一种靶向人IGSF9的单克隆抗体及其应用

摘要

本发明提供了一种靶向人IGSF9的单克隆抗体及其应用，属于单克隆抗体技术领域。本发明提供的靶向人IGSF9的单克隆抗体，所述靶向人IGSF9的单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本发明的靶向人IGSF9的单克隆抗体，通过识别介导T细胞增殖抑制的IGSF9蛋白，阻断IGSF9蛋白对T细胞的抑制作用，恢复T细胞活性，从而抑制肿瘤细胞的生长；与其他免疫抑制分子药物联用后，协同效应明显，为肿瘤的治疗提供了新的方向。

权利要求

1.一种靶向人IGSF9的单克隆抗体，其特征在于，所述靶向人IGSF9的单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种权利要求1所述的靶向人IGSF9的单克隆抗体在制备抑制肿瘤生长的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物包括所述靶向人IGSF9的单克隆抗体和免疫抑制分子。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述免疫抑制分子包括PD‑1，PD‑L1、CTLA‑

4，TIM‑3，LAG‑3，CD160，BTLA。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括非小细胞肺癌、结肠癌和急性髓系白血病。

说明书

一种靶向人IGSF9的单克隆抗体及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及单克隆抗体技术领域，尤其涉及一种靶向人IGSF9的单克隆抗体及其应用。

背景技术

[0002] 肿瘤免疫治疗通过重新启动并维持肿瘤‑免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。目前，肿瘤免疫治疗是最有可能治愈肿瘤的方法。例如，PD‑1/PD‑L1单克隆抗体在肿瘤治疗中取得巨大成功，其根本原因是PD‑L1的表达是可诱导型；肿瘤微环境中的IFNr诱导PD‑L1的表达，因此，应用PD‑1/PD‑L1单克隆抗体具有较强的抑瘤效果；但是临床数据显示，只有20％的肿瘤患者能够从中受益，表明大多数肿瘤患者有自己独特的免疫逃避机制；因此，发现新的可被诱导的肿瘤特异免疫检查点分子，研发相应治疗型抗体，能够为肿瘤患者带来新的疗法。有研究证实，免疫抑制受体IGSF9在肿瘤细胞、肿瘤浸润T、B以及巨噬细胞高表达，而在正常组织及外周免疫细胞不表达；IGSF9依赖其细胞外结构域与T细胞表面未知蛋白相结合，抑制T细胞增殖，促进肿瘤免疫逃避，为肿瘤免疫治疗带来困扰。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于提供一种靶向人IGSF9的单克隆抗体及其应用。本发明提供的靶向人IGSF9的单克隆抗体，通过识别介导T细胞增殖抑制的IGSF9蛋白，阻断IGSF9蛋白对T细胞的抑制作用，恢复T细胞活性，从而抑制肿瘤细胞的生长，为肿瘤的治疗提供了新的方向。

[0004] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0005] 本发明提供了一种靶向人IGSF9的单克隆抗体，所述靶向人IGSF9的单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0006] 本发明还提供了一种上述靶向人IGSF9的单克隆抗体在制备抑制肿瘤生长的药物中的应用。

[0007] 优选的，所述药物包括所述靶向人IGSF9的单克隆抗体和免疫抑制分子。

[0008] 优选的，所述免疫抑制分子包括PD‑1，PD‑L1、CTLA‑4，TIM‑3，LAG‑3，CD160，BTLA。

[0009] 优选的，所述肿瘤包括非小细胞肺癌、结肠癌和急性髓系白血病。

[0010] 本发明提供了一种靶向人IGSF9的单克隆抗体及其应用。本发明证实了IGSF9蛋白是受肿瘤细胞诱导产生的，通过与T细胞表面蛋白结合，抑制T细胞增殖，促进肿瘤细胞免疫逃逸，而在缺失T细胞后，IGSF9则不再促进肿瘤生长。本发明根据IGSF9蛋白的胞外结构域，制备得到一种靶向人IGSF9的单克隆抗体，可特异性识别IGSF9蛋白，阻断IGSF9和T细胞表面蛋白结合，进而恢复T细胞增殖抑制。同时，该单克隆抗体可显著增加TNF‑α和IFN‑γ水平，与其他免疫抑制分子药物联用后，协同效应明显，显著抑制肿瘤生长。

附图说明

[0011] 图1为实施例1中非小细胞肺癌和毗邻正常组织中IGSF9蛋白的表达水平。

[0012] 图2为实施例1中IGSF9蛋白在健康供体和NSCLC患者的外周血以及NSCLC患者的肿瘤组织中各种免疫细胞上的表达水平。

[0013] 图3为实施例1中IGSF9蛋白在正常C57BL/6小鼠的外周血以及荷瘤小鼠的外周血+ +和肿瘤组织中的B细胞、CD3 /CD4 T细胞上的表达水平，其中*代表p<0.05，**代表p<
0.01，***代表p<0.001，ns代表无统计学差异。

[0014] 图4为实施例2中IGSF9‑ECD‑His蛋白或IGSF9‑ECD‑Fc蛋白对活化的CD3+T细胞的影响。

[0015] 图5为实施例2中将MC38‑control、MC38‑migsf9和MC38‑migsf9‑ECD细胞接种到+ + ‑ ‑ +C57BL/6‑igsf9/和C57BL/6‑igsf9/小鼠皮下，肿瘤大小、重量和肿瘤浸润CD3T细胞水平的检测结果。

[0016] 图6为实施例2中不同浓度的IGSF9‑ECD‑His蛋白加入CD3+T细胞培养体系后的培养结果。

[0017] 图7为实施例2中IGSF9‑ECD‑His、IGSF9‑ECD‑Fc和human IgG与CD3+T细胞结合情+ +况；其中，图7a为IGSF9‑ECD‑His与CD3T细胞的结合情况；图7b为IGSF9‑ECD‑Fc与CD3T细胞+
的结合情况；图7c为IGSF9‑ECD蛋白与CD3T细胞膜上的未知蛋白的IP结果。

[0018] 图8为实施例2中将MC38‑control和MC38‑migsf9细胞接种到C57BL/6‑rag2‑/‑小鼠皮下后的肿瘤大小和肿瘤重量变化情况。

[0019] 图9为实施例3中靶向人IGSF9的单克隆抗体的制备流程图。

[0020] 图10为实施例3中小鼠血清与IGSF9的结合情况。

[0021] 图11为实施例3中小鼠血清与CD3+T细胞共培养结果。

[0022] 图12为实施例3中筛选出的7株阳性融合细胞，分别为2H11、5C3、2H5、2A3、8D9、6C12、6G10。

[0023] 图13为实施例3中筛选出的7株融合细胞分别与CD3+T细胞、IGSF9‑ECD共培养的培养结果。

[0024] 图14为实施例3中5C3亚克隆的6株单克隆细胞分别与CD3+T细胞、IGSF9‑ECD共培养的培养结果。

[0025] 图15为实施例3中5C3亚克隆的6株单克隆细胞分别与CD3+T细胞、IGSF9‑ECD共培+养后的CD3T细胞增殖结果。

[0026] 图16为实施例4中靶向人IGSF9的单克隆抗体或IgG与CD3+T细胞和THP‑1细胞共培+养的培养结果；其中，图16a为靶向人IGSF9的单克隆抗体或IgG与CD3 T细胞和THP‑1细胞共培养的培养结果；图16b为细胞上清中的TNF‑α水平；图16c为细胞上清中的IFN‑γ水平。

[0027] 图17为实施例5中靶向人IGSF9的单克隆抗体对肿瘤的抑制效果；其中，图17a为各组小鼠肿瘤大小，图17b为小鼠肿瘤生长曲线，图17b中*代表p<0.05，**代表p<0.01。

具体实施方式

[0028] 本发明提供了一种靶向人IGSF9的单克隆抗体，所述靶向人IGSF9的单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0029] 在本发明中，SEQ ID NO.1的氨基酸序列为：

[0030] EVQLLETGGGLVQPGGSRGLSCEGSGFSFSGFWMSWVRQTPGKTLEWIGNIKSDGSAINYAPSIKDRFTIFRDNDKSTLYLQMSNVRSEDTATYFCMRSNYGHWYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSLGK。

[0031] 在本发明中，SEQ ID NO.2的氨基酸序列为：

[0032] DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNFLNWYQQKPNGTVKLLIYYTSSLYSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKFPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC。

[0033] 本发明还提供了一种上述靶向人IGSF9的单克隆抗体在制备抑制肿瘤生长的药物中的应用。

[0034] 在本发明中，所述药物优选包括所述靶向人IGSF9的单克隆抗体和免疫抑制分子。

[0035] 优选的，所述免疫抑制分子优选包括PD‑1，PD‑L1、CTLA‑4，TIM‑3，LAG‑3，CD160，BTLA；进一步优选为PD‑1。

[0036] 优选的，所述肿瘤优选包括非小细胞肺癌、结肠癌和急性髓系白血病；进一步优选为结肠癌和急性髓系白血病。

[0037] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

[0038] 实施例1

[0039] 本实施例通过流式检测分析IGSF9蛋白在肿瘤细胞、肿瘤浸润免疫细胞中的高表达。

[0040] 将非小细胞肺癌及其毗邻正常组织制备成单细胞悬液，采用流式细胞仪检测IGSF9在非小细胞肺癌和毗邻正常组织的表达，如图1所示，结果表明：IGSF9在非小细胞肺癌组织中的表达水平显著高于正常组织。

[0041] 流式细胞仪检测IGSF9在各免疫细胞中的表达水平，如图2所示，结果表明：在正常健康人外周血各免疫细胞中没有检测到IGSF9的表达，但是非小细胞肺癌患者外周血中髓+ +系细胞、Treg细胞、B细胞以及CD3 /CD4T细胞中IGSF9的表达水平显著高于正常健康人；在+ +
肿瘤浸润的髓系细胞、Treg细胞、B细胞以及CD3/CD4T细胞中IGSF9的表达水平显著高于非小细胞肺癌患者外周血的表达水平。

[0042] 将MC38细胞接种到C57BL/6小鼠体内，检测IGSF9蛋白在正常C57BL/6小鼠的外周+ +血以及荷瘤小鼠的外周血和肿瘤组织中的B细胞、CD3/CD4 T细胞上的表达水平，如图3所示，结果表明：肿瘤浸润B细胞中IGSF9的水平显著高于外周血和接种前的外周血。

[0043] 上述结果表明IGSF9是可以被诱导的，肿瘤微环境中存在诱导IGSF9表达的因素。

[0044] 实施例2

[0045] 本实施例验证IGSF9蛋白对T细胞增殖抑制和促进肿瘤免疫逃逸的机制。

[0046] 制备带有His或者Fc标签的人IGSF9胞外区蛋白(IGSF9‑ECD‑His或者IGSF9‑ECD‑Fc)。向T细胞培养体系中分别加入1μg IGSF9‑ECD‑His或1μg IGSF9‑ECD‑Fc蛋白，如图4所+示，结果表明：1μg IGSF9‑ECD‑His或者IGSF9‑ECD‑Fc蛋白能够显著抑制CD3T细胞增殖。

[0047] 其中，人IGSF9胞外区蛋白的制备过程如下：在人IGSF9基因细胞外结构域(氨基酸序列如SEQ ID No.3所示)的编码序列末端连接His或者Fc标签后克隆到表达载体pcDNA3.1(‑)上，将该表达载体转染至HEK293F细胞(ThermoFisher,A14635)中，扩大培养。收集细胞上清，进行蛋白亲和层析纯化，得到IGSF9‑ECD‑His或者IGSF9‑ECD‑Fc蛋白。

[0048] 其中，T细胞培养体系为将活化的CD3+T细胞在含有10％FBS、100U/mL IL‑2和CD3/CD28 coatedbeads的1640培养基中培养的体系。

[0049] 分别将MC38‑control、MC38‑migsf9和MC38‑migsf9‑ECD细胞接种到C57BL/6‑+ +igsf9/ 小鼠(将购自上海南方模式生物科技股份有限公司的igsf9基因敲除鼠自交后获‑ ‑
得)和C57BL/6‑igsf9/小鼠(将购自上海南方模式生物科技股份有限公司的igsf9基因敲+
除鼠自交后获得)皮下，肿瘤大小、重量和肿瘤浸润CD3 T细胞水平检测结果如图5所示，结果表明：MC38‑migsf9和MC38‑migsf9‑ECD都显著促进肿瘤的生长，而且肿瘤组织浸润T细胞的水平显著降低。

[0050] 其中，MC38‑control、MC38‑migsf9和MC38‑migsf9‑ECD细胞的制备过程如下：

[0051] 将空载体、含有migsf9的载体、含有migsf9‑ECD的载体分别与逆转录病毒包装载体Plo整合后转染GP2‑293细胞，收集病毒。将收集得到的病毒感染MC38细胞。对于感染空载体的MC38细胞，用流式分选细胞仪将GFP阳性细胞进行分选，获得MC38‑control细胞。对于感染migsf9或migsf9‑ECD的MC38细胞，分析GFP和migsf9双阳性的细胞进行分选，获得MC38‑migsf9和MC38‑migsf9‑ECD细胞。

[0052] 向T细胞培养体系中加入不同浓度的IGSF9‑ECD‑His蛋白，如图6所示，结果发现IGSF9‑ECD‑His对T细胞的增殖抑制呈剂量依赖型，当剂量大于0.5μg时，开始出现明显的T细胞增殖抑制，表明IGSF9‑ECD‑His是剂量依赖式抑制T细胞。

[0053] 将8μg IGSF9‑ECD‑His、IGSF9‑ECD‑Fc和human IgG蛋白(购自北京义翘神州科技+有限公司，Cat#：13504)与激活的CD3T共孵育30min，用流式抗体anti‑His‑APC和anti‑Fc‑APC检测结合情况，如图7a和图7b所示，结果表明IGSF9‑ECD能够和T细胞相结合。如图7c所示的IP结果显示IGSF9‑ECD蛋白与T细胞膜上的未知蛋白相结合，其中条带2为单纯IGSF9‑ECD蛋白组，条带3为IGSF9‑ECD蛋白与T细胞结合组，条带4为human IgG蛋白与T细胞结合组，同时IP结果也显示IGSF9‑ECD‑Fc能够从T细胞膜蛋白中拉下明显的条带。

[0054] 将MC38‑control和MC38‑migsf9细胞接种到C57BL/6‑rag2‑/‑小鼠(购自上海南方模式生物科技股份有限公司)皮下，检测肿瘤大小和肿瘤重量，如图8所示，结果表明：缺失T细胞后，IGSF9不再促进肿瘤生长，进一步表明IGSF9抑制T细胞增殖，促进肿瘤细胞免疫逃避。

[0055] 以上结果表明IGSF9依赖其胞外结构域与T细胞结合抑制T细胞增殖。

[0056] 实施例3

[0057] 本实施例制备靶向人IGSF9的单克隆抗体。

[0058] 按照图9所示流程制备单克隆抗体，具体制备过程如下：

[0059] (1)采用IGSF9‑ECD‑His蛋白分别免疫5只BALB/c小鼠，每只免疫4次后，采集5只小鼠血清，分别为serum1、serum2、serum3、serum4、serum5。采用ELISA检测血清效价，结果如表1所示；用THP‑1‑igsf9‑WT细胞和THP‑1‑igsf9‑KO细胞通过流式检测小鼠血清与IGSF9的结合能力，结果如图10所示，发现5只小鼠血清都能结合THP‑1‑igsf9‑WT细胞，而不结合THP‑1‑igsf9‑KO细胞。

[0060] 其中，THP‑1‑igsf9‑KO细胞的构建过程为：根据sgRNA设计原则，应用https://zlab.bio/guide‑design‑resources设计了靶向IGSF9的3条特异sgRNA序列(序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6)。3条sgRNA序列如下：

[0061] SEQ ID NO.4：sgRNA1：CACGTAATCAGGGTCAATTC；

[0062] SEQ ID NO.5：sgRNA2：GAAGCCTGAGGTGGTATCGG；

[0063] SEQ ID NO.6：sgRNA3：GCTGGGGAGAGTGTGGTGCT；

[0064] 将上述序列克隆到pslq1651‑sgRNA‑GFP质粒中。将MD2G、psPAPX2和含有sgRNA的pslq1651‑sgRNA‑GFP质粒转染293T细胞，收集病毒。将收集得到的病毒感染THP1‑Cas9细+ ‑胞，采用1ug/ml的Dox诱导7天后，流式分选细胞仪分选GFP /IGSF9的细胞，命名为THP1‑igsf9‑KO细胞。

[0065] 其中，THP‑1‑igsf9‑WT细胞的构建过程为：按照THP‑1‑igsf9‑KO细胞的构建过程，将不含sgRNA的空载体也包装成病毒，同时感染THP‑1‑cas9细胞作为对照，将该细胞命名为THP‑1‑igsf9‑WT细胞。

[0066] 其中，T细胞共培养过程如下：

[0067] 1)常规培养THP1细胞，离心，计数，用含有100U/ml IL2和10％FBS的RPMI 1640培4 4
养基重悬细胞，按照2.5×10细胞/孔计数(2.5×10细胞/孔)；

[0068] 2)将计数的THP‑1细胞用28Gy剂量的X‑ray进行辐照；

[0069] 3)将正常人外周血CD3+T细胞进行CFSE染色(1×106细胞加1μl CFSE)，室温静置4
3min，离心，用含有100U/ml IL2和10％FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞，按照5×10 细胞/孔计数；

[0070] 4)在U型96孔板中，分别设置阳性对照组、对照组和实验组1、2、3、4、5。其中，阳性6 + 6 +
对照组为按照1×10CD3T细胞加入25μl CD3/CD28 beads；对照组为按照1×10CD3T细胞
6 6 +
加入0.5×10THP‑1细胞和25μl CD3/CD28 beads；实验组1、2、3、4、5分别按照1×10CD3 T
6
细胞加入0.5×10THP‑1细胞、25μl CD3/CD28 beads和5μl小鼠血清。

[0071] 5)培养5天后拍照、离心收集细胞，应用anti‑human CD3‑APC和anti‑human CD8‑+PE的流式抗体染色，以CFSE的稀释倍数代表CD3T细胞增殖。

[0072] T细胞共培养结果如图11所示，可以看出：与阳性对照组相比，对照组中的CD3+T细+胞生长明显受到抑制，无明显的CD3 T细胞聚团生长，而在加入小鼠血清之后，血清能够显+ +
著阻断THP‑1对CD3T细胞的增殖，CD3T细胞聚团、生长较明显。

[0073] 结合检测结果以及小鼠状态，最终选择2号小鼠。

[0074] 表1 ELISA血清效价检测结果

[0075]

[0076]

[0077] (2)分离2号小鼠脾脏细胞，与多发性骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，从67株ELISA检测阳性的融合细胞中，鉴定出7株可以用流式细胞仪检测的融合细胞，结果如图12所示，分+别为2H11、5C3、2H5、2A3、8D9、6C12、6G10。将这7株融合细胞分别与CD3 T细胞、IGSF9‑ECD共培养，培养结果如图13所示，可以看出，这7株融合细胞的上清都能阻断IGSF9‑ECD对T细胞的增殖抑制。

[0078] 选择5C3细胞进行亚克隆，得到6株单克隆细胞，分别为5C3‑1A4、5C3‑1B2、5C3‑+1C12、5C3‑2B2、5C3‑2B8、5C3‑2D12。将这6株单克隆细胞分别与CD3T细胞、IGSF9‑ECD共培养，培养结果如图14所示，可以看出，5C3‑1A4对阻断IGSF9‑ECD对T细胞的增殖抑制的效果+
最好。用5‑(6)‑羧基荧光素二乙酸酯(CFSE)对CD3T细胞进行染色，CFSE的稀释倍数代表细+
胞增殖，结果如图15所示，可以看出，5C3‑1A4组的CD3T细胞增殖效果最好。

[0079] 综上所述，5C3‑1A4是阻断型效果最好的单克隆细胞，对该细胞进行测序，获得靶向IGSF9的抗体序列，该抗体序列如下：

[0080] 重链的全长氨基酸序列(SEQ ID NO.1)：

[0081] EVQLLETGGGLVQPGGSRGLSCEGSGFSFSGFWMSWVRQTPGKTLEWIGNIKSDGSAINYAPSIKDRFTIFRDNDKSTLYLQMSNVRSEDTATYFCMRSNYGHWYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSLGK

[0082] 轻链的全长氨基酸序列(SEQ ID NO.2)：

[0083] DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNFLNWYQQKPNGTVKLLIYYTSSLYSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKFPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

[0084] 实施例4

[0085] 本实施例验证实施例3制备得到的靶向人IGSF9的单克隆抗体对IGSF9介导的T细胞增殖抑制作用。

[0086] 将实施例3制备得到的靶向人IGSF9的单克隆抗体或IgG加入CD3+T细胞和THP‑1细胞共培养中，如图16a所示，结果表明：靶向人IGSF9的单克隆抗体显著恢复了T细胞增殖抑制。

[0087] 通过ELISA检测细胞上清中TNF‑α和IFN‑γ水平，如图16b和图16c所示，结果表明：靶向人IGSF9的单克隆抗体显著增加了TNF‑α和IFN‑γ水平。

[0088] 以上结果表明：实施例3制备得到的靶向人IGSF9的单克隆抗体能够阻断IGSF9和T细胞表面未知蛋白结合进而恢复T细胞活性。

[0089] 实施例5

[0090] 本实施例验证靶向人IGSF9的单克隆抗体对肿瘤的抑制效果，具体过程如下：

[0091] 取生长状态相同的40只C57BL/6小鼠，平均随机分为4组，分别为对照抗体组(mIgG)、IGSF9抗体组(实施例3制备的靶向人IGSF9的单克隆抗体)、PD‑1抗体组(anti‑PD‑1)以及IGSF9抗体和PD‑1抗体联用组。

[0092] 从NCBI调取人IGSF9基因的CDS序列(NM_001135050.2)，设计引物将该序列克隆到pSLenti‑EF1a‑EGFP‑CMV‑MCS慢病毒载体上，载体信息为pSLenti‑EF1a‑EGFP‑CMV‑IGSF9(1‑20aa)‑HA‑IGSF9(21‑1179aa)，测序验证其正确性。应用293T细胞包装病毒颗粒、感染小+ +鼠MC38细胞。通过流式细胞仪进行筛选GFP /IGSF9的MC38细胞，命名为MC38‑higsf9。将MC38‑higsf9细胞接种到C57BL/6小鼠皮下，5天后分别注射mIgG、实施例3制备的靶向人IGSF9的单克隆抗体、anti‑PD‑1以及实施例3制备的靶向人IGSF9的单克隆抗体和anti‑PD‑
1联用，其中IGSF9抗体和PD‑1抗体联用组的注射方式为：注射anti‑PD‑1 1天后再注射实施例3制备的靶向人IGSF9的单克隆抗体，实施例3制备的靶向人IGSF9的单克隆抗体和anti‑PD‑1的比例为1：1。每只小鼠注射量为200μg，每3天注射一次，注射5次后，改为每7天注射一次，再注射2次。注射开始时量取肿瘤大小，之后每3天量取一次肿瘤大小。32天后，对照抗体
3
组处理的小鼠皮下肿瘤体积大于2cm，麻醉状态下处死4组小鼠，取出肿瘤，比较肿瘤大小，如图17a所示；根据试验期间的肿瘤大小绘制肿瘤生长曲线，如图17b所示。

[0093] 从图17a可以看出，IGSF9抗体组、PD‑1抗体组和IGSF9抗体和PD‑1抗体联用组的小鼠肿瘤大小较对照抗体组小鼠肿瘤明显减小，其中IGSF9抗体和PD‑1抗体联用组的小鼠肿瘤最小，且所有小鼠的肿瘤都受到了明显的抑制，个体间肿瘤大小无显著差异。从图17b可以看出，IGSF9抗体组、PD‑1抗体组以及IGSF9抗体和PD‑1抗体联用组的小鼠肿瘤生长明显受到抑制，其中将IGSF9抗体和PD‑1抗体联用，肿瘤生长速度最慢，表明IGSF9抗体和PD‑1抗体协同效应明显，能够显著抑制肿瘤的生长速度。

[0094] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。