫基)丙‑1‑醇（860 mg，4.42 mmol，79.7 %）。

[0223] 步骤四：8‑溴辛酸3‑(戊基二硫基)丙酯（YK‑505‑PM4）的合成

[0224] 以3‑(戊基二硫基)丙‑1‑醇和8‑溴辛酸（100 mg，0.51 mmol）为原料，按照制备YK‑501‑PM1的方法，得8‑溴辛酸3‑(戊基二硫基)丙酯（161 mg，0.40 mmol，78.43%）。

[0225] 步骤五：8‑(4‑(6‑((3‑己基壬基)氧基)‑6‑氧代己基)哌嗪‑1‑基)辛酸3‑(戊基二硫基)丙酯（YK‑505）的合成

[0226] 以8‑溴辛酸3‑(戊基二硫基)丙酯（161 mg，0.40 mmol）和6‑(哌嗪‑1‑基)己酸3‑己基壬酯（120 mg，0.29 mmol）为原料，按照制备YK‑501的方法，得所述目标产物（48 mg，0.07 +mmol，22.8 %）。C41H80N2O4S2，MS(ES): m/z（M+H）729.6。

[0227] 1H NMR (CDCl3，400 MHz, 298 K) δ 4.16 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 4.07 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.70 (dt, J = 15.0, 7.3 Hz, 4H), 2.53 (s, 4H), 2.35 (dd, J = 
14.8, 7.9 Hz, 4H), 2.29 (dd, J = 13.5, 6.0 Hz, 4H), 2.06 – 1.99 (m, 2H), 1.70 – 1.48 (m, 12H), 1.41 – 1.20 (m, 37H), 0.89 (dt, J = 13.6, 7.0 Hz, 9H)。

[0228] 6. 6‑(4‑(3‑((2‑(十二烷基二硫基)乙基)氨基)‑3‑氧代丙基)哌嗪‑1‑基)己酸3‑己基壬酯（YK‑506）的合成

[0229] 合成路线如下：

[0230]

[0231] 步骤一：S‑(2‑氨乙基)硫磺酸（YK‑506‑PM1）的合成

[0232] 将2‑氯乙胺盐酸盐（5.00 g，43.11 mmol）和硫代硫酸钠（10.20 g，64.51 mmol）溶于水（10 mL）中，于70 ℃下搅拌反应3 h。反应完毕后，趁热抽滤，滤饼用乙醇洗涤，收集滤液降温至0 5 ℃搅拌析晶1 h，抽滤上述混合物体系得滤饼并进行干燥，得S‑(2‑氨乙基)硫~+
磺酸（3.64 g，23.16 mmol，53.7 %）。C2H7NO3S2，MS(ES): m/z（M+Na）180.0。

[0233] 步骤二:2‑(十二烷基二硫基)乙烷‑1‑胺（YK‑506‑PM2）的合成

[0234] 将S‑(2‑氨乙基)硫磺酸（2.00 g，12.72 mmol）和十二烷‑1‑硫醇（3.86 g，19.07 mmol）溶于甲醇（50 mL）中，向上述体系中加入氢氧化钠（760 mg，19.00 mmol），于50 ℃搅拌反应3 h。反应完毕后，体系降至室温下抽滤，用二氯甲烷淋洗滤饼，滤液经过真空减压浓缩，得2‑(十二烷基二硫基)乙烷‑1‑胺（3.00 g，10.81 mmol，85.0 %）。C14H31NS2，MS(ES): m/+z（M+H）278.2。

[0235] 步骤三：N‑(2‑(十二烷基二硫基)乙基)丙烯酰胺（YK‑506‑PM3）的合成

[0236] 将2‑(十二烷基二硫基)乙烷‑1‑胺（3.00 g，10.81 mmol）和三乙胺（3.28 g，32.41 mmol）溶于二氯甲烷（5 mL）中，控温‑5 5 ℃搅拌条件下，滴加丙烯酰氯（1.17 g，12.93 ~mmol），滴加完毕后自然升至室温继续反应0.5 h，反应完毕后将反应液依次用饱和的碳酸氢钠溶液、饱和的食盐水洗涤，并经无水硫酸钠干燥。将混合物过滤，滤液经过真空减压浓缩。将残余物通过硅胶色谱法纯化，得N‑(2‑(十二烷基二硫基)乙基)丙烯酰胺（2.60 g，+
7.84 mmol，72.5 %）。C17H33NOS2，MS(ES): m/z（M+H）332.3。

[0237] 步骤四：6‑(4‑(3‑((2‑(十二烷基二硫基)乙基)氨基)‑3‑氧代丙基)哌嗪‑1‑基)己酸3‑己基壬酯（YK‑506）的合成

[0238] 将N‑(2‑(十二烷基二硫基)乙基)丙烯酰胺（2.58 g，7.78 mmol）和6‑(哌嗪‑1‑基)己酸3‑己基壬酯（1.60 g，3.90 mmol）直接加入至反应瓶中，于70 ℃搅拌反应48 h。反应完毕后，将上述体系通过硅胶色谱法纯化，得6‑(4‑(3‑((2‑(十二烷基二硫基)乙基)氨基)‑3‑氧代丙基)哌嗪‑1‑基)己酸3‑己基壬酯（1.02 g，1.37 mmol，35.1 %）。C42H83N3O3S2，MS(ES): +m/z（M+H）742.6。

[0239] 1H NMR (CDCl3，400 MHz, 298 K) δ 8.32 (s, 1H), 4.06 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 3.60 (dd, J = 14.6, 7.2 Hz, 8H), 2.77 (dd, J = 11.0, 5.2 Hz, 8H), 2.70 – 
2.63 (m, 2H), 2.45 (d, J = 5.4 Hz, 2H), 2.28 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.24 (m, 
49H), 0.86 (t, J = 6.5 Hz, 9H)。

[0240] 7. 3,3'‑(哌嗪‑1,4‑二基)双(N‑(2‑(十二烷基二硫基)乙基)丙酰胺)（YK‑507）的合成

[0241] 合成路线如下：

[0242]

[0243] 步骤一：3,3'‑(哌嗪‑1,4‑二基)双(N‑(2‑(十二烷基二硫基)乙基)丙酰胺) （YK‑507）的合成

[0244] 以哌嗪（50 mg，0.58 mmol）和N‑(2‑(十二烷基二硫基)乙基)丙烯酰胺（434 mg，1.31 mmol）为原料，按照制备YK‑506的方法，得所述目标产物（154 mg，0.21 mmol，36.2 +
%）。C38H76N4O2S4，MS(ES): m/z（M+H）749.5。

[0245] 1H NMR (CDCl3，400 MHz, 298 K) δ 8.42 (s,2H), 3.60 (d, J = 5.4 Hz, 4H), 2.78 (t, J = 5.3 Hz, 4H), 2.70 (dd, J = 15.3, 7.5 Hz, 12H), 2.45 (s, 4H), 
1.70 – 1.63 (m, 4H), 1.38 – 1.23 (m, 40H), 0.88 (t, J = 6.3 Hz, 6H)。

[0246] 8. 1,1'‑[[2‑[4‑[2‑[[2‑[双(2‑羟基十二烷基)氨基]乙基](2‑羟基十二烷基)氨基]乙基]哌嗪‑1‑基]乙基]亚氨基]双(十二烷‑2醇)（C12‑200）的合成

[0247] 合成路线如下：

[0248]

[0249] 步骤一：2‑(4‑(2‑((氰甲基)氨基)乙基)哌嗪‑1‑基)乙腈（C12‑200‑PM1）的合成[0250] 将1‑(2‑氨基乙基)哌嗪(4.00 g, 30.96 mmol)和氯乙腈（5.10 g，67.75 mmol）溶于无水乙醇（250 mL）中，向上述体系中加入碳酸钾（16.86 g，122.00 mmol）加热至回流反应7 h。反应完毕后待反应液降至室温后过滤，滤液经真空减压浓缩除去溶剂。将残余物通过硅胶色谱法纯化，得到2‑(4‑(2‑((氰甲基)氨基)乙基)哌嗪‑1‑基)乙腈（3.70g，17.85 +mmol，57.7%）。C10H17N5，MS(ES): m/z（M+H）208.2。

[0251] 步骤二：N1‑(2‑(4‑(2‑氨基乙基)哌嗪‑1‑基)乙基)乙烷‑1,2‑二胺 （C12‑200‑PM2）的合成

[0252] 将2‑(4‑(2‑((氰甲基)氨基)乙基)哌嗪‑1‑基)乙腈(0.50 g, 2.41 mmol)溶于甲醇（25 mL）和氨水（3 mL）的混合溶剂中，向上述体系中加入Raney®‑Nickel‑2400型催化剂（250mg）。反应体系维持在1000 psi压力的氢气的氛围中，反应6 h。反应完毕后将反应液过1
滤，滤液经真空减压浓缩除去溶剂，得N ‑(2‑(4‑(2‑氨基乙基)哌嗪‑1‑基)乙基)乙烷‑1,2‑+
二胺蓝色粗品（0.48 g，2.23 mmol，92.5%）。C10H25N5，MS(ES): m/z（M+H）216.2。

[0253] 步骤三：1,1'‑[[2‑[4‑[2‑[[2‑[双(2‑羟基十二烷基)氨基]乙基](2‑羟基十二烷基)氨基]乙基]哌嗪‑1‑基]乙基]亚氨基]双(十二烷‑2醇)（C12‑200）的合成

[0254] 将1,2‑环氧十二烷(4.00 g, 30.96 mmol)和N1‑(2‑(4‑(2‑氨基乙基)哌嗪‑1‑基)乙基)乙烷‑1,2‑二胺（0.30 g）磁力搅拌混合均匀，将上述体系加热至80 ℃反应48 h。反应完毕后，将反应体系通过硅胶色谱法纯化，得到1,1'‑[[2‑[4‑[2‑[[2‑[双(2‑羟基十二烷基)氨基]乙基](2‑羟基十二烷基)氨基]乙基]哌嗪‑1‑基]乙基]亚氨基]双(十二烷‑2醇)+（668 mg，0.06 mmol，42.4%）。C70H145N5O5，MS(ES): m/z（M+H）1137.1。

[0255] 1H NMR (CDCl3，400 MHz, 298 K) δ 5.00–4.00 (br s, 5H), 3.62 and 3.55 (apparent br s, 5H), 3.00–2.00 (m, 30H), 1.52–1.25 (m, 90H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 15H)。

[0256] 9. 1,1'‑(哌嗪‑1,4‑二基)双(3‑((双(2‑羟基十四烷基)氨基)乙基)(甲基)氨基)丙‑1‑酮)（MIC3）的合成

[0257] 合成路线如下：

[0258]

[0259] 步骤一：1,1'‑(哌嗪‑1,4‑二基)双(丙‑2‑烯‑1‑酮)（MIC3‑PM1）的合成[0260] 将哌嗪（2.00 g，23.22 mmol）和三乙胺（6.56 g，64.82 mmol）溶于二氯甲烷（20 mL）中，控温‑5 5 ℃搅拌条件下，滴加丙烯酰氯（5.25 g，58.05 mmol），滴加完毕后自然升~至室温继续反应0.5 h，反应完毕后将反应液依次用饱和的碳酸氢钠溶液、饱和的食盐水洗涤，并经无水硫酸钠干燥。将混合物过滤，滤液经过真空减压浓缩。将残余物通过硅胶色谱法纯化，得1,1'‑(哌嗪‑1,4‑二基)双(丙‑2‑烯‑1‑酮)（2.80 g，14.42 mmol，62.1 %）。
+
C10H14N2O2，MS(ES): m/z（M+H）195.2。

[0261] 步骤二：（（哌嗪‑1,4‑二基双（3‑氧丙烷‑3,1‑二基））双（甲基氮杂二基））二氨基甲酸二叔丁酯（MIC3‑PM2）的合成

[0262] 将1,1'‑(哌嗪‑1,4‑二基)双(丙‑2‑烯‑1‑酮)（1.00 g，5.15 mmol）和（2‑（甲胺基）乙基）氨基甲酸叔丁酯（2.70 g，15.50 mmol）直接加入至反应瓶中，于70 ℃搅拌反应48 h。反应完毕后，将上述体系通过硅胶色谱法纯化，得（（哌嗪‑1,4‑二基双（3‑氧丙烷‑3,1‑二基））双（甲基氮杂二基））二氨基甲酸二叔丁酯（1.12 g，2.06 mmol，40.0 %）。C26H50N6O6，MS+
(ES): m/z（M+H）543.3。

[0263] 步骤三：1,1'‑（哌嗪‑1,4‑二基）双（3‑（（2‑氨基乙基）（甲基）氨基）丙‑1‑酮）（MIC3‑PM3）的合成

[0264] 将（（哌嗪‑1,4‑二基双（3‑氧丙烷‑3,1‑二基））双（甲基氮杂二基））二氨基甲酸二叔丁酯（1.12 g，2.06 mmol）溶于二氯甲烷（12 mL）中，向上述体系中加入三氟乙酸（6 mL），于30 35 ℃下搅拌反应1 h。反应完毕后将反应液依次用饱和的碳酸氢钠溶液、饱和的食盐~水洗涤，并经无水硫酸钠干燥。将混合物过滤，滤液经过真空减压浓缩。将残余物通过硅胶色谱法纯化，得1,1'‑（哌嗪‑1,4‑二基）双（3‑（（2‑氨基乙基）（甲基）氨基）丙‑1‑酮）（310 +
mg，0.91 mmol，44.2 %）。C16H34N6O2，MS(ES): m/z（M+H）343.3。

[0265] 步骤四：1,1'‑(哌嗪‑1,4‑二基)双(3‑((双(2‑羟基十四烷基)氨基)乙基)(甲基)氨基)丙‑1‑酮)（MIC3）的合成

[0266] 以1,1'‑（哌嗪‑1,4‑二基）双（3‑（（2‑氨基乙基）（甲基）氨基）丙‑1‑酮）（310 mg，0.91 mmol）和2‑十二烷基环氧乙烷（1.27 g，5.98 mmol）为原料，按照制备C12‑200的方法，+
得所述目标产物（554 mg，0.46 mmol，50.5 %）。C72H146N6O6，MS(ES): m/z（M+H）1193.1。

[0267] 1H NMR (CDCl3，400 MHz, 298 K) δ 5.19 (s, 2H), 3.75–3.42 (m, 8H), 3.23 (d, J=5.0, 4H), 2.88–2.16 (m, 30H), 1.47–1.16 (m, 92H), 0.89 (t, J=6.8,12H)。

[0268] 10. N,N'‑（哌嗪‑1,4‑二基双（丙‑3,1‑二基））双（3‑（双十二烷基氨基）丙酰胺）（PPZ‑A12）的合成

[0269] 合成路线如下：

[0270]

[0271] 步骤一：（（（哌嗪‑1,4‑二基双（丙基‑3,1‑二基））双（氮杂二基）双（3‑氧杂丙烷‑3,1‑二基））二氨基甲酸二叔丁酯（PPZ‑A12‑PM1）的合成

[0272] 将3‑((叔丁氧羰基)氨基)丙酸（1.70 g  , 8.98 mmol）、DIPEA（1.16 g, 8.98 mmol）、EDCI (1.73 g, 9.02 mmol)和HOBt(1.22 g, 9.03 mmol)溶于二氯甲烷（20mL）中，室温下搅拌10 min，然后向上述体系中滴加3,3'‑(哌嗪‑1,4‑二基)双(丙‑1‑胺)（0.60 g, 3.00 mmol）。该体系在室温下搅拌12 h，并通过加入饱和NaHCO3溶液（20 mL）进行淬灭。水相用二氯甲烷(20mL)萃取三次，合并有机相并经无水硫酸钠干燥。将混合物过滤，滤液经过真空减压浓缩。将残余物通过硅胶色谱法纯化，得（（（哌嗪‑1,4‑二基双（丙基‑3,1‑二基））双（氮杂二基）双（3‑氧杂丙烷‑3,1‑二基））二氨基甲酸二叔丁酯（1.26 g，2.32 mmol，77.3 +
%）。C26H50N6O6，MS(ES): m/z（M+H）543.4。

[0273] 步骤二：N,N'‑(哌嗪‑1,4‑二基双(丙‑3,1‑二基))双(3‑氨基丙酰胺)（PPZ‑A12 ‑PM2）的合成

[0274] 以（（（哌嗪‑1,4‑二基双（丙基‑3,1‑二基））双（氮杂二基）双（3‑氧杂丙烷‑3,1‑二基））二氨基甲酸二叔丁酯（1.26 g，2.32 mmol）为原料，按照制备MIC3‑PM3的方法，得所述+目标产物（0.70 g，2.04 mmol，87.9 %）。C16H34N6O2，MS(ES): m/z（M+H）343.3。

[0275] 步骤三：N,N'‑(哌嗪‑1,4‑二基双(丙‑3,1‑二基))双(3‑(双十二烷基氨基)丙酰胺)（PPZ‑A12）的合成

[0276] 将N,N'‑(哌嗪‑1,4‑二基双(丙‑3,1‑二基))双(3‑氨基丙酰胺)（0.70 g，2.04 mmol）和十二醛（2.26 g，12.26 mmol）溶于二氯甲烷中（10 ml），向上述体系中加入醋酸硼氢化钠（2.16 g，10.19 mmol），该悬浮体系室温下搅拌反应12 h，并通过加入饱和NaHCO3溶液（10 mL）进行淬灭。水相用二氯甲烷(20mL)萃取三次，合并有机相并经无水硫酸钠干燥。将混合物过滤，滤液经过真空减压浓缩。将残余物通过硅胶色谱法纯化，得N,N'‑(哌嗪‑1,
4‑二基双(丙‑3,1‑二基))双(3‑(双十二烷基氨基)丙酰胺)（1.22 g，1.20 mmol，58.8 %）。
+
C64H130N6O2，MS(ES): m/z（M+H）1016.7。

[0277] 1H NMR (CDCl3，400 MHz, 298 K) δ 8.50 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.23 (q, J =[0278] 6.7 Hz, 4H), 2.64 (t, J = 6.1 Hz, 4H), 2.59 – 2.20 (m, 24H), 1.65 (p, J = 7.1 Hz, 4H), 1.48 – 1.33 (m, 9H), 1.32 – 1.11 (m, 75H), 0.85 (t, J = 6.9 Hz, 12H)。

[0279] 实施例2：纳米脂质颗粒（LNP制剂）制备条件优化

[0280] 1. 载体（脂质体）与mRNA比例优化

[0281]

[0282] 将实施例1中合成的阳离子脂质化合物YK‑506分别与DSPC（艾伟拓（上海）医药科技有限公司）、胆固醇（艾伟拓（上海）医药科技有限公司）和DMG‑PEG2000按照49:10:39.5:1.5的摩尔比溶于乙醇，制备乙醇脂质溶液。通过乙醇注入法将乙醇脂质溶液快速加入柠檬酸盐缓冲液（pH=4 5），涡旋30s备用。将eGFP‑mRNA（购自上海起发实验试剂有限公司）在柠~
檬酸盐缓冲液(pH=4 5)中稀释得到mRNA水溶液。将一定体积的脂质体溶液与mRNA水溶液，~
分别以总脂质与mRNA的重量比为5:1、10:1、15:1、20:1、30:1和35:1制备脂质体。25℃超声
15min（超声频率40kHz，超声功率800W）。所得脂质体用PBS稀释至10倍体积后，300KDa超滤管进行超滤除乙醇。再经PBS定容至一定体积，得到使用阳离子脂质YK‑506/DSPC/胆固醇/DMG‑PEG2000 (摩尔比为49:10:39.5:1.5)包封eGFP‑mRNA的LNP制剂。

[0283] 细胞转染实验结果显示，载体与mRNA重量比在10:1 30:1范围内，均有较好转染效~果，其中转染效果最好为15:1，比例为5:1和35:1转染效果较差，不能用此比例来运载mRNA。

[0284] 2. 阳离子脂质与中性脂质比例优化

[0285] 按照1中方法制备包封eGFP‑mRNA的LNP制剂，其中阳离子脂质YK‑506与中性脂质DSPC摩尔比分别为1:1、3:1、3.5:1、4:1、4.9:1、10:1、15:1和20: 1。

[0286] 通过细胞转染实验可以看出，阳离子脂质与中性脂质摩尔比为1:1 15:1均有转染~效果，其中转染效率最高的是4.9:1。

[0287] 3. 聚合物共轭脂质占载体（脂质体）比例优化

[0288] 按照1中方法制备包封eGFP‑mRNA的LNP制剂，载体中阳离子脂质为YK‑506，其中聚合物共轭脂质DMG‑PEG2000占载体摩尔比分别为0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、5%、10%和15%。

[0289] 细胞转染实验结果显示，聚合物共轭脂质占载体摩尔比在0.5% 10%范围内，均有~转染效果，1.5%时转染效率最高，10%时最低。

[0290] 4. 载体（脂质体）中各成分比例优化

[0291] 按照1中方法制备包封eGFP‑mRNA的LNP制剂，其中阳离子脂质YK‑506、中性脂质DSPC、结构性脂质胆固醇和聚合物共轭脂质DMG‑PEG2000摩尔比分别为75:5:15:5、65:8:25:2、49:10:39.5:1.5、45:10:43.5:1.5、45:25:20:10、40:10:48.5:1.5、35:10:53.5:1.5和25:5:65:5。

[0292] 通过细胞转染实验可知，阳离子脂质、中性脂质、结构性脂质和聚合物共轭脂质摩尔比为75:5:15:5、65:8:25:2、49:10:39.5:1.5、45:10:43.5:1.5、45:25:20:10、40:10:48.5:1.5、35:10:53.5:1.5和25:5:65:5比例下均能转染，在比例为(35 49):(7.5 15):(35~ ~
55):(1 5)的范围内具有良好的转染效果，其中摩尔比为49:10:39.5:1.5时，转染效果最~ ~
好。

[0293] 实施例3：eGFP‑mRNA的LNP制剂细胞转染实验

[0294] 细胞复苏与传代：将293T细胞复苏，于培养皿中培养传代至所需的细胞数量。

[0295] 种板：将培养皿中的细胞消化并计数，以每孔1万个细胞铺在96孔板中，以每孔15万个细胞铺在12孔板中，过夜培养至细胞贴壁。

[0296] 细胞转染实验：分别将含有1.5μg实施例2中制备的eGFP‑mRNA的LNP制剂（载体中阳离子脂质为YK‑506）以及eGFP‑mRNA的Lipofectamin2000制剂加入12孔板的细胞培养液中，继续培养24h后，经荧光显微镜观察，根据荧光强度考察样品的转染效率。

[0297] 根据实验结果，最后确定了纳米脂质颗粒（LNP制剂）的制备条件：载体与mRNA比例为15: 1；阳离子脂质与中性脂质摩尔比为4.9: 1；聚合物共轭脂质占脂质体1.5%；阳离子脂质、中性脂质、结构性脂质和聚合物共轭脂质摩尔比为49:10:39.5:1.5（图1），后面的实验按此条件制备纳米脂质颗粒（LNP制剂）。

[0298] 实施例4：纳米脂质颗粒（LNP制剂）的制备（最优配比）

[0299] 将表1中所列阳离子脂质分别与DSPC（艾伟拓（上海）医药科技有限公司）、胆固醇（艾伟拓（上海）医药科技有限公司）和DMG‑PEG2000按照49:10:39.5:1.5的摩尔比溶于乙醇，制备乙醇脂质溶液，通过乙醇注入法将乙醇脂质溶液快速加入柠檬酸盐缓冲液（pH=4~5），涡旋30s备用。将eGFP‑mRNA（购自上海起发实验试剂有限公司）或Fluc‑mRNA（购自上海起发实验试剂有限公司）在柠檬酸盐缓冲液(pH=4 5)中稀释得到mRNA水溶液。将一定体积~
的脂质体溶液与mRNA水溶液，以总脂质与mRNA的重量比为15: 1制备脂质体。25℃超声
15min（超声频率40kHz，超声功率800W）。所得脂质体经用PBS稀释至10倍体积后，300KDa超滤管进行超滤除乙醇。再经PBS定容至一定体积，得到使用阳离子脂质/DSPC/胆固醇/DMG‑PEG2000 (摩尔百分比为49:10:39.5:1.5)包封eGFP‑mRNA或Fluc‑mRNA的LNP制剂。

[0300] 实施例5：纳米脂质颗粒粒径及多分散系数（PDI）的测定

[0301] 利用动态光散射，采用马尔文激光粒度仪测定粒径及多分散系数（PDI）。

[0302] 取脂质体溶液10μL，用无RNA酶去离子水稀释至1mL，加入样品池，每个样品重复测定3次。测定条件为：90 °散射角，25℃。检测结果如表2：

[0303] 表2 纳米脂质颗粒的粒径及多分散系数（PDI）

[0304]

[0305] 由表2可以看出，实施例4中制备的纳米脂质颗粒粒径在140 210nm之间，均可用于~递送mRNA：

[0306] 其中，由YK‑505制备的颗粒粒径最小，为140.00nm；由YK‑504制备的颗粒粒径最大，为200.95nm。

[0307] 所有纳米脂质颗粒的多分散系数在5% 25%之间，其中最小的是YK‑505，为5.6%；最~大的是YK‑504，为23.8%。

[0308] 由YK‑506制备的颗粒形态也在较好水平，其中粒径为144.66 nm，多分散系数为11.9%，比由现有技术其它结构类似的阳离子脂质，例如C12‑200、MIC3和PPZ‑A12制备的颗粒粒径更小，均一性更好。

[0309] 实施例6：体外验证LNP递送载体的性能

[0310] 细胞复苏与传代：方法同实施例3。

[0311] 种板：方法同实施例3。

[0312] 1. Fluc‑mRNA的荧光检测（转染效率）

[0313] 将含有0.3μg Fluc‑mRNA的LNP制剂（LNP制剂载体组分为阳离子脂质、DSPC、胆固醇和DMG‑PEG2000，摩尔比为49:10:39.5:1.5，其中阳离子脂质为表1中所列阳离子脂质）加入96孔板的细胞培养液中，继续培养24 h后，按照Gaussia Luciferase Assay Kit说明书加入相应试剂，经IVIS荧光检测系统检测每孔荧光表达强度。设计的化合物与现有技术代表性阳离子脂质化学结构如表1。由本申请设计的一系列阳离子脂质化合物与现有技术阳离子脂质，包括MC3、C12‑200、MIC3和PPZ‑A12，制备的LNP制剂在细胞内的转染效率，结果见表3。

[0314] 表3列出了由不同阳离子脂质制备的含有Fluc‑mRNA的LNP制剂荧光检测结果。

[0315] 表3 Fluc‑mRNA的荧光检测结果

[0316]

[0317] 实验结果分析：

[0318] (1) 本申请设计的化合物，其中包括YK‑506和YK‑504，与现有技术代表性阳离子脂质相比，有的化学结构差异较大，例如MC3；有的差异较小，例如C12‑200、MIC3和PPZ‑A12。

[0319] 与现有技术代表性阳离子脂质MC3相比，本申请设计的化合物化学结构完全不同，差异巨大。MC3无哌嗪基，而本申请设计的化合物均有哌嗪基；MC3只有1个支链结构疏水尾，而本申请设计的化合物有2个疏水尾；MC3的尾部结构中含有双键，而本申请设计的化合物尾部结构无双键，并且其它基团也均有较大差异。

[0320] 与现有技术包含哌嗪基的阳离子脂质，例如C12‑200、MIC3和PPZ‑A12相比，本申请设计的化合物化学结构类似，仅个别基团稍有差别。

[0321] (2) 设计的一系列化合物中，由YK‑506和YK‑504制备的LNP制剂细胞转染效率最高，相比于现有技术中代表性阳离子脂质，无论是结构相差巨大（例如MC3），还是结构差异很小（例如C12‑200、MIC3和PPZ‑A12），细胞转染效率均显著提高。例如，YK‑506的细胞转染效率可达MC3的4.83倍、C12‑200的2.94倍、MIC3的4.00倍和PPZ‑A12的3.73倍。

[0322] MC3、C12‑200、MIC3、PPZ‑A12是现有技术中代表性的阳离子脂质，具有较好的转染性能。

[0323] 由表3和图2可知，由YK‑506和YK‑504制备的含有Fluc‑mRNA的LNP制剂，荧光吸收最强，RLU值分别为624617和112934。

[0324] YK‑506可达MC3的4.83倍，可达C12‑200的2.94倍、MIC3的4.00倍、PPZ‑A12的3.73倍，转染效率显著提高。

[0325] YK‑504可达MC3的0.87倍，可达C12‑200的0.53倍、MIC3的0.72倍、PPZ‑A12的0.67倍，转染效率相当。

[0326] 无法根据阳离子脂质化合物的结构推测由其制备的LNP制剂的细胞转染效率，无论是结构差异巨大，还是结构类似的化合物，细胞转染效率均极有可能具有非常大的差异。

[0327] (3) 将结构类似、L1和L2基团均为‑C(O)O‑的一系列化合物，例如YK‑501、YK‑502和YK‑505，与YK‑506进行了比较，这些化合物结构上的区别仅在于个别基团稍有不同（表1）。细胞转染结果表明（表3和图2），此系列化合物活性差别非常大，其中YK‑506的细胞转染效率最高，分别可达YK‑501的103.62倍、YK‑502的46.53倍和YK‑505的43.98倍，转染效率显著提高。YK‑504的细胞转染效率分别为YK‑501的18.73倍、YK‑502的8.41倍和YK‑505的7.95倍，转染效率显著提高。

[0328] (4)与结构类似、L1基团为‑C(O)O‑、L2基团为‑C(O)N((CH2)9CH3)‑的化合物YK‑503相比，YK‑506和YK‑504细胞转染效率显著提高，分别可达YK‑503的133.29倍和24.10倍。

[0329] (5)与结构类似、L1和L2基团均为‑C(O)NH‑、R1和R2均含‑S‑S‑基团的化合物YK‑507相比，YK‑506和YK‑504细胞转染效率显著提高，分别可达YK‑507的104.80倍和18.95倍。

[0330] 2. 细胞存活率测定

[0331] 将含有1.5μg Fluc‑mRNA的LNP制剂（LNP制剂载体组分为阳离子脂质、DSPC、胆固醇和DMG‑PEG2000，摩尔比为49:10:39.5:1.5，其中阳离子脂质为表1中所列阳离子脂质）加入96孔板的细胞培养液中，继续培养24 h后，向每孔中加入10μL CCK‑8溶液，将培养板在培养箱中孵育1 h后，经酶标仪测定在450nm处的吸光度，细胞存活率结果见表4。

[0332] 表4 细胞存活率

[0333]

[0334] 实验结果分析：

[0335] (1) 本申请设计的这一系列化合物，包括YK‑506和YK‑504，化学结构与现有技术代表性阳离子脂质相比，有的差异巨大，例如MC3；有的结构类似，例如C12‑200、MIC3和PPZ‑A12。由YK‑506和YK‑504制备的LNP制剂细胞毒性最低，与现有技术中代表性阳离子脂质相比，细胞存活率显著提高。例如，YK‑506细胞存活率，可比MC3高25%、比C12‑200高18%、比MIC3高33%、比PPZ‑A12高41%。无法根据阳离子脂质化合物的结构推测由其制备的LNP制剂的细胞毒性，无论是结构差异巨大，还是结构类似的化合物，对转染细胞的毒性均极有可能具有非常大的差异。

[0336] (2) 与结构类似、L1和L2基团均为‑C(O)O‑的化合物相比，YK‑506和YK‑504细胞毒性最低，细胞存活率显著提高。例如，YK‑506的细胞存活率可比YK‑501高35%、比YK‑502高39%、比YK‑505高52%。YK‑504的细胞存活率，分别比YK‑501高19%、比YK‑502高23%、比YK‑505高36%。

[0337] (3) 与结构类似、L1基团为‑C(O)O‑、L2基团为‑C(O)N((CH2)9CH3)‑的化合物相比，YK‑506和YK‑504细胞毒性最低，细胞存活率显著提高。例如，YK‑506和YK‑504的细胞存活率分别比YK‑503高44%和28%。

[0338] (4)与结构类似、L1和L2基团均为‑C(O)NH‑、R1和R2均含‑S‑S‑基团的化合物相比，YK‑506和YK504细胞毒性最低，细胞存活率显著提高。例如，YK‑506和YK‑504的细胞存活率分别比YK‑507高40%和24%。

[0339] 实施例7：体内验证阳离子脂质（LNP）递送载体的性能

[0340] 实施例7验证了由本申请设计的阳离子脂质例如YK‑506和YK‑504制备的递送载体能够在小鼠脾脏富集，递送的mRNA在小鼠脾脏蛋白质表达量，与现有技术阳离子脂质相比显著提升。体内实验进一步证明了我们的LNP递送载体能将mRNA有效地递送至动物体内，并在脾脏高效地表达。

[0341] 将含有10μg Fluc‑mRNA的LNP制剂经尾静脉注射至4 6周龄、重量为17 19g的雌性~ ~BALB/C小鼠体内，并在给药后特定的时间点（3h）对小鼠进行腹腔注射荧光成像底物，小鼠自由活动5 min，然后经IVIS Spectrum小动物活体成像仪检测LNP所携带的mRNA在小鼠体内表达的蛋白质的平均辐射强度（对应于荧光表达强度）。采样完成后，使用二氧化碳将小鼠安乐死，对小鼠进行解剖，精确地分离出小鼠的内脏器官：心、肝、脾、肺、肾。经IVIS Spectrum小动物活体成像仪检测LNP所携带的mRNA在小鼠各脏器表达的蛋白质的平均辐射强度（对应于荧光表达强度），小鼠活体成像检测结果见表5。

[0342] 表5 小鼠给药后特定的时间点(3h)的活体成像实验数据

[0343]

[0344] (1)由YK‑506和YK‑504制备的LNP制剂，相比于现有技术中代表性阳离子脂质，mRNA在小鼠脾脏表达量显著提高。例如，MC3在脾脏不表达，而YK‑506和YK‑504在脾脏中均大量表达，YK‑506在脾脏表达量可达C12‑200的5.94倍，YK‑504为C12‑200的1.16倍。mRNA在小鼠脾脏表达方面与实施例6中细胞转染结果一致。

[0345] 此外，所有化合物制备的含有Fluc‑mRNA的LNP制剂，在小鼠不同器官中表达差异非常大，YK‑506、YK‑504、YK‑501和C12‑200在肝脏和脾脏中均表达，而在其它脏器，如心脏、肺和肾脏中均无表达；MC3仅在肝脏中表达，而在脾脏、心脏、肺和肾脏中均无表达（图4）。

[0346] (2)与结构类似、个别基团稍有区别的化合物YK‑501相比，由YK‑506和YK‑504制备的LNP制剂，mRNA在小鼠脾脏的表达强度均最高。例如，YK‑506在脾脏表达量可达YK‑501的207.98倍，YK‑504在脾中表达量达到了YK‑501的40.72倍。mRNA在小鼠体内表达方面与细胞转染活性一致。

[0347] 总之，本申请设计了一系列阳离子脂质化合物，例如，YK‑506和YK‑504，细胞转染效率显著提高，细胞毒性显著降低，mRNA在小鼠肝脏和脾脏表达量显著提高。

[0348] 1．设计的一系列化合物，包括YK‑506和YK‑504，化学结构与现有技术代表性阳离子脂质相比，有的差异巨大，如MC3；有的结构类似，如C12‑200、MIC3和PPZ‑A12。

[0349] 2．在设计的此系列化合物中，由YK‑506和YK‑504制备的LNP制剂，与现有技术中代表性和结构类似的阳离子脂质相比，细胞转染效率显著提高、细胞毒性显著降低、mRNA在小鼠肝和脾中表达量显著提高。例如，细胞转染效率YK‑506可达MC3的4.83倍、C12‑200的2.94倍、MIC3的4.00倍和PPZ‑A12的3.73倍；细胞存活率YK‑506可比MC3高25%、比C12‑200高18%、比MIC3高33%、比PPZ‑A12高41%；mRNA在小鼠脾脏中表达量，YK‑506是C12‑200的5.94倍，而MC3在脾脏中不表达。

[0350] 3．在本申请设计的化学结构差异很小的一系列化合物中，由YK‑506和YK‑504制备的LNP制剂，同其它化合物相比，细胞转染效率显著提高、细胞毒性显著降低，mRNA在小鼠脾脏的表达量显著提高。例如，YK‑506细胞转染效率可达YK‑501的100倍和YK‑503的130倍，细胞毒性可比YK‑505降低52%，mRNA在小鼠脾脏的表达量可达YK‑501的200倍。

[0351] 4．本公开通过独特的设计和筛选，发现了一些化合物，例如YK‑506和YK‑504，相对于现有技术结构类似的其它化合物，能够以显著提高的细胞转染效率、显著降低的细胞毒性和在动物体内脾脏中显著提高的表达量，提高了递送效率，取得了预料不到的技术效果。通过提高在动物体内脾脏（体内最大的二级淋巴器官）表达量，能够实现mRNA疫苗体内快速诱导免疫应答、产生抗体。在不改变疫苗组分的情况下显著提升预防效果，具有重要的临床意义。对于开发治疗例如淋巴瘤、白血病等脾脏受损或异常所引起的疾病有很好的靶向效果。

[0352] 以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明所保护的范围内。