一类长效GLP-1/glucagon/GIP受体三重激动剂及其应用

摘要

本发明公开了一类长效GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂及其应用，所述受体三重激动剂能同时作用于GLP‑1受体、glucagon受体和GIP受体，可以同时发挥GLP‑1、glucagon和GIP的活性；不仅具有GLP‑1对糖尿病的治疗作用，还具有glucagon对体重、能量代谢、脂质代谢的有益作用，还具有GIP对糖、脂代谢和食欲抑制的有益作用，从而对糖、脂、能量代谢产生协同影响；将其应用于制备治疗代谢综合征，诸如糖尿病、肥胖症、高血压、非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪肝炎、血脂障碍等疾病药物方面具有更大的潜力。

权利要求

1.一种长效GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂，其特征在于，所述受体三重激动剂的的氨基酸序列为：

2.一种权利要求1所述的长效GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂药学上可接受的盐。

3.根据权利要求2所述的一种长效GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂药学上可接受的盐，其特征在于，所述药学上可接受的盐为长效GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂与下述化合物中的一种形成的盐；所述下述化合物包括盐酸、甲酸、乙酸、丙酮酸、丁酸、己酸、苯磺酸、双羟萘酸、苯甲酸、水杨酸、月桂酸、肉桂酸、丙酸、十二烷基硫酸、柠檬酸、抗坏血酸、酒硬脂酸、石酸、草酸、乳酸、琥珀酸、丙二酸、马来酸、富马酸、天冬氨酸、磺基水杨酸。

4.一种权利要求1所述长效GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂所制备的药剂，其特征在于，所述药剂包括任何一种药剂学上所说的片剂、胶囊、糖浆、酊剂、吸入剂、喷雾剂、注射剂、膜剂、贴剂、散剂、颗粒剂、乳剂、栓剂或者复方制剂。

5.一种长效GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂制备的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述一种长效GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂、药学上可接受的载体或稀释剂；或者所述药物组合物包括权利要求2‑3任一项所述的一种长效GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂药学上可接受的盐、药学上可接受的载体或稀释剂。

6.一种权利要求1所述长效GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂或一种权利要求2‑3任一项所述的长效GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂药学上可接受的盐或一种权利要求4所述的药剂或权利要求5所述的药物组合物在制备用于治疗代谢性疾病或病症的药物中的用途；所述代谢性疾病或病症为糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪肝炎或血脂障碍。

说明书

一类长效GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一类长效GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂及其应用。

背景技术

[0002] 肥胖及其相关代谢综合征已成为全球性的公众健康问题，许多代谢综合征如2型糖尿病(T2DM)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、血脂代谢异常的发病率与病程发展都与肥胖密切相关。研究表明，临床上80‑90％的T2DM患者伴有超重或肥胖。目前治疗肥胖的药物疗效较为有限，许多治疗肥胖的药物还具有较显著的副作用。目前治疗T2DM的药物中，仅有胰高血糖素样肽(GLP‑1)受体激动剂和钠‑葡萄糖共转运蛋白2(SGLT2)抑制剂具有较好的体重控制效果(J.Med.Chem.,2018,61,5580‑5593)。

[0003] 胰高血糖素样肽‑1(GLP‑1)是小肠L细胞分泌的一种葡萄糖依赖性降血糖多肽激素，与GLP‑1受体特异性结合后发挥降糖作用。GLP‑1的主要优点是具有血糖依赖性的肠促胰岛素分泌作用，避免了糖尿病治疗中常存在的产生低血糖症的危险。除了调节血糖，GLP‑1也可以阻止胰腺β细胞退化，刺激β细胞的增殖和分化，能从源头上改善糖尿病进程。此外，GLP‑1还具有抑制胃酸分泌、延迟胃排空、抑制食欲等作用，具有部分减重效果。目前已上市多个长效GLP‑1类药物，如liraglutide、semaglutide等。虽然GLP‑1类药物具有安全的降血糖作用，但是如果需要实现较好的体重减轻作用，一般需要加大给药剂量，而大剂量给予GLP‑1类药物容易产生胃肠道副作用、耐受性差而导致治疗窗较窄。因此，仍然需要更为安全耐受的，可有效减轻体重和控制血糖的治疗剂。

[0004] 胰高血糖素(glucagon)是由胰岛α细胞分泌的一种激素。在机体寒冷、饥饿等应激状态下作用于肝脏，将肝脏中的糖原进行分解而提高血糖。除了其升血糖作用，glucagon在体内还具有促进脂解、脂肪氧化、发热等作用(Diabetologia,2017,60,1851–1861)，长期给药可以通过增加能量代谢量而呈现出体重减轻药效，但glucagon这些对能量代谢的有益作用因其固有的升血糖作用而未能得以应用。

[0005] 葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)是一种42个氨基酸的胃肠调节肽，和GLP‑1都属于肠降血糖素，对体内血糖的新陈代谢起到关键的生理作用。GIP在体内通过分布在胰岛β细胞、脂肪组织和中枢神经系统中的GIP受体相作用从而发挥其生理活性。与GLP‑1类似，GIP可以刺激胰岛β细胞分泌胰岛素从而降低血糖，并且可以保护胰岛β细胞从而控制体内葡萄糖的新陈代谢。此外，GIP还可以激动在脂肪组织的GIP受体从而促进脂肪新陈代谢，并且GIP还具有抑制食欲的作用。

[0006] GLP‑1、glucagon和GIP所对应的受体GLP‑1受体、glucagon受体和GIP受体都属于GPCR受体家族，具有类似的蛋白结构以及结合机理，使得设计针对这三个受体的多重激动剂成为可能。这三个受体的多重激动剂能够同时作用于GLP‑1受体、glucagon受体和GIP受体的三重激动剂，可以同时发挥GLP‑1、glucagon和GIP的活性。GLP‑1能够降低血糖、抑制食欲；glucagon能够分解脂肪，降低体重，会升高血糖，但是可以被GLP‑1的降糖活性抵消；GIP主要刺激胰岛素分泌。GLP‑1受体、glucagon受体和GIP受体的三重激动剂的三种活性相互配合，依血糖浓度形成一种反馈机制，既能控制血糖，又能分解脂肪，降低体重。对于糖尿病、肥胖的治疗，GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂比单纯的GLP‑1类似物具有显著的优势。

发明内容

[0007] 本发明提供了一类长效GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂及其应用，该激动剂能够同时作用于GLP‑1受体、glucagon受体和GIP受体，可以同时发挥GLP‑1、glucagon和GIP的活性；不仅具有GLP‑1对糖尿病的治疗作用，还具有glucagon对体重、能量代谢、脂质代谢的有益作用，还具有GIP对糖、脂代谢和食欲抑制的有益作用，从而对糖、脂、能量代谢产生协同影响；将其应用于制备治疗代谢综合征，诸如糖尿病、肥胖症、高血压、非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪肝炎、血脂障碍等疾病药物方面具有更大的潜力。

[0008] 为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

[0009] 一类长效GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂，所述GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂的氨基酸序列通式为：

[0010] His‑Xaa1‑His‑Gly‑Thr‑Tyr‑Thr‑Asn‑Asp‑Val‑Ser‑Ile‑Tyr‑Leu‑Glu‑Xaa2‑Xaa3‑Xaa4‑Ala‑Aib‑Gl u‑Phe‑Val‑Gln‑Trp‑Leu‑Leu‑Glu‑Gly‑Gly‑Pro‑Ser‑Ser‑Gly‑Ala‑Pro‑Pro‑Pro‑Ser‑NH2，

[0011] 其中：Xaa1选自D‑Ala、Gly或Aib；Xaa2选自侧链被修饰的Lys；Xaa3选自Lys或Gln；Xaa4选自Tyr或Ala；

[0012] 所述侧链被修饰的Lys选自

[0013]

[0014]

[0015] 其中：n为自然数，且16≤n≤20。

[0016] 优选的，所述n为16、18或20。

[0017] 优选的，所述受体三重激动剂的序列结构选自如SEQ ID NO:1‑12所示的氨基酸序列中的任一种：

[0018] SEQ ID NO:1

[0019]

[0020] SEQ ID NO:2

[0021]

[0022] SEQ ID NO:3

[0023]

[0024] SEQ ID NO:4

[0025]

[0026] SEQ ID NO:5

[0027]

[0028] SEQ ID NO:6

[0029]

[0030] SEQ ID NO:7

[0031]

[0032] SEQ ID NO:8

[0033]

[0034] SEQ ID NO:9

[0035]

[0036] SEQ ID NO:10

[0037]

[0038] SEQ ID NO:11

[0039]

[0040] SEQ ID NO:12

[0041]

[0042] 本发明还提供了一类上述长效GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂药学上可接受的盐。

[0043] 进一步地，所述药学上可接受的盐为长效GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂与下述化合物中的一种形成的盐；所述下述化合物包括盐酸、甲酸、乙酸、丙酮酸、丁酸、己酸、苯磺酸、双羟萘酸、苯甲酸、水杨酸、月桂酸、肉桂酸、丙酸、十二烷基硫酸、柠檬酸、抗坏血酸、酒硬脂酸、石酸、草酸、乳酸、琥珀酸、丙二酸、马来酸、富马酸、天冬氨酸、磺基水杨酸。

[0044] 本发明还提供一类上述长效GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂所制备的药剂，所述药剂包括任何一种药剂学上所说的片剂、胶囊、糖浆、酊剂、吸入剂、喷雾剂、注射剂、膜剂、贴剂、散剂、颗粒剂、乳剂、栓剂或者复方制剂。

[0045] 本发明还提供一类长效GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂制备的药物组合物，所述药物组合物包括所述一类长效GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂、药学上可接受的载体或稀释剂；或者所述药物组合物包括所述一类长效GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂药学上可接受的盐、药学上可接受的载体或稀释剂。

[0046] 本发明还提供了所述一类长效GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂或所述的一类长效GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂药学上可接受的盐或所述的药剂或所述的药物组合物在制备用于治疗代谢性疾病或病症的药物中的用途；所述代谢性疾病或病症包括糖尿病、肥胖症、高血压、非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪肝炎或血脂障碍。

[0047] 本发明所制备的化合物，对GLP‑1受体具有强激动活性，对glucagon受体激动活性也较强，但是对GIP受体的激动活性较弱，却实现了更好的降糖和减重作用，为制备多重激动剂提供了新的思路。

[0048] 与现有技术相比，本发明有益的技术效果在于：

[0049] (1)本发明的GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂在更为有效的降低血糖的同时具有显著的减重和防止增重作用，更好的调节脂质代谢；

[0050] (2)本发明的GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂具有独特的N端6‑10位序列结构(YTNDV)，和独特的体外GLP‑1受体、glucagon受体和GIP受体激动活性比例，从而带来了显著提高的减重和调节脂质代谢作用，具有意想不到的有益效果；

[0051] (3)与已报道的GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂相比，本发明的GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂具有类似的GLP‑1受体和glucagon受体激动活性和明显更弱的GIP受体激动活性，但是减重、调节脂质代谢和降糖活性却显著提高，在治疗代谢性疾病方面更有潜力，为此类多重激动剂的药物研发提供了新的思路；

[0052] (4)本发明提供的受体三重激动剂化学性质稳定，具有支持至少每周一次给药的药代动力学特征；本发明提供的受体三重激动剂对T2DM、肥胖、血脂障碍等代谢性疾病的治疗作用优于现有上市药物。因此，本发明提供的受体三重激动剂，适合作为治疗代谢性疾病，如糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪肝炎、血脂障碍等药物的活性成分。

附图说明

[0053] 图1为本发明各受试物在DIO小鼠长期给药21天的体重变化百分比。

具体实施方式

[0054] 下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

[0055] 除非本发明另有定义，否则本说明书中所使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。通常，本发明所述的与化学、分子生物学、细胞生物学、药理学关联使用的术语和方法是本领域中公知和常用的。

[0056] 本发明公开的各种要素的所有组合均属于本发明的范围。此外，本发明的范围不应受到下文提供的具体公开内容的限制。

[0057] 进一步地，本发明提及的氨基酸可根据IUPAC‑IUB的命名规则缩写如下：

[0058] 丙氨酸(Ala，A)；精氨酸(Arg，R)；天冬酰胺(Asn，N)；天冬氨酸(Asp，D)；半胱氨酸(Cys，C)；谷氨酸(Glu，E)；谷氨酰胺(Gln，Q)；甘氨酸(Gly，G)；组氨酸(His，H)；异亮氨酸(Ile，I)；亮氨酸(Leu，L)；赖氨酸(Lys，K)；甲硫氨酸(Met，M)；苯丙氨酸(Phe，F)；脯氨酸(Pro，P)；丝氨酸(Ser，S)；苏氨酸(Thr，T)；色氨酸(Trp，W)；酪氨酸(Tyr，Y)；缬氨酸(Val，V)。

[0059] 进一步地，除非明确标明，本发明的多肽中的所有氨基酸残基优选为L构型。

[0060] 进一步地，所述序列的C端上的“‑NH2”部分表明C端上的酰胺基(‑CONH2)。

[0061] 进一步地，本发明序列中除了天然氨基酸以外，还使用了非天然氨基酸，α‑氨基异丁酸(Aib)。

[0062] 进一步地，本发明所述的多肽化合物既可以通过多肽固相合成法合成得到，也可以通过基因工程技术生产。

[0063] 为了更详细的说明本发明，本说明书提供了下列具体实施方案，但本发明的方案并非仅限于此。

[0064] 实施例1

[0065] SEQ ID NO:1的多肽化合物的合成

[0066]

[0067] (1)树脂的溶胀

[0068] 称取担载量为0.296mmol/g的RinkAmide MBHA树脂0.338g(0.1mmol当量)，放入25mL的反应器中，用7mL的DCM和甲醇交替清洗树脂1次，7mL的DCM清洗树脂2次，然后用7mL的DCM溶胀树脂1h，最后用7mLDMF清洗树脂3次。

[0069] (2)树脂Fmoc保护基的脱除

[0070] 将溶胀后的树脂转入PSI‑200多肽合成仪，加入7mL 20％哌啶/DMF(v/v)室温反应5min，滤去脱保护溶液，7mLDMF清洗树脂一次，再加入7mL 20％哌啶/DMF(v/v)脱保护溶剂与树脂反应15min，最后7mLDMF清洗树脂4次，每次1.5min，得到脱除Fmoc保护基的Rink树脂。

[0071] (3)Fmoc‑Ser‑Rink amide‑MBHAResin的合成

[0072] 称Fmoc‑Ser(tBu)‑OH(0.4mmol)，用3mL 10％DMF/DMSO(v/v)溶解，加入2mL DIC/HOBt(0.4mmol/0.44mmol)缩合剂，预活化30min后，将活化好的氨基酸加入反应器中，室温震荡反应2h，滤去反应液后用7mLDMF清洗树脂4次，使用Kaiser试剂检测反应耦合是否完全，如不完全则2次耦合。

[0073] (4)肽链的延长

[0074] 按照肽链的序列，重复上述脱保护和耦合的步骤依次连接上相应的氨基酸，直至肽链合成完毕。

[0075] (5)Lys侧链的修饰

[0076] 肽链合成完毕后，加入7mL 2％水合肼/DMF(v/v)选择性脱除16位Lys的Dde保护基，Dde保护基脱除后加入0.4mmol的Boc‑Lys(Fmoc)‑OH，0.4mmol的DIC及0.44mmol的HOBt，震荡反应2h。然后使用上述相同方法脱除Fmoc保护基后，加入Boc‑Lys(Fmoc)‑OH，0.4mmol的DIC及0.44mmol的HOBt，震荡反应2h。然后使用上述相同方法脱除Fmoc保护基后，加入0.4mmol的Fmoc‑Glu‑OtBu，0.4mmol的DIC及0.44mmol的HOBt，震荡缩合反应2h。脱除Fmoc保护基后，加入0.4mmol的二十烷二酸单叔丁酯，0.4mmol的DIC及0.44mmol的HOBt缩合反应
2h，反应完全后用7mLDMF清洗树脂4次。

[0077] (6)多肽的裂解

[0078] 将上述得到的连有多肽的树脂转移至圆底瓶中，使用切割剂Reagent R(TFA/苯甲硫醚/苯酚/EDT，90:5:3:2，V/V)5mL切割树脂，在油浴中恒温30℃反应2h，切割液倾入40mL冰乙醚中，冷冻离心后粗品用15mL冰乙醚洗涤3次，最后用氮气吹干，得到粗肽。

[0079] (7)多肽的纯化

[0080] 将目标多肽粗品溶于水中，用0.25μm微孔滤膜过滤后进岛津制备型反相HPLC系统纯化。色谱条件为C18反相制备柱(250mm×20mm，12μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：甲醇(V/V)；流速为8mL/min；检测波长为214nm。采用线性梯度(20％B～70％B/30min)洗脱，收集目标峰，除去甲醇后冻干得纯品0.17g，纯度大于98％，通过MS确认目标多肽的分3+ 4+
子量。理论相对分子质量为4863.5。ESI‑MS m/z:计算值[M+3H] 1622.2,[M+4H] 1216.9；
3+ 4+
观察值[M+3H] 1622.2,[M+4H] 1216.6。

[0081] 实施例2

[0082] SEQ ID NO:2多肽化合物的合成

[0083]

[0084] 合成方法同实施例1，收集目标峰冻干得纯品0.15g，纯度大于98％，通过MS确认目3+
标多肽的分子量。理论相对分子质量为4955.6。ESI‑MS m/z:计算值[M+3H] 1652.9,[M+4H
4+ 3+ 4+
] 1239.9；观察值[M+3H] 1652.5,[M+4H] 1239.9。

[0085] 实施例3

[0086] SEQ ID NO:3多肽化合物的合成

[0087]

[0088] 合成方法同实施例1，收集目标峰冻干得纯品0.16g，纯度大于98％，通过MS确认目3+
标多肽的分子量。理论相对分子质量为4955.6。ESI‑MS m/z:计算值[M+3H] 1652.9,[M+4H
4+ 3+ 4+
] 1239.9；观察值[M+3H] 1652.5,[M+4H] 1239.7。

[0089] 实施例4

[0090] SEQ ID NO:4多肽化合物的合成

[0091]

[0092] 合成方法同实施例1，仅在Lys侧链的修饰那步，将二十烷二酸单叔丁酯换成十八烷二酸单叔丁酯。收集目标峰冻干得纯品0.14g，纯度大于98％，通过MS确认目标多肽的分3+ 4+
子量。理论相对分子质量为4835.4。ESI‑MS m/z:计算值[M+3H] 1612.8,[M+4H] 1209.8；
3+ 4+
观察值[M+3H] 1612.6,[M+4H] 1209.7。

[0093] 实施例5

[0094] SEQ ID NO:5多肽化合物的合成

[0095]

[0096] 合成方法同实施例1，仅在Lys侧链的修饰那步，将二十烷二酸单叔丁酯换成十八烷二酸单叔丁酯。收集目标峰冻干得纯品0.15g，纯度大于98％，通过MS确认目标多肽的分3+ 4+
子量。理论相对分子质量为4927.5。ESI‑MS m/z:计算值[M+3H] 1643.5,[M+4H] 1232.9；
3+ 4+
观察值[M+3H] 1643.4,[M+4H] 1232.7。

[0097] 实施例6

[0098] SEQ ID NO:6多肽化合物的合成

[0099]

[0100] 合成方法同实施例1，仅在Lys侧链的修饰那步，将二十烷二酸单叔丁酯换成十八烷二酸单叔丁酯。收集目标峰冻干得纯品0.15g，纯度大于98％，通过MS确认目标多肽的分3+ 4+
子量。理论相对分子质量为4927.5。ESI‑MS m/z:计算值[M+3H] 1643.5,[M+4H] 1232.9；
3+ 4+
观察值[M+3H] 1643.4,[M+4H] 1232.8。

[0101] 实施例7

[0102] SEQ ID NO:7多肽化合物的合成

[0103]

[0104] (1)树脂的溶胀

[0105] 称取担载量为0.296mmol/g的RinkAmide MBHA树脂0.338g(0.1mmol当量)，放入25mL的反应器中，用7mL的DCM和甲醇交替清洗树脂1次，7mL的DCM清洗树脂2次，然后用7mL的DCM溶胀树脂1h，最后用7mLDMF清洗树脂3次。

[0106] (2)树脂Fmoc保护基的脱除

[0107] 将溶胀后的树脂转入PSI‑200多肽合成仪，加入7mL 20％哌啶/DMF(v/v)室温反应5min，滤去脱保护溶液，7mLDMF清洗树脂一次，再加入7mL 20％哌啶/DMF(v/v)脱保护溶剂与树脂反应15min，最后7mLDMF清洗树脂4次，每次1.5min，得到脱除Fmoc保护基的Rink树脂。

[0108] (3)Fmoc‑Ser‑Rink amide‑MBHAResin的合成

[0109] 称Fmoc‑Ser(Boc)‑OH(0.4mmol)，用3mL 10％DMF/DMSO(v/v)溶解，加入2mL DIC/HOBt(0.4mmol/0.44mmol)缩合剂，预活化30min后，将活化好的氨基酸加入反应器中，室温震荡反应2h，滤去反应液后用7mLDMF清洗树脂4次，使用Kaiser试剂检测反应耦合是否完全，如不完全则2次耦合。

[0110] (4)肽链的延长

[0111] 按照肽链的序列，重复上述脱保护和耦合的步骤依次连接上相应的氨基酸，直至肽链合成完毕。

[0112] (5)Lys侧链的修饰

[0113] 肽链合成完毕后，加入7mL 2％水合肼/DMF(v/v)选择性脱除16位Lys的Dde保护基，Dde保护基脱除后加入0.4mmol的Fmoc‑AEEA‑OH，0.4mmol的DIC及0.44mmol的HOBt，震荡缩合反应2h。脱除Fmoc保护基后，再次加入0.4mmol的Fmoc‑AEEA‑OH，0.4mmol的DIC及0.44mmol的HOBt，震荡缩合反应2h。脱除Fmoc保护基后，加入0.4mmol的Fmoc‑Glu‑OtBu，
0.4mmol的DIC及0.44mmol的HOBt，震荡缩合反应2h。脱除Fmoc保护基后，加入0.4mmol的二十烷二酸单叔丁酯，0.4mmol的DIC及0.44mmol的HOBt缩合反应2h，反应完全后用7mLDMF清洗树脂4次。

[0114] (6)多肽的裂解

[0115] 将上述得到的连有多肽的树脂转移至圆底瓶中，使用切割剂Reagent R(TFA/苯甲硫醚/苯酚/EDT，90:5:3:2，V/V)5mL切割树脂，在油浴中恒温30℃反应2h，切割液倾入40mL冰乙醚中，冷冻离心后粗品用15mL冰乙醚洗涤3次，最后用氮气吹干，得到粗肽。

[0116] (7)多肽的纯化

[0117] 将目标多肽粗品溶于水中，用0.25μm微孔滤膜过滤后进岛津制备型反相HPLC系统纯化。色谱条件为C18反相制备柱(250mm×20mm，12μm)；流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：甲醇(V/V)；流速为8mL/min；检测波长为214nm。采用线性梯度(20％B～70％B/30min)洗脱，收集目标峰，除去甲醇后冻干得纯品0.17g，纯度大于98％，通过MS确认目标多肽的分3+ 4+
子量。理论相对分子质量为4897.5。ESI‑MS m/z:计算值[M+3H] 1633.5,[M+4H] 1225.4；
3+ 4+
观察值[M+3H] 1633.4,[M+4H] 1225.3。

[0118] 实施例8

[0119] SEQ ID NO:8多肽化合物的合成

[0120]

[0121] 合成方法同实施例7，收集目标峰冻干得纯品0.16g，纯度大于98％，通过MS确认目3+
标多肽的分子量。理论相对分子质量为4989.5。ESI‑MS m/z:计算值[M+3H] 1664.2,[M+4H
4+ 3+ 4+
] 1248.4；观察值[M+3H] 1664.1,[M+4H] 1248.2。

[0122] 实施例9

[0123] SEQ ID NO:9多肽化合物的合成

[0124]

[0125] 合成方法同实施例7，收集目标峰冻干得纯品0.16g，纯度大于98％，通过MS确认目3+
标多肽的分子量。理论相对分子质量为4989.5。ESI‑MS m/z:计算值[M+3H] 1664.2,[M+4H
4+ 3+ 4+
] 1248.4；观察值[M+3H] 1664.1,[M+4H] 1248.1。

[0126] 实施例10

[0127] SEQ ID NO:10多肽化合物的合成

[0128]

[0129] 合成方法同实施例7，仅在Lys侧链的修饰那步，将二十烷二酸单叔丁酯换成十八烷二酸单叔丁酯。收集目标峰冻干得纯品0.15g，纯度大于98％，通过MS确认目标多肽的分3+ 4+
子量。理论相对分子质量为4869.4。ESI‑MS m/z:计算值[M+3H] 1624.1,[M+4H] 1218.4；
3+ 4+
观察值[M+3H] 1624.1,[M+4H] 1218.1。

[0130] 实施例11

[0131] SEQ ID NO:11多肽化合物的合成

[0132]

[0133] 合成方法同实施例7，仅在Lys侧链的修饰那步，将二十烷二酸单叔丁酯换成十八烷二酸单叔丁酯。收集目标峰冻干得纯品0.14g，纯度大于98％，通过MS确认目标多肽的分3+ 4+
子量。理论相对分子质量为4961.5。ESI‑MS m/z:计算值[M+3H] 1654.8,[M+4H] 1241.4；
3+ 4+
观察值[M+3H] 1654.7,[M+4H] 1241.2。

[0134] 实施例12

[0135] SEQ ID NO:12多肽化合物的合成

[0136]

[0137] 合成方法同实施例7，仅在Lys侧链的修饰那步，将二十烷二酸单叔丁酯换成十八烷二酸单叔丁酯。收集目标峰冻干得纯品0.17g，纯度大于98％，通过MS确认目标多肽的分3+ 4+
子量。理论相对分子质量为4961.5。ESI‑MS m/z:计算值[M+3H] 1654.8,[M+4H] 1241.4；
3+ 4+
观察值[M+3H] 1654.7,[M+4H] 1241.3。

[0138] 实施例13

[0139] 多肽化合物对GLP‑1受体、glucagon受体和GIP受体的激动活性测定

[0140] 通过功能测定法来确定多肽化合物对受体的激动作用，所述测定法测量稳定表达人GLP‑1受体、glucagon受体或GIP受体的HEK‑293细胞系的cAMP响应。分别将稳定表达上述三种受体的细胞分入T175培养瓶并在培养基中过夜生长至接近汇合状态，然后除去培养基，并用无钙和镁的PBS洗涤细胞，然后用Accutase酶进行蛋白酶处理。洗涤脱离的细胞并将其重悬于测定缓冲液(20mM HEPES,0.1％BSA,2mM IBMX,1×HBSS)中，并确定细胞密度，并将25μL的等分试样分装至96孔板的孔中。为了测量，将25μL的测试多肽化合物在测定缓冲液中的溶液添加到孔中，然后室温温育30分钟。用Cisbio的试剂盒，基于均相时间分辨荧光(HTRF)来确定细胞的cAMP含量。添加稀释于裂解缓冲液(试剂盒组分)中的HTRF试剂后，将平板温育1小时，然后测量665/620nm处的荧光比。通过检测引起最大响应的50％激活的浓度(EC50)来对激动剂的体外效力进行量化。

[0141] 将本专利申请实施例中的检测数据(nM)显示于下表1中，虽然用一定数量的有效数字来陈述检测数据，但不应该认为表示数据已确定精确为有效数字的数。

[0142] 表1：多肽化合物对人GLP‑1受体、glucagon受体及GIP受体的EC50值(以nM表示)[0143]

[0144] 如表1所示，大部分多肽化合物对GLP‑1受体的激动活性都略强于天然GLP‑1，大多数多肽化合物对glucagon受体的激动活性比天然glucagon弱4倍左右，本发明的多肽化合物的GIP受体激动活性均弱于天然GIP(约弱67‑83倍)，表明本发明的多肽化合物具有很强的GLP‑1受体激动活性、较好的glucagon受体激动活性和较弱的GIP受体激动活性，对GLP‑1受体、GIP受体和glucagon受体具有特殊的激动活性比例，并且也符合本专利所述的三重激动剂的特点。

[0145] 实施例14

[0146] 多肽化合物在大鼠体内的药代动力学性质

[0147] 大鼠给予50nmol/kg的皮下(s.c.)注射给药，在给药后0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、16h、24h、36h和48h收集血样。使用乙腈沉淀蛋白质后，用LC‑MS分析血浆样品。用WinonLin5.2.1(非房室模型)计算药代参数和半衰期(表2)。

[0148] 表2：多肽化合物在大鼠体内的药代动力学概貌

[0149]样品 T1/2(h) Cmax(ng/mL)
Semaglutide 9.2 501
SEQ ID NO:3 12.6 545
SEQ ID NO:6 11.1 532

[0150] 如表2结果显示，本发明的多肽化合物的体内半衰期显著延长，优于已上市的一周一次给药的Semaglutide，说明本发明的多肽化合物具有支持至少每周一次给药的药代动力学特征。

[0151] 实施例15

[0152] 多肽化合物对饮食诱导肥胖(DIO)小鼠血脂和体重的影响

[0153] 雄性C57BL/6J小鼠，体重22g左右，用Research Diets公司的D12492高脂饲料饲养18周造DIO小鼠模型。在给药开始前，各组DIO小鼠按照体重随机分组，共分为5组，每组6只，分别为生理盐水组(空白对照组)、阳性对照组(semaglutide、tirzepatide和SAR441255(临床阶段的GLP‑1/glucagon/GIP受体三重激动剂；Cell Metabolism,2022,34,1–16))和受试样品组(SEQ ID NO:3)。各组小鼠每两天一次皮下注射生理盐水(10mg/kg)，semaglutide(10nmol/kg)，tirzepatide(10nmol/kg)，SEQ ID NO:3(10nmol/kg)，或每天两次皮下注射SAR441255(10nmol/kg)，给药周期21天。每天记录小鼠体重变化，实验开始前和结束时使用核磁共振(NMR)来测量体脂量。在实验结束后，各组小鼠处死，取肝脏组织测量肝脏甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量。同时取血制血清，并测量血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量。

[0154] 表3：DIO小鼠在3周给药周期内的体重和体脂变化

[0155]

[0156]

[0157] ***：与空白对照组相比P<0.001；###：与semaglutide、tirzepatide和SAR441255组比P<0.001(One‑Way ANOVA,Tukey post hoc test)，结果表示为每组6只小鼠平均值±SD。

[0158] 如图1和表3结果显示，本发明的多肽化合物SEQ ID NO:3在DIO小鼠体内连续给药3周，可以显著降低小鼠的体重和体脂含量，并且本发明的多肽化合物的减重和降低体脂的作用显著强于阳性对照药semaglutide、tirzepatide和SAR441255。值得注意的是，SAR441255的GLP‑1受体激动活性与天然GLP‑1类似，glucagon受体激动活性比天然glucagon低2倍左右，GIP受体激动活性比天然GIP低2倍左右(Cell Metabolism,2022,34,
1–16)。由此可知，SAR441255的GLP‑1受体激动活性和glucagon受体激动活性与SEQ ID NO:
3较为类似，但是SAR441255的GIP受体激动活性却是显著强于SEQ ID NO:3的，可见本发明的多肽化合物SEQ ID NO:3却显示出了明显更优于SAR441255的减重和降低体脂活性。

[0159] 表4：DIO小鼠治疗3周后的肝脏甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量

[0160]样品(剂量) 总胆固醇(mg/g) 甘油三酯(mg/g)
空白对照(生理盐水组) 9.1±0.3 105.6±6.8
*** ***
Semaglutide(10nmol/kg) 7.3±0.4 69.2±4.4
*** ***
Tirzepatide(10nmol/kg) 6.8±0.2 60.3±3.5
*** ***
SAR441255(10nmol/kg) 6.4±0.1 54.6±4.6
***,### ***,###
SEQ ID NO:3(10nmol/kg) 4.8±0.2 39.7±2.5

[0161] ***：与空白对照组相比P<0.001；###：与semaglutide、tirzepatide和SAR441255组比P<0.001(One‑Way ANOVA,Tukey post hoc test)，结果表示为每组6只小鼠平均值±SD。

[0162] 表5：DIO小鼠治疗3周后的血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)含量

[0163]

[0164]

[0165] ***：与空白对照组相比P<0.001；###：与semaglutide、tirzepatide和SAR441255组比P<0.001(One‑Way ANOVA,Tukey post hoc test)，结果表示为每组6只小鼠平均值±SD。

[0166] 如表4和表5所示，本发明实施例制备的多肽化合物在DIO小鼠体内连续给药3周，可以显著降低小鼠的肝脏甘油三酯和总胆固醇含量，并且可以显著降低血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量，并且本发明的多肽化合物的作用显著强于阳性对照药semaglutide、tirzepatide和SAR441255，说明本发明的多肽化合物具有很好的治疗非酒精性脂肪肝病和非酒精性脂肪肝炎的前景。

[0167] 表6：DIO小鼠治疗3周后的血清甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量

[0168] 样品(剂量) 总胆固醇(mmol/L) 甘油三酯(mmol/L)空白对照(生理盐水组) 9.8±1.6 1.7±0.1
*** ***
Semaglutide(10nmol/kg) 7.5±0.4 1.2±0.1
*** ***
Tirzepatide(10nmol/kg) 6.9±0.5 1.1±0.2
** ***
SAR441255(10nmol/kg) 6.2±0.4 1.0±0.1
**,### ***,###
SEQ ID NO:3(10nmol/kg) 5.0±0.2 0.4±0.1

[0169] ***：与空白对照组相比P<0.001；###：与semaglutide、tirzepatide和SAR441255组比P<0.001(One‑Way ANOVA,Tukey post hoc test)，结果表示为每组6只小鼠平均值±SD。

[0170] 如表6结果显示，本发明的多肽化合物在DIO小鼠体内连续给药3周，可以显著降低小鼠的血清甘油三酯和总胆固醇含量，并且本发明的多肽化合物的降低血清脂质(甘油三酯和胆固醇)含量的作用显著强于阳性对照药semaglutide、tirzepatide和SAR441255。

[0171] 实施例16

[0172] 多肽化合物对db/db小鼠糖化血红蛋白(HbA1c)和血糖的影响

[0173] 雄性db/db小鼠，随机分组，每组6只。分别为生理盐水组(空白对照组)、阳性对照组(semaglutide、tirzepatide和SAR441255)和受试样品组(SEQ ID NO:3)。适应性饲养一周后，尾部取血测量治疗开始前初始HbA1c数值和空腹血糖数值。各组小鼠每两天一次皮下注射生理盐水(10mg/kg)，semaglutide(10nmol/kg)，tirzepatide(10nmol/kg)，SEQ ID NO:3(10nmol/kg)，或每天两次皮下注射SAR441255(10nmol/kg)，给药周期35天。治疗结束后小鼠禁食过夜后测量空腹血糖数值，同时取血测量HbA1c(％)数值。

[0174] 表7：db/db小鼠在35天给药周期内的HbA1c(％)变化

[0175]

[0176]

[0177] ***：与空白对照组相比P<0.001；###：与semaglutide、tirzepatide和SAR441255组比P<0.001(One‑Way ANOVA,Tukey post hoc test)，结果表示为每组6只小鼠平均值±SD。

[0178] 如表7结果显示，本发明的多肽化合物在db/db小鼠体内连续给药35天，可以显著降低小鼠的HbA1c数值，并且在治疗后本发明的多肽化合物组小鼠的HbA1c数值显著低于阳性对照semaglutide、tirzepatide和SAR441255，说明本发明的多肽化合物具有很好的血糖控制作用。

[0179] 表8：db/db小鼠在35天给药周期内的空腹血糖变化

[0180] 样品(剂量) 空腹血糖(％)空白对照(生理盐水组) +5.2±0.5％
***
Semaglutide(10nmol/kg) ‑2.1±0.3％
***
Tirzepatide(10nmol/kg) ‑3.9±0.6％
***
SAR441255(10nmol/kg) ‑4.2±0.5％
***,###
SEQ ID NO:3(10nmol/kg) ‑9.3±0.2％

[0181] ***：与空白对照组相比P<0.001；###：与semaglutide、tirzepatide和SAR441255组比P<0.001(One‑Way ANOVA,Tukey post hoc test)，结果表示为每组6只小鼠平均值±SD。

[0182] 如表8结果显示，本发明实施例制备的多肽化合物在db/db小鼠体内连续给药35天，可以显著降低db/db小鼠空腹血糖数值，说明本发明的多肽化合物具有优异的血糖控制作用，并且本发明的多肽化合物的血糖控制作用显著强于阳性对照药semaglutide、tirzepatide和SAR441255。