一种二氢欧山芹醇当归酸酯在制备治疗心肌缺血药物中的用途

摘要

本发明公开了一种二氢欧山芹醇当归酸酯在制备或治疗心肌缺血药物中的用途，本发明可以改善心肌缺血小鼠心功能，具有抗心肌缺血作用和提高缺氧损伤H9c2细胞活力，保护线粒体保护的作用，通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制细胞自噬和凋亡发挥抗心肌缺血作用。

权利要求

1.二氢欧山芹醇当归酸酯作为唯一活性成分在制备治疗心肌缺血药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药学上可接受的载体或赋形剂选自稀释剂、崩解剂、沉淀抑制剂、表面活性剂、助流剂、粘合剂、润滑剂、分散剂、助悬剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂和包衣材料中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述二氢欧山芹醇当归酸酯通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制细胞自噬和凋亡发挥抗心肌缺血作用。

说明书

一种二氢欧山芹醇当归酸酯在制备治疗心肌缺血药物中的

用途

技术领域

[0001] 本发明属于治疗心肌缺血药物技术领域，尤其是涉及一种二氢欧山芹醇当归酸酯在制备或治疗心肌缺血药物中的用途。

背景技术

[0002] 心血管疾病(CVD)死亡的人数占全球因疾病死亡人数的30％以上。多种因素可诱发冠状动脉狭窄、痉挛，引起心肌细胞的缺血和乏氧的状态，导致心肌缺血。心肌缺血与临床上心肌梗死、心绞痛、冠状动脉粥样硬化等疾病的发生发展有密切联系。现代医学研究发现心肌缺血发生机制较为复杂，与心肌能量代谢、细胞自噬、细胞凋亡、炎症因子和血管内皮细胞功能障碍等多个环节有关。因心肌细胞自噬与凋亡作为心肌缺血过程的关键环节，调控自噬和凋亡可能成为抗心肌缺血的重要治疗靶点。心肌缺血易引起心肌的细胞自噬与凋亡，降低细胞活力使得心肌细胞死亡和细胞外基质局部重塑，丢失的心肌细胞将由心脏成纤维细胞填充，加剧心肌重构，降低心功能。正常生理条件下，心肌细胞通过少量自噬将受损的蛋白及细胞器进行降解为细胞重新提供能量，维持细胞环境稳定。心肌缺血情况下，细胞因应激反应，普遍伴随着自噬异常的现象：自噬水平过低导致细胞内受损的蛋白或细胞器不能及时降解，形成堆积而对细胞产生损伤；而过度的自噬会增加细胞凋亡，导致非缺血区心肌细胞的丢失。因此，保持正常水平的自噬有利于能量重新利用，自噬水平过低或过高都可能对心肌细胞的生存造成威胁。细胞凋亡是通过启动内源性DNA内切酶活性而发生的一种程序性细胞死亡。凋亡启动后细胞体积缩小、细胞质凝缩，细胞核破裂，碎裂的细胞核及细胞碎片等被质膜小泡包裹着形成凋亡小体，凋亡小体被巨噬细胞等识别、吞噬和降解。研究表明心肌缺血损伤时伴随心肌细胞坏死与凋亡的发生。促凋亡蛋白Bax、Bcl‑2同源拮抗剂/杀伤剂(Bak)聚集到线粒体上，线粒体膜通透性增加，刺激Caspase级联反应，Caspase家族蛋白接收到凋亡信号后，激活下游效应型Caspase蛋白，通过效应分子特应性降解Parp等引起染色体凝聚，发生细胞凋亡。

[0003] 心肌缺血是由于冠状动脉血流灌注减少，导致心肌供氧不足、心脏难以维持正常生理功能的一种病理状态。心肌缺血的发生易引起心肌细胞自噬与凋亡进而导致心肌重塑，严重影响心脏功能。目前，中药及其活性成分通过抑制心肌细胞自噬和凋亡治疗心肌缺血的作用研究越来越受到人们关注。中药独活具有祛风除湿、通痹止痛的功效，现代医学研究表明其具有通行气血、调和经络的作用。

[0004] 二氢欧山芹醇当归酸酯(columbianadin,CBN)，又名二氢欧山芹素、哥伦比亚内酯，是一种呋喃香豆素类化合物，经药理实验证实其具有良好的抗炎、镇痛、抑制血小板聚集和抗脂质过氧化作用。CBN是从独活中分离出的一种呋喃香豆素类活性成分。现代药理研究表明，CBN具有抗炎活性、抑制血小板聚集、抑制组织胺释放、抑制癌细胞增值等作用。研究发现CBN可通过诱导癌细胞的凋亡和坏死病来抑制细胞增殖，CBN作用靶点可能与Caspase‑3、Bax、Bcl‑2、Bim和Bid有关。独活具有祛风除湿、通痹止痛的功效，现代医学研究表明其具有通行气血、调和经络的作用。课题组前期研究独活药效物质基础时，发现CBN具有抗动脉粥样硬化的作用，而其在缺氧条件下保护心肌细胞的作用以及抗心肌缺血方面未见报道及应用

发明内容

[0005] 本发明的目的是针对上述问题，提供一种二氢欧山芹醇当归酸酯在制备或治疗心肌缺血药物中的用途。

[0006] 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

[0007] 本发明包括.二氢欧山芹醇当归酸酯在制备或治疗心肌缺血药物中的用途。

[0008] 进一步地，包含二氢欧山芹醇当归酸酯的植物提取物在制备或治疗心肌缺血药物中的用途，其中，所述植物提取物选自独活提取物、当归提取物、紫花前胡提取物、竹叶防风提取物和花椒提取物中的至少一种。

[0009] .二氢欧山芹醇当归酸酯在制备抑制缺氧心肌细胞株分化的药物中的用途。

[0010] 一种药物组合物，其包含二氢欧山芹醇当归酸酯。

[0011] 进一步地，其中，所述二氢欧山芹醇当归酸酯是以单体的形式提供，或以包含其的植物提取物的形式提供。

[0012] 进一步地，所述植物提取物选自独活提取物、当归提取物、紫花前胡提取物、竹叶防风提取物和花椒提取物中的至少一种。

[0013] 进一步地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。

[0014] 进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂选自稀释剂、崩解剂、沉淀抑制剂、表面活性剂、助流剂、粘合剂、润滑剂、分散剂、助悬剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂和包衣材料中的至少一种。

[0015] 进一步地，所述的药物组合物在制备或治疗心肌缺血药物中的用途。

[0016] 进一步地，所述的药物组合物在调控PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制细胞自噬和凋亡发挥抗心肌缺血中的用途。

[0017] 综上所述：

[0018] 本发明提供一种二氢欧山芹醇当归酸酯在制备或治疗心肌缺血药物中的用途,可以改善心肌缺血小鼠心功能，具有抗心肌缺血作用以及提高缺氧损伤H9c2细胞活力，保护线粒体保护的作用，通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制细胞自噬和凋亡发挥抗心肌缺血作用。

附图说明

[0019] 图1为CBN对MI损伤小鼠心功能的影响对比图；

[0020] 图2为CBN对MI损伤小鼠的血清LDH含量的影响对比图；

[0021] 图3为CBN对MI损伤小鼠自噬相关基因表达的影响对比图；

[0022] 图4为4CBN对MI损伤小鼠自噬相关蛋白表达的影响对比图；

[0023] 图5为CBN对MI损伤小鼠凋亡相关基因表达的影响对比图；

[0024] 图6为CBN对正常和缺氧条件下H9c2的细胞活力的影响对比图；

[0025] 图7为CBN对缺氧条件下H9c2的ROS的影响对比图；

[0026] 图8为H9c2线粒体呼吸氧消耗对比图；

[0027] 图9为CBN对缺氧条件下H9c2线粒体呼吸耗氧量的影响对比图；

具体实施方式

[0028] 以下实施例仅处于说明性目的，而不是想要限制本发明的范围。

[0029] 在本实施例中，实验使用8周龄的雄性C57BL/6J小鼠，采用冠状动脉左前降支结扎术建立心肌缺血小鼠模型，术后第二天将心肌缺血小鼠随机分为模型组(model)，10mg/kg CBN组、20mg/kg CBN组和40mg/kg CBN组。假手术组(sham)只穿线，不接扎。连续灌胃给药28天后通过小动物超声仪检测各组小鼠心脏功能；采用ELISA法检测各组小鼠血清中乳酸脱氢酶(LDH)含量；以PI3K/AKT/mTOR信号通路介导的小鼠心肌组织自噬为切入点，采用quantitative Real‑time PCR(qRT‑PCR)和western blot(WB)法，检测自噬和凋亡相关蛋白的基因和蛋白表达水平。

[0030] 手术后第二天将造模小鼠随机分为model组，10mg/kg CBN组、20mg/kg CBN组、40mg/kg CBN组。Sham组小鼠只穿线，不接扎。分组后进行灌胃给药，即为给药第一天。Sham组与model组小鼠给予0.2％CMC‑Na溶液，10mg/kg CBN组小鼠给予1mg/mL CBN溶液，20mg/kg CBN组给予2mg/mL CBN溶液，40mg/kg CBN组小鼠给予4mg/mL CBN溶液。灌胃体积为
0.2ml/20g小鼠。

[0031] 对小鼠心脏超声,血清收集,心脏收集以及小鼠血清中LDH含量的检测，通过RNA提取和qRT‑PCR检测，对比检测两组小鼠基因和蛋白表达的影响。

[0032] 使用SPSS 25.0统计软件，计量资料以均数±标准差 表示，统计方法采用单因素方差分析(one‑way ANOVA)进行组间比较，当方差齐时选用LSD检验方法，当方差不齐时则选择Dunnett’s T3检验方法，P＜0.05或P＜0.01表示差异具有统计学意义。

[0033] 实验结果

[0034] CBN对MI小鼠心功能的影响

[0035] 小鼠心脏超声图像测量结果显示与sham组相比，model组小鼠EF％和FS％显著降低(P＜0.01，图1b‑c)，LVID,d和LVID,s显著升高(P＜0.01，图1d‑e)，提示model组小鼠心功能下降；与model组相比，10mg/kg CBN组小鼠EF％显著升高(P＜0.05，图1b)，20mg/kg和40mg/kg CBN组小鼠EF％显著升高(P＜0.01，图1b)；与model组相比，10mg/kg、20mg/kg和
40mg/kg CBN组小鼠FS％显著升高(P＜0.01，图1c)，LVID,d和LVID,s显著降低(P＜0.01，图
1d‑e)。结果提示CBN具有改善MI小鼠心功能的作用。

[0036] CBN对MI小鼠血清LDH含量的影响

[0037] 给药28天后，取血清，采用固相夹心酶联免疫定量法检测各组小鼠血清LDH含量。检测结果如图2显示，与sham组相比，model组小鼠血清中的LDH含量显著升高(P＜0.01)；与model组相比，10mg/kg和40mg/kg CBN组小鼠血清中的LDH含量显著降低(P＜0.05)，20mg/kg CBN组小鼠血清中的LDH含量显著降低(P＜0.01)。提示CBN具有降低MI小鼠血清中LDH含量的作用。

[0038] CBN对MI小鼠自噬相关基因和蛋白表达的影响

[0039] Beclin1促进自噬小泡的成核和从细胞质招募蛋白质，Atg5通过形成Atg12‑Atg5‑Atg16复合物参与自噬体膜的延伸。LC3‑Ⅰ泛素化为LC3‑Ⅱ的过程标志着自噬体的成熟，所以LC3‑Ⅱ是自噬体形成的标志。自噬体与溶酶体融合后，P62作为底物被降解。因此我们分别采用qRT‑PCR和WB检测LC3、Beclin1、Atg5和P62蛋白的基因和蛋白水平。

[0040] qRT‑PCR结果如图3所示，与sham组相比，model组小鼠心脏组织中LC3、Beclin1、Atg5基因表达显著升高(P＜0.01，图3a‑c)，P62基因表达显著降低(P＜0.01，图3d)；与model组相比，10mg/kg、20mg/kg和40mg/kg CBN组小鼠心脏组织中LC3、Beclin1、Atg5基因表达显著下降(P＜0.01，图3a‑c)、P62基因表达显著升高(P＜0.01，图3d)。

[0041] WB结果如图4所示，与sham组相比，model组小鼠心脏组织中LC3Ⅱ/Ⅰ比值显著升高(P＜0.05，图4b)，与model组相比，20mg/kg、40mg/kg CBN组LC3Ⅱ/Ⅰ比值显著降低(P＜0.05，图4b)。

[0042] 与sham组相比，model组小鼠心脏组织中Beclin1蛋白表达显著升高(P＜0.05，图4c)40mg/kg CBN组小鼠心脏组织中Beclin1蛋白含量显著下降(P＜0.05，图4c)。

[0043] 与sham组相比，model组小鼠心脏组织中Atg5蛋白含量显著升高(P＜0.05，图4d)；20mg/kg、40mg/kg CBN组小鼠心脏组织中Atg5蛋白含量显著下降(P＜0.05，图4d)。

[0044] 与sham组相比，model组小鼠心脏组织中P62蛋白含量显著降低(P＜0.05，图4e)40mg/kg CBN组小鼠心脏组织中P62蛋白水平显著升高(P＜0.05，图4e)。

[0045] CBN对MI小鼠凋亡相关基因和蛋白表达的影响

[0046] 应激信号被激活，Bax、Bak聚集到线粒体上，线粒体外膜形成孔道开放导致膜透性增加进而使线粒体膜电位(MMP)下降。缺氧情况下，大量ROS释放导致线粒体肿胀破裂，释放细胞色素C(Cyto c)。Cyto c可结合Caspase9激活Caspase3，Caspase3裂解活化为cleaved‑caspase3，诱导凋亡。活化形式的Caspase3是细胞凋亡的执行者，裂解底物Parp等蛋白，导致DNA崩解诱发细胞凋亡。Bcl‑2蛋白是重要的抗凋亡蛋白，可延长细胞寿命。多项发明用Bcl‑2/Bax的比值表示凋亡的程度。因此我们分别采用了qRT‑PCR和WB检测Bax、Bcl‑2、Caspase3和Parp蛋白的基因和蛋白水平。

[0047] qRT‑PCR结果如图5所示，与sham组相比，model组小鼠心脏组织中Bax基因表达显著升高(P＜0.01，图5a)；与model组相比，10mg/kg、20mg/kg和40mg/kg CBN组小鼠心脏组织中Bax基因表达显著下降(P＜0.01，图5a)。

[0048] 与sham组相比，model组小鼠心脏组织中Bcl‑2表达显著降低(P＜0.05，图5b)；与model组相比，20mg/kg和40mg/kg CBN组小鼠心脏组织中Bcl‑2基因表达有上升趋势但无显著差异(P＞0.05，图5b)。

[0049] 与sham组相比，model组小鼠心脏组织中Caspase3基因表达显著升高(P＜0.01，图5c)；与model组相比，20mg/kg CBN组小鼠心脏组织中Caspase3基因表达显著下降(P＜
0.01，图5c)，40mg/kg CBN组小鼠心脏组织中Caspase3基因表达显著下降(P＜0.05，图5c)。

[0050] 与sham组相比，model组小鼠心脏组织中Parp基因表达显著升高(P＜0.01，图5d)，与model组相比，10mg/kg CBN组小鼠心脏组织中Parp基因表达显著下降(P＜0.01，图5d)20mg/kg和40mg/kg CBN组小鼠心脏组织中Parp基因表达显著下降(P＜0.05，图5d)。

[0051] 在另一个实施例中，以H9c2为研究对象，将细胞分为对照组(control)和缺氧组，采用95％ N2和5％ CO2混合气体缺氧培养2h建立H9c2细胞缺氧模型，随后分为model组、0.1μmol/L CBN组、1μmol/L CBN组和10μmol/LCBN组，采用CCK8法检测CBN对缺氧H9c2细胞活力的影响；采用活ROS和JC‑1试剂盒检测CBN对缺氧细胞内ROS含量和线粒体膜电位的影响。使用Oxygraph‑2k仪器检测CBN对细胞氧消耗影响；利用LC3双荧光腺病毒转染H9c2，通过高内涵检测各组细胞中自噬流情况；结合使用自噬促进剂雷帕霉素(RAPA)和CBN，CCK‑8法验证自噬在CBN调控缺氧H9c2细胞活力过程中的作用；并采用qRT‑PCR和WB法，检测自噬和凋亡相关蛋白的基因和蛋白表达水平，从细胞水平确证CBN通过调控自噬和凋亡发挥其抗心肌细胞缺氧的作用机制。

[0052] CBN对缺氧条件下心肌细胞损伤的保护作用及机制发明

[0053] 将大鼠心肌细胞株(H9c2)进行细胞培养和细胞传代后种板后培养48小时，分为五组：control组，model组，0.1μmol/L CBN组、1μmol/L CBN组和10μmol/L CBN组。control组给予完全培养基溶液，model组给予不含血清的DMEM，0.1μmol/L CBN组给予使用DMEM配制的0.1μmol/L CBN溶液，1μmol/L CBN组给予使用DMEM培养基配制的1μmol/L CBN溶液，10μmol/L CBN组给予使用DMEM培养基配制的10μmol/L CBN溶液。除control组外其余组细胞使用95％N2和5％CO2的混合气在缺氧小室中进行缺氧培养2h。

[0054] 在测定细胞存活率,细胞ROS含量检测和细胞呼吸测定后，进行细胞线粒体膜电位测定,病毒转染,RNA提取和总蛋白提取，使用SPSS 25.0统计软件，计量资料以均数±标准差 表示，统计方法采用单因素方差分析(one‑way ANOVA)进行组间比较，当方差齐时选用LSD检验方法，当方差不齐时则选择Dunnett’s T3检验方法，P＜0.05或P＜0.01表示差异具有统计学意义。

[0055] CBN对正常及缺氧H9c2细胞活力的影响

[0056] CCK‑8结果如图6显示，与control组相比，0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L CBN对正常培养的H9c2细胞活性没有显著影响作用(P＞0.05，图6a)。与control组相比，model组H9c2细胞活力显著下降(P＜0.01，图6b)；与model组相比，1μmol/L和10μmol/L CBN组能H9c2细胞活力显著上升(P＜0.01，图6b)。

[0057] CBN对缺氧H9c2中ROS的影响

[0058] ROS检测结果如图7显示，与control组相比，model组H9c2中ROS含量显著升高(P＜0.01)；与model组相比，1μmol/L和10μmol/L CBN组H9c2中ROS含量显著下降(P＜0.05)。

[0059] CBN对缺氧H9c2线粒体呼吸的影响

[0060] 细胞中ROS的增多会造成线粒体膜损伤，线粒体通透性增加，导致线粒体呼吸功能下降。routine状态氧消耗为细胞常规呼吸，加入抑制剂寡霉素后的leak状态氧消耗是ATP合酶被抑制后的质子泄漏的代偿，继续加入CCCP刺激的呼吸，ets状态下氧消耗反应了完整细胞非偶联呼吸中电子传递系统的容量，最后鱼藤酮、寡霉素相继抑制了复合体Ⅰ和复合体Ⅲ后的呼吸为rox状态下的氧消耗。

[0061] 使用Oxygraph‑2k检测routine、leak、ets和rox状态下细胞氧消耗，检测结果如图8所示，与control组相比，model组H9c2在routine状态氧消耗显著降低(P＜0.05，图9c)；与model组相比，10μmol/L CBN组H9c2在routine状态氧消耗显著升高(P＜0.05，图9c)。

[0062] 与control组相比，model组H9c2在leak状态氧消耗显著降低(P＜0.05，图9d)，与model组相比，10μmol/L CBN组H9c2在leak状态氧消耗显著升高(P＜0.01，图9d)。

[0063] 与control组相比，model组H9c2在ets状态氧消耗显著降低(P＜0.01，图9e)；10μmol/L CBN组H9c2在ets状态氧消耗显著升高(P＜0.05，图9e)

[0064] 与control组相比，model组H9c2在rox状态氧消耗显著降低(P＜0.05，图9f)，与model组相比，1μmol/L CBN组H9c2在rox状态氧消耗显著升高(P＜0.05，图9f)，10μmol/L CBN组H9c2在rox状态氧消耗显著升高(P＜0.01，图9f)。

[0065] qRT‑PCR结果如图9显示，与control组相比，model组H9c2中LC3基因表达显著升高(P＜0.05，图9a)，Beclin1基因表达显著升高(P＜0.01，图9b)，Atg5基因表达显著升高(P＜0.05，图9c)；与model组相比，10μmol/L CBN组H9c2中LC3、Beclin1和Atg5基因表达显著降低(P＜0.05，图9a‑c)

[0066] 与control组相比，model组H9c2中P62基因表达显著升高(P＜0.05，图9d)；与model组相比，1μmol/L和10μmol/L CBN组H9c2中P62基因表达显著降低(P＜0.05，图9d)。

[0067] 为了进一步验证CBN是通过调控信号通路PI3K/AKT/m‑TOR抑制自噬保护缺氧H9c2。我们利用H9c2缺氧模型，加入自噬抑制剂5mmol/L 3‑MA组与10μmol/LCBN+自噬激动剂50nmol/L RAPA组。RAPA是mTOR蛋白特异性抑制剂，RAPA可通过抑制mTOR蛋白受体调控下游蛋白，影响细胞生理功能。mTORC的抑制会导致ULK1激活，ULK1激活Beclin1，从而积极调节自噬。

[0068] 研究结果表明CBN对心肌缺血小鼠的心脏保护有一定作用，CBN可升高心肌缺血模型小鼠射血分数(EF％)和短轴缩短率(FS％)，降低左室舒张末期内径(LVID,d)和左室收缩末期内径(LVID,s)；降低心肌缺血小鼠血清LDH含量，提示CBN具有改善心肌缺血模型小鼠心脏功能的作用。

[0069] CBN可抑制心肌缺血小鼠自噬相关的微管相关蛋白1轻链3(LC3)、酵母Atg6的同系物(Beclin1)和自噬相关基因5(Atg5)的基因和蛋白表达，升高泛素结合蛋白P62(P62)基因和蛋白表达，提示CBN可抑制心肌缺血小鼠心肌自噬。CBN还可抑制心肌缺血小鼠凋亡相关的Bcl‑2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase3)和二磷酸腺苷核糖多聚酶(Parp)基因和蛋白表达，升高Bcl‑2/Bax蛋白比值，降低cleaved‑caspase3/Caspase3和cleaved‑parp/Parp比值；升高心肌缺血损伤小鼠心脏p‑PI3K/PI3K、p‑Akt/Akt和p‑mTOR/mTOR比值，提示CBN可能通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制心肌缺血小鼠心脏中自噬和凋亡。

[0070] 在另一个实施例中，CBN对缺氧H9c2细胞保护作用研究：CBN对正常培养的H9c2细胞活力未见影响，但是可提高缺氧H9c2细胞活力；降低缺氧H9c2细胞ROS含量，升高缺氧H9c2线粒体膜电位；升高缺氧H9c2细胞在routin、leak、ets和rox状态氧消耗，提高H9c2线粒体呼吸功能，从细胞水平验证CBN具有抑制缺氧H9c2细胞线粒体损伤，提高H9c2活力的作用。

[0071] 研究结果还发现，CBN可降低缺氧H9c2中LC3、Beclin1、Atg5和P62基因表达，显著降低LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值以及Beclin1、Atg5和P62蛋白表达。与缺氧2h组相比，缺氧24h组H9c2中P62蛋白表达下降，说明P62降解有滞后性。CBN可降低LC3黄色和红色斑点数量，抑制自噬流发生。此外，研究结果还显示CBN降低Bax、Caspase3和Parp基因表达，升高Bcl‑2/Bax蛋白比值，降低cleaved‑caspase3/Caspase3和cleaved‑parp/Parp蛋白比值，升高缺氧H9c2细胞p‑PI3K/PI3K、p‑Akt/Akt和p‑mTOR/mTOR蛋白比值，表明CBN可通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制缺氧H9c2细胞自噬与凋亡的发生。RAPA处理后，CBN升高缺氧H9c2细胞活力的作用被抑制。且RAPA可以抑制CBN通过信号通路PI3K/AKT/mTOR调控自噬和凋亡相关蛋白表达的作用，表明CBN通过抑制自噬保护缺氧H9c2细胞的作用。

[0072] 本发明验证了CBN具有保护线粒体，保护缺氧H9c2的作用。CBN可以通过调控自噬上游信号通路PI3K/AKT/mTOR影响缺氧H9c2自噬和凋亡相关基因和蛋白表达。而RAPA处理后可抑制CBN对缺氧H9c2的保护作用。

[0073] 本发明首先采用左前降支结扎术对C57 BL/6J小鼠进行造模，模拟MI损伤，发现CBN可以降低MI损伤小鼠血清中LDH含量，升高EF％和FS％，降低LVID,d和LVID,s，提示CBN具有改善MI小鼠心功能的作用。

[0074] 线粒体在氧自由基的生成、钙平衡及细胞信号传导中起着重要作用，还会影响凋亡、细胞老化等细胞活动的进程。线粒体的氧化磷酸化过程参与营养物质的代谢与细胞呼吸中ATP合成。心脏是一个高能量需求的器官，且心肌能量储备有限，所以心脏功能的稳定需要正常的能量代谢提供物质基础。在应激条件下，线粒体受损，线粒体膜通透性改变释放坏死和凋亡因子，导致细胞死亡。本发明当冠状动脉血流量降低而导致供血不足时，心肌细胞因缺少营养物质与氧气，使线粒体内ROS含量、Ca2+浓度等发生改变,最终线粒体能量代谢异常。ROS具有强氧化性，可促进线粒体释放CytC，使线粒体通透性增加，进一步引起线粒体呼吸功能及能量代谢下降。线粒体内Ca2+浓度、ATP生成、ROS的释放等可以影响线粒体膜电位变化。线粒体膜电位是通过泵入质子穿过线粒体膜而产生的，可以衡量线粒体功能状态。本发明中CBN具有提高缺氧损伤的心肌细胞活力，降低ROS的释放、提高缺氧H9c2线粒体呼吸功能和线粒体膜电位。CBN可能具有线粒体保护的作用，从而提高细胞活力。

[0075] 本发明通过调控PI3K/AKT/mTOR通路可以显著抑制细胞凋亡与自噬，减轻组织损伤。当细胞受到缺氧、氧化应激等不利因素的刺激时会抑制PI3K/Akt/mTOR通路中多种激酶的磷酸化，诱导细胞发生自噬。PI3K/Akt/mTOR通路中PI3KⅠ激活Akt后，使mTOR磷酸化，发挥抑制自噬的作用。MI时，ATP浓度降低，AMP/ATP比例增高，可激活AMP依赖的蛋白激酶对mTORC1产生抑制作用，抑制mTORC1活性，mTORC1的抑制会导致ULK1激活，ULK1进一步激活Beclin1，从而积极调节自噬。此外，mTOR的激活可以促进线粒体调节因子的合成，为线粒体生物合成提供基础。PI3K/AKT/mTOR信号传导的激活与线粒体通透性转换孔(mPTP)开口的抑制之间存在紧密联系。mPTP的开放使线粒体基质渗透压升高，导致线粒体肿胀破裂，释放凋亡因子等进入细胞浆，激活凋亡，加剧细胞的缺血性损伤。RAPA是mTOR蛋白特异性抑制剂，RAPA可通过抑制mTOR蛋白受体调控下游蛋白，影响细胞生理功能。WB结果显示CBN可以促进PI3K、AKT和mTOR蛋白磷酸化，抑制自噬和凋亡的发生。为了进一步验证这个推测，我们利用体外H9c2缺氧模型，同时给予CBN和自噬激动剂RAPA，结果显示RAPA抑制了CBN保护缺氧H9c2细胞活力的作用且在RAPA的干扰下CBN无法调控自噬、凋亡及其上游信号通路PI3K/AKT/mTOR相关蛋白的表达。

[0076] 综上所述，本发明实验采用小鼠心梗模型，给予CBN后通过超声检测小鼠心功能等指标的变化，结果表明药物具有抗MI的作用。细胞实验的结果表明CBN具有提高缺氧H9c2细胞活力和保护线粒体的作用。其抗MI的作用机制与通过调节PI3K/Akt/mTOR通路抑制自噬和凋亡情况有关。

[0077] 本发明采用冠状动脉左前降支结扎术制备小鼠MI模型，结合体外H9c2缺氧模型，发现二氢欧山芹醇当归酸酯可以改善心肌缺血小鼠心功能，具有抗心肌缺血作用，二氢欧山芹醇当归酸酯具有提高缺氧损伤H9c2细胞活力，保护线粒体保护的作用，二氢欧山芹醇当归酸酯通过调控调控信号通路PI3K/AKT/mTOR抑制缺氧H9c2细胞自噬和凋亡综上，二氢欧山芹醇当归酸酯通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制细胞自噬和凋亡发挥抗心肌缺血作用。

[0078] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。