甲基硒酸作为PD-1抗体治疗结肠癌增敏剂的新用途

摘要

本发明提供一种甲基硒酸作为PD‑1抗体治疗结肠癌增敏剂的新用途；发现甲基硒酸增强了PD‑1抗体对结肠癌的生长抑制作用；甲基硒酸可以抑制PD‑1抗体诱导的肿瘤免疫逃逸蛋白PD‑L1的上调，从而克服PD‑1抗体在结肠癌治疗中的抗性；本发明为研制以甲基硒酸和PD‑1抗体为基础的抗结肠癌药物提供了科学依据，具有重大的应用价值。

权利要求

1.一种药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途，所述的药物组合物包括甲基硒酸和PD‑1抗体；所述药物组合物中，PD‑1抗体和甲基硒酸的摩尔比为1:100；所述的癌症为结直肠癌,所述的PD‑1抗体的RRID是AB_10949053。

2.根据权利要求1所述的用途，其中PD‑1抗体和甲基硒酸的用量为分别为30nM，3μM。

3.甲基硒酸在制备PD‑1抗体治疗结肠癌增敏剂中的用途，其中PD‑1抗体与甲基硒酸的摩尔比为1:100，所述的PD‑1抗体的RRID是AB_10949053。

4.根据权利要求3所述的用途，其中PD‑1抗体和甲基硒酸的用量为分别为30nM，3μM。

说明书

甲基硒酸作为PD‑1抗体治疗结肠癌增敏剂的新用途

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及甲基硒酸作为PD‑1抗体治疗结肠癌增敏剂的新用途。

背景技术

[0002] 硒是人体必需的微量营养素，甲基硒酸 (Methylseleninic acid, MSeA)是一种单甲基的有机硒化合物，在许多临床前模型中表现出抗癌活性。甲基硒醇是硒抗癌的关键代谢产物，甲基硒酸通过被谷胱甘肽还原为甲基硒醇，发挥抗癌作用。甲基硒醇掺入到蛋白质中，导致有毒蛋白质的积累，引起内质网应激反应，激活凋亡通路，导致癌细胞死亡。

[0003] 程序性死亡受体1 (programmed death protein 1, PD‑1)主要表达在活化的T细胞表面，能够抑制T细胞激活，是机体防止免疫过激的一种自稳机制。肿瘤细胞高表达PD‑1的配体即程序性死亡配体‑1 (programmed cell death protein ligand 1, PD‑L1)，PD‑L1与PD‑1结合后抑制T细胞活化，导致肿瘤细胞的免疫逃逸。PD‑1单克隆抗体可以有效阻断PD‑1/PD‑L1通路，解除局部免疫抑制，抑制肿瘤发展，是癌症免疫疗法的重要治疗手段。

[0004] 虽然单抗药物的临床效果显著, 但仍面临着耐药的问题。其中一种耐药机制与IFN‑γ诱导的PD‑L1有关，在PD‑1抗体治疗期间，重新激活的T细胞释放IFN‑γ，诱导PD‑L1上调，进而抑制T细胞活化，使得肿瘤部分抵消免疫压力。因此如何针对PD‑1抗体耐药机制发现新的治疗方法和药物、提高治疗效果、延长病人生存期成为肿瘤免疫治疗急需解决的问题。

发明内容

[0005] 本发明第一个方面是提供一种药物组合物，所述药物组合物包括PD‑1抗体和甲基硒酸。在一个具体的实施例中，所述药物组合物中，PD‑1抗体和甲基硒酸的摩尔比为（0.5‑1.5）:（80‑100），优选为1:100。

[0006] 本发明的第二个方面提供一种药物组合物在制备治疗结肠癌的药物中的用途，所述的药物组合物包括PD‑1抗体和甲基硒酸；在一个具体的实施例中，所述药物组合物中，PD‑1抗体和甲基硒酸的摩尔比为（0.5‑1.5）:（80‑100），优选为1:100；在另外一个具体的实施例中，所述的癌症为结肠癌。

[0007] 本发明第三个方面是提供甲基硒酸作为PD‑1抗体抗癌增敏剂的新用途，或甲基硒酸用于制备PD‑1抗体抗癌增敏剂药物的用途；在一个具体的实施例中，所述应用中，所述癌具体为结肠癌。

[0008] 本发明第四个方面提供甲基硒酸在制备用于增强PD‑1抗体抗癌功效的药物中的应用；进一步地，所述用于增强PD‑1抗体抗癌功效的药物具体为能够增加结肠癌生长抑制的药物。

[0009] 本发明中所使用的甲基硒酸（CAS:28274‑57‑9）结构式见式（Ι），PD‑1抗体的RRID是AB_10949053

[0010]

[0011] 本发明的有益效果为：

[0012] 1）通过体外、体内实验证实，甲基硒酸可以促进PD‑1对于结直肠癌的治疗活性，即提高肿瘤细胞对于PD‑1抗体的敏感性，提示由甲基硒酸和PD‑1的抗体形成的组合物可以作为治疗肿瘤尤其是结肠癌的药物组合物；

[0013] 2）PD‑1的抗体治疗引起肿瘤细胞的抗性的原理是PD‑L1的过表达，中和了PD‑1抗体的治疗活性，本发明的实验证明，甲基硒酸可以有效抑制PD‑1抗体治疗过程中的癌细胞的PD‑L1的过表达，因此，提高了肿瘤细胞对于PD‑1抗体的敏感性。

附图说明

[0014] 图1 PD‑1抗体和甲基硒酸处理对CD8+T细胞杀伤结肠癌细胞CT26的影响。

[0015] 图2 PD‑1抗体和亚硒酸钠  (selenite)、硒代蛋氨酸 (selenomethionine, +SeMet)处理对CD8T细胞杀伤结肠癌细胞CT26的影响。

[0016] 图3 PD‑1抗体、甲基硒酸、PD‑1抗体和甲基硒酸联合处理对小鼠体重、肿瘤大小和最终肿瘤重量的影响。PD‑1抗体、甲基硒酸、以及二者联合处理，对小鼠体重均没有明显影响。PD‑1抗体单独处理对肿瘤生长以及最终的肿瘤重量没有明显的抑制作用，联合处理可显著抑制肿瘤生长，降低最终肿瘤重量。

[0017] 图4 PD‑1抗体和甲基硒酸处理对小鼠肿瘤组织中细胞因子IFN‑γ浓度和肿瘤免疫逃逸蛋白PD‑L1的影响。

具体实施方式

[0018] 以下结合附图和具体实施例，对本发明的具体实施方式和技术方案作进一步的详述，需明确：本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0019] 下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

[0020] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0021] 小鼠结肠癌细胞CT26来源于美国模式培养物保藏所 (American type culture collection),即ATCC细胞库。实施例1 甲基硒酸可增强PD‑1抗体引起的T细胞对结肠癌细胞的生长抑制作用。

[0022] 试验方法：由于PD‑1主要表达在CD8+T细胞中，因此本研究利用小鼠原代CD8+T细胞与CT26细胞共培养以验证甲基硒酸和PD‑1抗体在T细胞介导的肿瘤细胞杀伤中的作用。用30nM的PD‑1抗体和3μM的甲基硒酸处理30小时，用结晶紫染色法检测CT26细胞存活率。图1+ +
表明，CT26细胞与CD8T细胞共培养后，CT26细胞活力显著下降，表明所使用的CD8T细胞具有细胞毒性。PD‑1抗体和甲基硒酸联合处理相比于PD‑1抗体单独处理组T细胞杀伤效应显著增强，肿瘤细胞存活率显著降低（降低约30%）。而亚硒酸钠和硒代蛋氨酸（图2）均无法进一步促进PD‑1抗体引起的T细胞杀伤效应。结果表明，甲基硒酸可增强PD‑1抗体引起的T细胞对结肠癌细胞的生长抑制作用，而亚硒酸钠和硒代蛋氨酸不能增强PD‑1抗体引起的T细胞对结肠癌细胞的生长抑制作用。

[0023] 实施例2在CT26异位移植小鼠模型中，甲基硒酸增强PD‑1抗体对结肠癌肿瘤生长的抑制效果。

[0024] 试验方法：雌性BALB/C小鼠（北京维通利华实验技术有限公司），32只，6周龄，将16
×10 个CT26细胞，注射到小鼠右后肢脂肪垫，用游标卡尺测量肿瘤体积。当肿瘤体积约为
3
50 mm时，将小鼠随机分为对照组、PD‑1抗体、甲基硒酸和联合处理组。对照组给予等量的兔IgG2a同型对照和或蒸馏水；PD‑1抗体处理组每隔四天以5 mg/kg（体重）的剂量腹腔注射给药；甲基硒酸以2mg/kg（体重）的剂量灌胃给药，每天给1次。每隔一天测量小鼠体重和肿瘤体积。实验结束后，取肿瘤，液氮急冻后保存在‑80℃。

[0025] 以肿瘤体积和肿瘤重量作为评价标准，由图3可知PD‑1抗体单独处理对肿瘤生长以及最终的肿瘤重量没有明显的抑制作用，联合处理可显著抑制肿瘤生长，降低最终肿瘤重量，且对小鼠的体重没有明显的影响，说明没有联合毒性。

[0026] 结果表明，在CT26肿瘤细胞皮下成瘤模型中，PD‑1抗体和甲基硒酸联合处理对结肠癌具有良好的治疗效果。实施例3甲基硒酸可降低小鼠肿瘤组织中PD‑1抗体通过IFN‑γ诱导的PD‑L1蛋白上调，以克服PD‑1抗体在结肠癌治疗中的抗性。

[0027] 试验方法：将小鼠CT26肿瘤组织从‑80 ℃冰箱取出，用小鼠细胞因子ELISA试剂盒（南京建成，H025‑1‑2）测定肿瘤组织匀浆上清液中IFN‑γ的浓度。提取肿瘤组织总蛋白，进行PD‑L1的蛋白免疫印迹检测，β‑actin用作上样量对照。蛋白免疫印迹检测中，所用的一抗为抗PD‑L1(abcam,ab213480)，抗β‑actin(CST, 4970)，二抗为兔二抗(MBL,458)。最后使用ECL发光试剂盒进行显影。

[0028] 图4结果表明，PD‑1抗体促进小鼠肿瘤微环境中细胞因子IFN‑γ的释放，从而显著诱导肿瘤PD‑L1蛋白上调，而甲基硒酸显著降低PD‑1抗体诱导的PD‑L1，从而克服PD‑1抗体在结肠癌治疗中的抗性。