厚朴酚单体化合物及其在防治肠道辐射损伤中的应用

摘要

本发明公开了厚朴酚单体化合物及其在防治放疗后肠道辐射损伤中的应用。目前针对腹部放疗后引发的小肠部位特异性炎症及由此导致的功能障碍尚缺乏理论认知和临床指导，相关药物的研发十分急迫。本发明首次发现和证实了厚朴酚能够有效地对辐照引起的小肠类器官损伤进行治疗，提高辐照小鼠的存活率，改善小肠肠道结构，促进肠道上皮组织辐射损伤后的修复，为生物体的肠道辐射损伤提供了新的治疗方案。本发明在药物和临床等多层面均具有重要的理论和应用价值。

权利要求

1.厚朴酚单体化合物的用途，其特征在于：用于制备预防和/或治疗放射性肠炎的药物。

2.根据权利要求1所述的厚朴酚单体化合物的用途，其特征在于：用于制备预防和/或治疗放射性小肠肠炎的药物。

3.根据权利要求2所述的厚朴酚单体化合物的用途，其特征在于：所述放射性肠炎限定为恶性肿瘤经放射治疗引起的肠道并发炎症反应。

4.根据权利要求2所述的厚朴酚单体化合物的用途，其特征在于：所述放射性肠炎限定盆腔恶性肿瘤和/或腹腔恶性肿瘤和/或腹膜后恶性肿瘤经放射治疗引起的并发炎症反应。

5.根据权利要求2所述的厚朴酚单体化合物的用途，其特征在于：所述放射性肠炎限定盆腔恶性肿瘤和/或腹腔恶性肿瘤和/或腹膜后恶性肿瘤经放射治疗引起的以小肠损伤为主的并发炎症反应。

说明书

厚朴酚单体化合物及其在防治肠道辐射损伤中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及药物技术领域，尤其是一种用于防治恶性肿瘤放疗中导致的小肠辐射损伤中的药物。

背景技术

[0002] 放射性肠炎是指针对盆腔、腹腔、腹膜等位置的恶性肿瘤进行放射治疗而引起的肠道炎症性病变。它可以发生在肠道的任何部位。根据累及范围的不同，可分为放射性直肠、结肠、小肠炎。

[0003] 放射性肠炎的症状分为一般以前期症状和后期症状进行区分。前期主要表现为腹痛、腹泻、便次增多、脓血便和里急后重。严重时，还可能会出现水电解质紊乱和循环衰竭。后期症状一般在放疗3个月以后出现，如放射性小肠炎以吸收不良、慢性腹泻为主要表现，可出现慢性营养不良；如若肠道出现狭窄，则可能间断出现肠梗阻症状；另外，后期的放射性结肠、直肠炎主要表现为腹泻、腹痛、便血、黏液便及里急后重，严重的患者还可能出现瘘道、腹腔或盆腔脓肿及腹膜炎等。

[0004] 对于放射性肠炎的病理病因研究，目前具体机制尚不完全清楚。一般认为是多因素作用下导致的。例如，射线是通过产生电离辐射、破坏肿瘤细胞的DNA起到治疗作用的，而肠道黏膜细胞更新较快，DNA合成也比较旺盛，因此在放射线照射范围内的肠道细胞会受到较大影响。特别是作为肠道细胞更新主力军的肠道黏膜干细胞，治疗中受到抑制，影响了黏膜的更新，导致肠道黏膜发生病变。再如，射线会影响肠道黏膜下小动脉的血管内皮细胞，这些细胞对放射线非常敏感，一旦出现损伤，可能会形成闭塞性血管炎，也就相当于阻断了供应肠道细胞营养和氧气的途径，局部就会出现糜烂、溃疡。再如，损伤后的肠壁组织会产生多种生长因子、成纤维细胞，又会导致肠道纤维化、肠道狭窄，甚至出现穿孔等病变。这几种因素互相影响，甚至可能形成恶性循环，造成病变迁延不愈、愈加严重。

[0005] 对于放射性肠炎的治疗方面，目前，肠黏膜屏障损伤的危害已被临床医师广泛认同，修复黏膜屏障、提高黏膜愈合程度、降低黏膜通透性、改善肠道炎症，对放射性肠炎的预防、治疗具有重要意义。临床上已研发了多种肠道微生态制剂，对宫颈癌、肠癌、胃癌、白血病等患者的胃肠道损伤有治疗作用，可改善肠屏障系统障碍和肠道微生态失调引发的腹泻、便秘等不良反应，避免胃肠功能进一步发生紊乱。然而，放射性肠炎目前尚无药物预防及治疗的标准策略，主要治法有手术、药物等，但具备手术治疗机会的患者较少且手术创伤性大术后并发症多，而药物治疗种类繁多却疗效有限，因此临床上迫切需要切实有效的治疗手段。

[0006] 其中，针对小肠部位由于辐射损伤引起的肠道稳态紊乱及由此导致的功能障碍，这些方面的研究和治疗更是缺乏最一般的理论和临床认知和相关指导，是一个亟需突破的技术难题。

发明内容

[0007] 本发明要解决的技术问题是提供厚朴酚单体化合物在防治肠道辐射损伤中的应用。

[0008] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

[0009] 厚朴酚单体化合物的用途，用于制备预防和/或治疗肠炎的药物。

[0010] 作为本发明的一种优选技术方案，厚朴酚单体化合物的用途，用于制备预防和/或治疗放射性肠炎的药物。

[0011] 作为本发明的一种优选技术方案，厚朴酚单体化合物的用途，用于制备预防和/或治疗放射性小肠肠炎的药物。

[0012] 作为本发明的一种优选技术方案，厚朴酚单体化合物的用途，所述放射性肠炎限定为恶性肿瘤经放射治疗引起的肠道并发炎症反应。

[0013] 作为本发明的一种优选技术方案，厚朴酚单体化合物的用途，所述放射性肠炎限定盆腔恶性肿瘤和/或腹腔恶性肿瘤和/或腹膜后恶性肿瘤经放射治疗引起的并发炎症反应。

[0014] 作为本发明的一种优选技术方案，厚朴酚单体化合物的用途，所述放射性肠炎限定盆腔恶性肿瘤和/或腹腔恶性肿瘤和/或腹膜后恶性肿瘤经放射治疗引起的以小肠损伤为主的并发炎症反应。

[0015] 厚朴酚单体化合物的用途，用于制备靶向保护小肠绒毛和隐窝的药物。

[0016] 作为本发明的一种优选技术方案，厚朴酚单体化合物的用途，用于制备在遭受电离辐射前对小肠绒毛和隐窝进行靶向防护的药物。

[0017] 作为本发明的一种优选技术方案，厚朴酚单体化合物的用途，用于制备遭受电离辐射伤害后对小肠绒毛和隐窝进行靶向保护的药物。

[0018] 本发明的技术方案和技术内涵包含基于厚朴酚单体化合物的用途所制备的药物。

[0019] 采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明首次发现和证实了厚朴酚能够有效地对辐照引起的肠道类器官损伤进行治疗，提高辐照小鼠存活率，改善肠道结构，为生物体的肠道辐射损伤提供了新的治疗方案。

附图说明

[0020] 图1为不同浓度的MG对辐照后类器官生长发育的影响试验结果图。

[0021] 图2为厚朴酚在放射性肠道损伤中的保护作用试验结果图。

具体实施方式

[0022] 以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。其中，厚朴酚单体化合物具有如下化学结构式：

[0023]

[0024] 在下述实施例中，应当理解，在本申请说明书和所附权利要求书中使用的术语“和/或”是指相关联列出的项中的一个或多个的任何组合以及所有可能组合，并且包括这些组合。在本申请说明书和所附权利要求书的描述中，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。在本申请说明书中描述的参考“一个实施例”或“一些实施例”等意味着在本申请的一个或多个实施例中包括结合该实施例描述的特定特征、结构或特点。由此，在本说明书中的不同之处出现的语句“在一个实施例中”、“在一些实施例中”、“在其他一些实施例中”、“在另外一些实施例中”等不是必然都参考相同的实施例，而是意味着“一个或多个但不是所有的实施例”，除非是以其他方式另外特别强调。术语“包括”、“包含”、“具有”及它们的变形都意味着“包括但不限于”，除非是以其他方式另外特别强调。

[0025] 实施例1、肠道隐窝的分离和肠道类器官的培养

[0026] 在本实施例中，肠道隐窝的分离和肠道类器官的培养依照如下实验步骤进行操作：

[0027] (1)将小鼠脱臼处死后，无菌条件下取长度约8‑10cm的一段小肠，使用弯头镊子去除肠道外部的肠系膜、血管和脂肪。

[0028] (2)使用外科剪刀，将肠段纵向切开，肠腔朝上。用冷的DPBS洗涤肠道片段三次。

[0029] (3)用镊子夹住经过清洗的肠道一端，并悬在50mL离心管的管口上。从肠道底部开始，用剪刀将肠切成1‑2cm的小段。

[0030] (4)在离心管中加入预冷的30mL DPBS,剧烈震荡30s，弃上清,重复5次。会观察到液面上层呈现云雾状。

[0031] (5)离心管中加入30mL的1mM EDTA/DPBS溶液中。4℃，冰上放置消化30min，剧烈震荡30s，弃上清。

[0032] (6)离心管中加入30mL的5mM EDTA/DPBS溶液中，4℃，冰上放置消化20min。

[0033] (7)弃去消化液，加入遇冷的DPBS，轻轻地上下摇晃四次，去除EDTA。

[0034] (8)加入30mL预冷的含有1％血清的DPBS,涡旋40s。

[0035] (9)70μm滤网过滤涡旋液，将滤液收集到50mL离心管中，记为馏分1。

[0036] (10)重复步骤8‑9一到两次，得到馏分2、3。

[0037] (11)在4℃下100g离心3min，吸出上清液，将沉淀保留在管中。

[0038] (12)将沉淀重悬于预冷的DMEM/F‑12。转移到15mL离心管中，定容。

[0039] (13)预先润湿100μL的移液器枪头，从中取出100μL置于计数板上，计数100μL样本中的隐窝数量。将计算出的隐窝数乘以10，得到每毫升中的隐窝数。

[0040] (14)在4℃下以50×g离心2min，按照1:1的比例(培养基：基质胶)加入已提前融化好的基质胶。混匀后，50μL/孔接种到48孔板中，放入37℃培养箱，约10min后基质胶凝固，加入类器官培养基200μL,37℃5％ CO2培养。

[0041] 实施例2、不同浓度的MG对辐照后类器官生长发育的影响

[0042] 本实施例主要研究不同浓度的MG对辐照后类器官生长发育的影响，包括如下操作步骤。

[0043] 1.分离C57BL/6J小鼠隐窝，种板，随机分组，分为辐照Vehicle组和厚朴酚给药组(MG)，每组不少于六个孔

[0044] 2.建立辐照模型：将接种到孔板的Vehicle组和MG组类器官放到X射线生物辐照仪中，总剂量6Gy，剂量为0.93Gy/min。

[0045] 3.辐照(IR)后24h，用100nM、500nM、1μM、5μM、10μM不同浓度的MG处理给药组，同等体积DMSO处理Vehicle组。

[0046] 4.在给药后的第5天记录类器官存活率，第7天记录类器官的出芽数，平均表面积，面积增长率。

[0047] 实验结果参照附图1。图1‑A显示了正常肠道类器官的生长发育过程。第0天，隐窝呈现短棒状结构，在第一天会变成实心的圆球，第三天到第五天，类器官会进一步出芽分化，形成“花瓣状“的3D结构，第七天能看到中间的腔室内聚集很多的死细胞。图1‑B显示了厚朴酚能促进辐照后肠道类器官的存活率，1μM为最适MG处理浓度。具体的，不同浓度MG处理辐照后肠道类器官，统计第5天类器官的存活率。观察到辐照Vehicle组类器官生长受抑制，内腔死细胞逐渐积聚；MG给药组在类器官辐照后逐渐出芽。其中：Vehicle组类器官存活率19.64％±0.69％；100nM MG组类器官存活率46.53％±1.75％，P<0.001；500nM MG组类器官存活率58.04％±0.58％，P<0.001；1μM MG组类器官存活率68.33±3.34％，P<0.001；5μM MG组类器官存活率55.43％±4.19％，P<0.001；10μM MG类器官存活率18.03％±2.34％，无差异；结果显示1μM为最适MG处理浓度。图1‑C显示了对照组和1μM浓度厚朴酚处理辐照类器官的典型示意图；类器官的平均出芽数(左)、平均表面积(中)、面积扩增率(右)[0048] Vehicle组类器官平均出芽数1.73±0.05个,1μM MG组类器官平均出芽数4.53±
3 2
0.18个，P<0.001；Vehicle组类器官平均表面积(2.49±0.25)ⅹ10μm ,1μM MG组类器官平
3 2
均表面积为(4.27±0.11)ⅹ10μm ，P<0.001；Vehicle组类器官面积扩增倍数为0.57±0.05倍,1μM MG组类器官面积扩增倍数为1.60±0.03倍，P<0.001。

[0049] 实施例3、厚朴酚在放射性肠道损伤中的保护作用

[0050] 本实施例研究和证实了厚朴酚在放射性肠道损伤中的保护作用。包括如下操作步骤。

[0051] (1)小鼠腹部辐照模型的构建。C57BL/6J雄性小鼠30只，体重20‑22g,随机分为WT正常组、辐照(IR)组和厚朴酚(MG)给药组，每组10只。小鼠腹腔注射180‑200μL三溴乙醇进行麻醉，用定制的铅板遮蔽上胸、头颈部以及上下肢，仅仅露出肠道2.5cm面积，使用x射线源对小鼠进行14Gy腹部照射，剂量为0.93Gy/min。

[0052] (2)致死辐照剂量下小鼠存活率实验。小鼠经过腹部辐照后，MG处理组：每天每只小鼠腹腔注射100μL厚朴酚玉米油溶液(给药量为100mg/kg)，连续给药5天；IR组：每天每只小鼠腹腔注射100μL玉米油，连续给药5天。每天对小鼠生存情况和状态进行观察，持续14天，计算小鼠存活率。小鼠存活率＝(每组小鼠存活数/每组小鼠总数)ⅹ100％

[0053] (3)小肠长度统计。辐照后第四天，安乐处死WT正常组、辐照(IR)组和厚朴酚(MG)给药组小鼠，解剖获取小肠，进行长度统计拍照。

[0054] (4)肠道组织冰冻切片的制作。包括如下步骤：1.固定：解剖获取小肠，预冷DPBS清洗干净后，剪好肠段，放入包埋盒中，浸泡在4％多聚甲醛中，过夜固定；2.脱水：30％蔗糖溶液过夜脱水；3.组织包埋：将脱水完成的肠组织放在OCT中制成冰冻组织块；4.将包埋好的组织块进行切片，具体操作如下：4‑(1)打开切片机预冷到‑20℃，将组织块固定好位置，4‑(2)使用刀片对组织块进行修正，切片厚度为5‑6μm；4‑(3)将切好的标本轻缓地用事先标记好各组序号的防脱载玻片贴片；4‑(4)片子收入切片盒中，放在4℃保存。

[0055] (5)肠道组织切片HE染色。包括如下步骤：1.将切好的片子进行DPBS浸润，洗去OCT；2.苏木素染色液染色5min,浸入DPBS中冲洗残留的染色液；3.伊红染色液染色30s，浸入DPBS中冲洗残留的染色液；4.酸性分化液处理10s,用DPBS清洗残留的分化液；5.蘸取一滴中性树胶于染色好的组织上，从一侧缓缓封片，尽量避免气泡的产生，镜检肠组织形态，小肠细胞核呈现蓝紫色；6.测定绒毛长度和隐窝深度。

[0056] 研究结果参见图2。图2‑A为小鼠腹部辐照和给药的示意图。第0天对小鼠进行14Gy腹部照射，MG处理组：每天每只小鼠腹腔注射100μL厚朴酚玉米油溶液(给药量为100mg/kg)，连续给药5天；IR组：每天每只小鼠腹腔注射100μL的玉米油，连续给药5天。图2‑B为辐照后小鼠生存曲线图。厚朴酚能够改善小鼠生存情况，提高小鼠存活率。MG给药照射组小鼠的生存率较照射组显著提高,P<0.01。图2‑C显示厚朴酚能够抵消辐照引起的肠道缩短。WT组小肠长度27±0.58cm,IR组小肠长度22.33±1.2cm，MG组小肠长度28±1.16cm，P<0.05。图2‑D显示厚朴酚能够改善辐照小鼠肠道结构。HE染色实验对小肠的形态学变化进行了观察。在14Gy照射后4天，小肠结构发生明显损伤，表现为小肠绒毛受损，隐窝数目减少。对小肠绒毛长度和隐窝数目进行统计，显示MG给药组小鼠的隐窝和绒毛长度较辐照组小鼠有明显增加。IR组绒毛长度200.18±5.94μm，隐窝长度51.81±0.97μm，MG组绒毛长度377.8±
3.85μm，隐窝长度92.16±1.47μm，P<0.001。

[0057] 综上实施例可见，本发明的研究药物是化合物单体，研究对象是辐射状态下的小肠类器官和小鼠。放射性肠炎是盆腔、腹腔、腹膜后恶性肿瘤经放射治疗引起的肠道并发症。可分别累及小肠、结肠和直肠，其中小肠最为敏感。本发明首次研究并实证了厚朴酚在小肠辐射损伤防护中的应用。本发明提供了厚朴酚在辐射引起的小肠疾病中的应用。本发明首次发现厚朴酚能够有效地对辐照引起的小肠类器官损伤进行治疗，同时提高了动物存活率，为生物体的肠道辐射损伤提供了新的治疗方案。本发明至少证实了厚朴酚作为单体化合物药物具有如下功效：提高辐照后肠道类器官的存活率；提高辐照小鼠存活率，改善小肠肠道结构，促进肠道上皮组织辐射损伤后的修复。

[0058] 以上所述实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围，均应包含在本发明的保护范围之内。