本发明属于分子标记技术领域，公开了一种水稻萌发耐淹性QTL位点、与其紧密连锁的分子标记及应用。本发明以立糯852为母本、籼稻品种IR42为父本进行杂交，以杂交Fl代连续自交、回交后得到的群体为材料，对水稻萌发耐淹性进行统计和分析，同时根据初定位的结果进行进一步的精细定位，在9号染色体上发现一个LOD值为3.03主效QTL，遗传距离为2.47～5.81cM，物理距离为15764145～16272145bp。上述调控水稻萌发耐淹的主效QTL可应用于水稻直播耐淹品种选育，通过开发与主效QTL紧密连锁的分子标记，检测水稻品种或品系中萌发耐淹相关QTL，可加快选育水稻耐淹品种的进程。
1.与水稻萌发耐淹性QTL位点紧密连锁的分子标记在鉴定水稻萌发耐淹性状表型中的应用，其特征在于，所述QTL位点位于水稻第9号染色体上，遗传距离为2.47～5.81cM，物理距离为15764145～16272145bp，以日本晴作为参考基因组；所述分子标记为ID3和/或R24421；所述ID3能够通过如SEQ ID NO.1和2所示的引物对扩增得到；所述R24421能够通过如SEQ ID NO.3和4所示的引物对扩增得到；
如果采用所述ID3扩增出161bp的扩增产物，或采用所述R24421扩增出86bp的扩增产物，则待测水稻为不耐淹水稻；如果采用所述ID3扩增出172bp的扩增产物，或采用所述R24421扩增出93bp的扩增产物，则待测水稻为耐淹水稻；若条带为杂合带型则待测水稻介于萌发耐淹与不耐淹之间。
2.与水稻萌发耐淹性QTL位点紧密连锁的分子标记在水稻耐淹种质资源鉴定、水稻耐淹种质资源改良或萌发耐淹型水稻育种中的应用，其特征在于，所述QTL位点位于水稻第9号染色体上，遗传距离为2.47～5.81cM，物理距离为15764145～16272145bp，以日本晴作为参考基因组；所述分子标记为ID3和/或R24421；所述ID3能够通过如SEQ ID NO.1和2所示的引物对扩增得到；所述R24421能够通过如SEQ ID NO.3和4所示的引物对扩增得到；
如果采用所述ID3扩增出161bp的扩增产物，或采用所述R24421扩增出86bp的扩增产物，则待测水稻为不耐淹水稻；如果采用所述ID3扩增出172bp的扩增产物，或采用所述R24421扩增出93bp的扩增产物，则待测水稻为耐淹水稻；若条带为杂合带型则待测水稻介于萌发耐淹与不耐淹之间。
3.与水稻萌发耐淹性QTL位点紧密连锁的分子标记在筛选或创制水稻萌发耐淹性状不同的水稻中的应用，其特征在于，所述QTL位点位于水稻第9号染色体上，遗传距离为2.47～
5.81cM，物理距离为15764145～16272145bp，以日本晴作为参考基因组；所述分子标记为ID3和/或R24421；所述ID3能够通过如SEQ ID NO.1和2所示的引物对扩增得到；所述R24421能够通过如SEQ ID NO.3和4所示的引物对扩增得到；
如果采用所述ID3扩增出161bp的扩增产物，或采用所述R24421扩增出86bp的扩增产物，则待测水稻为不耐淹水稻；如果采用所述ID3扩增出172bp的扩增产物，或采用所述R24421扩增出93bp的扩增产物，则待测水稻为耐淹水稻；若条带为杂合带型则待测水稻介于萌发耐淹与不耐淹之间。
4.与水稻萌发耐淹性QTL位点紧密连锁的分子标记在水稻萌发耐淹性状基因分型中的应用，其特征在于，所述QTL位点位于水稻第9号染色体上，遗传距离为2.47～5.81cM，物理距离为15764145～16272145bp，以日本晴作为参考基因组；所述分子标记为ID3和/或R24421；所述ID3能够通过如SEQ ID NO.1和2所示的引物对扩增得到；所述R24421能够通过如SEQ ID NO.3和4所示的引物对扩增得到；
如果采用所述ID3扩增出161bp的扩增产物，或采用所述R24421扩增出86bp的扩增产物，则待测水稻为不耐淹水稻；如果采用所述ID3扩增出172bp的扩增产物，或采用所述R24421扩增出93bp的扩增产物，则待测水稻为耐淹水稻；若条带为杂合带型则待测水稻介于萌发耐淹与不耐淹之间。
5.一种水稻萌发耐淹性表型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(2)分别根据分子标记对所述基因组DNA进行PCR扩增；
所述分子标记为与水稻萌发耐淹性QTL位点紧密连锁的分子标记；
所述QTL位点位于水稻第9号染色体上，遗传距离为2.47～5.81cM，物理距离为
15764145～16272145bp，以日本晴作为参考基因组；所述分子标记为ID3和/或R24421；所述ID3能够通过如SEQ ID NO.1和2所示的引物对扩增得到；所述R24421能够通过如SEQ ID NO.3和4所示的引物对扩增得到；
(3)如果采用所述ID3扩增出161bp的扩增产物，或采用所述R24421扩增出86bp的扩增产物，则所述待测水稻为不耐淹水稻；如果采用所述ID3扩增出172bp的扩增产物，或采用所述R24421扩增出93bp的扩增产物，则所述待测水稻为耐淹水稻；若条带为杂合带型则所述待测水稻介于萌发耐淹与不耐淹之间。
6.一种萌发耐淹型水稻育种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(2)分别根据分子标记对所述基因组DNA进行PCR扩增；
所述分子标记为与水稻萌发耐淹性QTL位点紧密连锁的分子标记；
所述QTL位点位于水稻第9号染色体上，遗传距离为2.47～5.81cM，物理距离为
15764145～16272145bp，以日本晴作为参考基因组；所述分子标记为ID3和/或R24421；所述ID3能够通过如SEQ ID NO.1和2所示的引物对扩增得到；所述R24421能够通过如SEQ ID NO.3和4所示的引物对扩增得到；
(3)如果采用所述ID3扩增出161bp的扩增产物，或采用所述R24421扩增出86bp的扩增产物，则所述待测水稻为不耐淹水稻；如果采用所述ID3扩增出172bp的扩增产物，或采用所述R24421扩增出93bp的扩增产物，则所述待测水稻为耐淹水稻；若条带为杂合带型则所述待测水稻介于萌发耐淹与不耐淹之间；将所述耐淹水稻应用于水稻淹水直播育种。
一种水稻萌发耐淹性QTL位点、与其紧密连锁的分子标记及
应用
技术领域
[0001] 本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及一种水稻萌发耐淹性QTL位点、与其紧密连锁的分子标记及应用。
背景技术
[0002] 传统移栽种植模式在长时间内对粮食增产、农民增收、农业发展起到了重要作用。但随着城镇化的推进，农村劳动力大幅减少，而插秧对劳动力需求大、依赖高，严重阻碍了传统移栽模式的发展。水稻直播由于具有用水量少、淹水时间短、用水效率高、便于机械化操作等优点，因此已成为一种高效、经济、节约的轻简栽培模式。然而，出苗率低是阻碍水稻直播的关键问题。水稻直播过程中由于田面不平、坑洼积水、种子淹水等，致使有氧呼吸被抑制、极易烂芽烂根烂苗，导致直播稻缺苗严重，产量下降。解决缺苗问题是促进直播发展的关键环节，而选育萌发期耐淹的水稻品种被证明是最有效的措施。
[0003] 影响水稻萌发耐淹性的分子机制在各研究报道中虽有所不同，但越来越多的研究表明，水稻萌发耐淹性是一个多基因参与的、涉及多条信号途径的复杂过程，分子标记辅助育种技术可有效解决水稻萌发耐淹性相关基因认识不全面的问题。目前，研究人员对于水稻萌发耐淹性分子标记的研究仍较为有限。因此，需进一步深入挖掘与分析水稻萌发耐淹相关分子标记，为筛选与鉴定适宜淹水直播的水稻耐淹品种提供新的选择。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种水稻萌发耐淹性QTL位点、与其紧密连锁的分子标记及应用。
[0005] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
[0006] 第一方面，本发明提供了一种水稻萌发耐淹性QTL位点，所述QTL位点位于水稻第9号染色体上，遗传距离为2.47～5.81cM，物理距离为15764145～16272145bp。
[0007] 本发明以立糯852为母本、籼稻品种IR42为父本进行杂交，以杂交Fl代连续自交、回交后得到的群体为材料，对水稻萌发耐淹性进行统计和分析，同时根据初定位的结果进行进一步的精细定位，在9号染色体上发现一个LOD值为3.03主效QTL，遗传距离为2.47～5.81cM，物理距离为15764145～16272145bp。上述调控水稻萌发耐淹的主效QTL可应用于水稻品种选育，通过开发与主效QTL紧密连锁的分子标记，检测水稻品种或品系中萌发耐淹相关QTL，可加快选育水稻耐淹品种的进程。
[0008] 第二方面，本发明提供了一种与所述的QTL位点紧密连锁的分子标记，所述分子标记为ID3和/或R24421；
[0009] 所述ID3能够通过如SEQ ID NO.1和2所示的引物对扩增得到；
[0010] 所述R24421能够通过如SEQ ID NO.3和4所示的引物对扩增得到。
[0011] 第三方面，本发明提供了一种用于扩增所述的分子标记的引物，所述引物为SEQ ID NO.1和2和/或SEQ ID NO.3和4所示的序列。
[0012] 第四方面，本发明提供了一种含有所述的引物的试剂或试剂盒。
[0013] 第五方面，本发明将所述水稻萌发耐淹性QTL位点、所述的分子标记、所述的引物或所述的试剂或试剂盒在鉴定水稻萌发耐淹性状表型中应用。
[0014] 第六方面，本发明将所述水稻萌发耐淹性QTL位点、所述的分子标记、所述的引物或所述的试剂或试剂盒在水稻耐淹种质资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中应用。
[0015] 第七方面，本发明将所述水稻萌发耐淹性QTL位点、所述的分子标记、所述的引物或所述的试剂或试剂盒在筛选或创制水稻萌发耐淹性状不同的水稻中应用。
[0016] 第八方面，本发明将所述水稻萌发耐淹性QTL位点、所述的分子标记、所述的引物或所述的试剂或试剂盒在水稻萌发耐淹性状基因分型中应用。
[0017] 第九方面，本发明提供了一种水稻萌发耐淹性表型的方法，包括以下步骤：
[0018] (1)提取待测水稻的基因组DNA；
[0019] (2)分别采用根据所述的分子标记对所述基因组DNA进行PCR扩增；
[0020] (3)如果采用所述ID3扩增出161bp的扩增产物，或采用所述R24421扩增出86bp的扩增产物，则所述待测水稻为不耐淹水稻，否则，所述待测水稻为耐淹水稻；若条带为杂合带型则所述待测水稻介于萌发耐淹与不耐淹之间。
[0021] 第十方面，本发明提供了一种萌发耐淹型水稻育种的方法，包括以下步骤：
[0022] (1)提取待测水稻的基因组DNA；
[0023] (2)分别采用根据所述的分子标记对所述基因组DNA进行PCR扩增；
[0024] (3)如果采用所述ID3扩增出161bp的扩增产物，或采用所述R24421扩增出83bp的扩增产物，则所述待测水稻为不耐淹水稻，否则，所述待测水稻为耐淹水稻，将所述耐淹水稻应用于水稻淹水直播育种。
[0025] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0026] 本发明以立糯852为母本、籼稻品种IR42为父本进行杂交，以杂交Fl代连续自交、回交后得到的群体为材料，对水稻萌发耐淹性进行统计和分析，同时根据初定位的结果进行进一步的精细定位，在9号染色体上发现一个LOD值为3.03主效QTL，遗传距离为2.47～5.81cM，物理距离为15764145～16272145bp。本发明通过构建遗传连锁图谱和QTL分析，找到与萌发耐淹相关主效QTL紧密连锁的分子标记，利用这些分子标记对水稻后代进行筛选，可以节约成本，提高育种效率。
附图说明
[0027] 图1为欧氏距离(ED)关联值在水稻染色体上的分布；
[0028] 图2为qGEF9在BC2F2中的效应分析；
[0029] 图3为分子标记ID3和R24421在亲本、F1和BC2F2中的扩增电泳图；1为立糯852，2为IR42，3为F1代材料，4为BC2F2群体中偏耐淹株系。
具体实施方式
[0030] 为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0031] 实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032] 实施例1：水稻萌发耐淹性基因的初定位
[0033] 以水稻品种立糯852为母本，籼稻品种IR42为父本，以杂交F1代自交所获得的F2代群体为材料，构建耐淹和不耐淹基因池，结合两亲本进行BSA测序。
[0034] 萌发耐淹性统计的方法为：对亲本、F2:3和BC2F2:3群体材料进行自然干燥，经55℃烘干5天打破生物休眠后，选用饱满的水稻种子约30粒，经1％次氯酸钠进行表面消毒灭菌。灭菌后的种子放置于种子发芽袋中，并适当固定于培养箱中，缓慢加入10cm深的蒸馏水进行密封淹水处理，30℃暗发芽10天。以胚芽鞘生长的长度作为芽期耐淹性指标，测量所有种子的胚芽鞘长度。
[0035] 以日本晴作为参考基因组(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。针对双亲单核苷酸多态性(SNP)进行过滤，分析统计双亲差异SNP共1,652,869个，分别检测耐淹池与不耐淹池的SNP分布，采用差减法进行全基因组滑窗分析，找到1个连锁区间(如图1所示)，物理位置是在9号染色体14,450,000～17,180,000之间2.73Mb范围内，命名为候选区段qGEF9。
[0036] 实施例2：qGEF9的精细定位
[0037] 基于初定位的结果，在第9染色体目标区间继续进行标记加密，对水稻萌发耐淹性进行数量性状座位(QTL)区间作图，通过IciMapping4.2软件分析第9染色体的标记和数量性状表型值的关系，将QTL定位到连锁群的相应位置，并估计其遗传效应。若检测到LOD>2.5的分子标记，则认为LOD值最高处对应的2个标记间存在1个QTL，具体如下：
[0038] 以水稻品种立糯852为母本，籼稻品种IR42为父本，采用回交法构建BC2F2群体。为了筛选到更小区间，对BC2F2群体进行局部QTL分析，在第9染色体目标区间进行标记的加密，对群体的表型以及标记基因型进行局部连锁分析。如图2所示，分析结果发现qGEF9位于ID3与R24421之间，遗传距离为2.47～5.81cM，该QTL的LOD值为3.03，可解释25.05％的表型变异率。这些结果显示，qGEF9能够极显著地影响水稻萌发耐淹性。
[0039] 实施例3：分子标记辅助选择
[0040] 在QTL位点qGEF9上下游分别设计分子标记ID3与R24421，标记序列如下：
[0041] ID3：
[0042] 正向引物：GAAAAGAACGGGTGTAAGAC；
[0043] 反向引物：AGTTGTGTGCGTATGAAAGG。
[0044] R24421：
[0045] 正向引物：ATTTAACCGCGTTTGGTGCAATGG；
[0046] 反向引物：GCGGGCAACCGGAGATTATGG。
[0047] 取亲本立糯852、IR42及其Fl代和BC2F2群体的水稻叶片，提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用上述分子标记对其进行PCR检测。PCR扩增体系为10μL，含10×Buffer 1μL、d NTPs(10mM)0.2μL、Taq DNA聚合酶(2U/μL)0.3μL、引物(2μM)2μL、模板DNA(50ng/μl)1μL、ddH2O 5.5μL。PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性40s，59℃退火40s，72℃延伸40s，扩增35个循环，最后72℃终延5min。PCR扩增后用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
[0048] 部分结果见图3。对电泳检测条带带型进行分析，其中，条带大小趋向于亲本立糯852，ID3引物扩增产物大小为172bp，R24421引物扩增产物大小为93bp，则说明该水稻株系萌发耐淹，若条带大小趋向IR42或R24421，ID3引物扩增产物大小为161bp，R24421引物扩增产物大小为93bp，则说明不耐淹，若条带为杂合带型则该株系介于萌发耐淹与不耐淹之间，将受试株系水稻耐淹性与通过带型分析预测的结果进行比对，显示预测结果与实际统计结果相吻合。
[0049] 综上所述，以立糯852为母本、籼稻品种IR42为父本进行杂交，以杂交Fl代连续自交、回交后得到的群体为材料，对水稻萌发耐淹性进行统计和分析，同时根据初定位的结果进行进一步的精细定位，在9号染色体上发现一个LOD值为3.03主效QTL，遗传距离为2.47～5.81cM，物理距离为15764145～16272145bp。本发明定位到新的调控水稻萌发耐淹的主效QTL qGEF9，应用该QTL位点获得与其紧密连锁的2对分子标记，利用该分子标记可预测水稻材料的萌发耐淹性，加快选育水稻耐淹品种的进程。利用该QTL及其分子标记选育适宜淹水直播的水稻耐淹品种，可提高筛选效率，促进水稻增产增收。
[0050] 最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
