口服GLP-1类似物固体脂质纳米粒及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了口服GLP‑1类似物固体脂质纳米粒及其制备方法和应用，属于药物制剂领域，所述GLP‑1类似物固体脂质纳米粒包括GLP‑1类似物和包被GLP‑1类似物的脂质材料；由GLP‑1类似物、第一种脂质材料和第二种脂质材料通过溶剂扩散法制成；第一种脂质材料和第二种脂质材料复合能够提升载药量。该固体脂质纳米粒能够保护GLP‑1类似物免受胃肠道破坏，而且凭借肠壁细胞高相容性优势，无需开放肠道屏障，便可实现高效口服吸收，生物安全性好，相较于市售制剂Rybelsus，该固体脂质纳米粒可显著提高GLP‑1类似物的口服生物利用度，降低用药成本，(56)对比文件Neha Shrestha等.The stimulation ofGLP-1 secretion and delivery of GLP-1agonists via nanostructured lipidcarriers《.Nanoscale》.2017,第10卷603–613.

权利要求

1.一种GLP‑1类似物固体脂质纳米粒，其特征在于，所述GLP‑1类似物固体脂质纳米粒包括GLP‑1类似物和包被GLP‑1类似物的脂质材料；由GLP‑1类似物、第一种脂质材料和第二种脂质材料通过溶剂扩散法制成，其中，GLP‑1类似物、第一种脂质材料和第二种脂质材料的质量比为1：2‑19：0.2‑4；所述GLP‑1类似物包括司美格鲁肽或利拉鲁肽；

所述第一种脂质材料为单硬脂酸甘油酯、双硬脂酸甘油酯、硬脂酸、油酸、十八醇、山嵛酸甘油酯中的至少一种，所述第二种脂质材料为阳离子脂质、两性离子脂质或可电离化阳离子脂质中的至少一种；所述第二种脂质材料包括DOTMA、DC‑CHOL、DOTAP、DSPE‑PEG、DODMA、十八胺或DLin‑MC3‑DMA；

所述GLP‑1类似物固体脂质纳米粒的载药量为0.9 10.1wt%。

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2.根据权利要求1所述GLP‑1类似物固体脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）以GLP‑1类似物、第一种脂质材料以及第二种脂质材料为原料制备有机相；以泊洛沙姆水溶液为水相；

（2）将有机相注入水相搅拌扩散，得到负载GLP‑1类似物的固体脂质纳米粒分散液；

（3）调节所述负载GLP‑1类似物的固体脂质纳米粒分散液的pH值或离子强度至目标值，离心，取沉淀，以泊洛沙姆水溶液再分散并保持溶液的pH值为中性，即得所述GLP‑1类似物固体脂质纳米粒。

3.根据权利要求2所述GLP‑1类似物固体脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，所述有机相的制备方法为：称取GLP‑1类似物、第一种脂质材料以及第二种脂质材料溶于有机溶剂，混合均匀后得有机相；或将GLP‑1类似物与第二种脂质材料先制成药脂复合物，再将药脂复合物分散至含有第一种脂质材料的有机溶剂中，混合均匀后得有机相。

4.根据权利要求3所述GLP‑1类似物固体脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂包括甲醇、乙醇或二甲亚砜。

5.根据权利要求1所述GLP‑1类似物固体脂质纳米粒在制备预防和/或治疗糖尿病的药物中的应用。

6.根据权利要求1所述GLP‑1类似物固体脂质纳米粒，其特征在于，所述GLP‑1类似物固体脂质纳米粒经口递送。

说明书

口服GLP‑1类似物固体脂质纳米粒及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于药物制剂领域，具体涉及口服GLP‑1类似物固体脂质纳米粒及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 糖尿病和心血管疾病、呼吸系统疾病并称为三大“慢性杀手”。其中，糖尿病患病人数众多，患病率高，市场规模巨大。国际糖尿病联盟发布的报告显示，2019年全球约有4.63亿20至79岁成人患糖尿病；糖尿病患者数量不断攀升，糖尿病药物需求市场巨大。

[0003] 司美格鲁肽、利拉鲁肽等胰高血糖素样肽‑1(glucagon‑like peptide‑1，GLP‑1)类似物，可促进胰岛素分泌，降低胰高血糖素分泌，避免二肽基肽酶4的酶解，与白蛋白结合半衰期较久，且不会引发低血糖症，相较于传统胰岛素，具有安全、长效的降血糖作用。然而，GLP‑1类似物口服时，药物构象易被胃酸所破坏，因此普遍采用皮下注射的给药方式。直至2019年9月20日，丹麦诺和诺德公司一日一次口服司美格鲁肽片(商品名：Rybelsus)在FDA获批上市，打破了给药限制。

[0004] 然而，目前市场上仍无利拉鲁肽的口服制剂，且Rybelsus本身仍存在一些缺陷。首先，司美格鲁肽吸收程度取决于相配伍的促吸收剂8‑(2‑羟基苯甲酰胺基)辛酸钠(SNAC)的用量，但SNAC频繁开放肠壁屏障所存在的生物安全隐患以及对肠道微生物群的改变仍需进一步关注。此外，Rybelsus的口服剂量是7～14mg/天，皮下注射的剂量是1mg/周，口服的剂量是注射的49～98倍，Rybelsus需要给予高剂量以实现与皮下注射相仿的临床效果，这大大增加了用药成本。)

[0005] 现有技术中，公开号为CN114712488A的中国专利文献公开了一种Dorzagliatin和胰高血糖素样肽‑1类似物的药物组合物，通过将Dorzagliatin多扎格列艾汀与GLP‑1类似物联用来有效控制血糖，提高Dorzagliatin或现有降糖药GLP‑1类似物的降糖功效；公开号为CN106729717A的中国专利文献公开了一种GLP‑1类似物和齐考诺肽组合物缓释微球制剂，该缓释微球制剂包含GLP‑1类似物、齐考诺肽、可生物降解且具生物相容性的高分子材料、稳定剂和冻干保护剂；将GLP‑1类似物和齐考诺肽联合使用，能有效治疗糖尿病及其PDN并发症，明显减轻慢性疼痛而不会产生耐药性，减轻患者痛苦。但上述方法均需要多种药物的联用，不能再根本上解决口服GLP‑1类似物生物利用度低的问题。

[0006] 固体脂质纳米粒(Solid Lipid Nanoparticles,SLN)作为口服纳米给药系统，受到广泛关注。SLN以生物相容性脂质为骨架材料，可吸附或包封多种疏水或亲水药物，具有良好的生理相容性、稳定性、靶向性、可缓控释性等优点，应用前景广泛。开发口服GLP‑1类似物固体脂质纳米粒，有望解决上述现有技术中存在的问题。

发明内容

[0007] 本发明提供了一种GLP‑1类似物固体脂质纳米粒，该固体脂质纳米粒能够保护GLP‑1类似物免受胃肠道破坏，而且凭借肠壁细胞高相容性优势，无需开放肠道屏障，便可实现高效口服吸收，生物安全性好，用药依从性好，在糖尿病预防/治疗领域的应用前景广泛。

[0008] 具体采用的技术方案如下：

[0009] 一种GLP‑1类似物固体脂质纳米粒，所述GLP‑1类似物固体脂质纳米粒包括GLP‑1类似物和包被GLP‑1类似物的脂质材料；由GLP‑1类似物、第一种脂质材料和第二种脂质材料通过溶剂扩散法制成；

[0010] 所述第一种脂质材料为脂肪酸、脂肪醇或脂肪酸甘油酯中的至少一种，包括但不限于单硬脂酸甘油酯、双硬脂酸甘油酯、山嵛酸甘油酯、十八醇、硬脂酸、油酸等的一种或多种组合；所述第二种脂质材料为阳离子脂质、两性离子脂质或可电离化阳离子脂质中的至少一种，包括但不限于包括但不限于1,2‑双十八烯氧基‑3‑甲基铵丙烷(DOTMA)、3β‑[N‑(N',N'‑二甲基胺乙基)氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC‑CHOL)、(1,2‑二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)、卵磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇(DSPE‑PEG)、1,2‑二油醇‑3‑二甲基氨基‑丙烷(DODMA)、十八胺和4‑(N,N‑二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(DLin‑MC3‑DMA)等的一种或多种组合。

[0011] 所述GLP‑1类似物包括但不限于司美格鲁肽、利拉鲁肽等。

[0012] GLP‑1类似物、第一种脂质材料和第二种脂质材料的质量比为1：2‑19：0.2‑4。

[0013] 第二种脂质材料通过静电力，相似相溶性等相互作用，与GLP‑1类似物相复合，进一步提升其脂溶性，帮助多肽与脂质材料形成固体脂质纳米粒，固体脂质纳米粒可有效包封GLP‑1类似物，依托固体脂质纳米粒与肠壁细胞高相容性优势，显著提高GLP‑1类似物的胃肠道稳定性和口服生物利用度，降低用药成本。

[0014] 所述GLP‑1类似物固体脂质纳米粒的粒径为50‑800nm。

[0015] 所述GLP‑1类似物固体脂质纳米粒的载药量为0.1～10.1wt％，优选0.9～8.1wt％。

[0016] 本发明还提供了所述GLP‑1类似物固体脂质纳米粒的制备方法，具体包括以下步骤：

[0017] (1)以GLP‑1类似物、第一种脂质材料以及第二种脂质材料为原料制备有机相；以泊洛沙姆水溶液为水相；

[0018] 优选的，所述有机相的制备方法为：称取GLP‑1类似物、第一种脂质材料以及第二种脂质材料溶于有机溶剂，混合均匀后得有机相；或将GLP‑1类似物与第二种脂质材料先制成药脂复合物，再将药脂复合物分散至含有第一种脂质材料的有机溶剂中，混合均匀后得有机相；

[0019] 所述有机溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、二甲亚砜等的一种或多种组合；

[0020] (2)将有机相注入水相搅拌扩散，得到负载GLP‑1类似物的固体脂质纳米粒分散液；

[0021] (3)调节所述负载GLP‑1类似物的固体脂质纳米粒分散液的pH值或离子强度至目标值使固体脂质纳米粒沉淀(pH的目标值为0.8～1.2，离子强度的目标值为4.0～4.5mol/L)，进一步离心，取沉淀，以泊洛沙姆水溶液再分散并保持溶液的pH值为中性，即得所述GLP‑1类似物固体脂质纳米粒。

[0022] 本发明还提供了所述GLP‑1类似物固体脂质纳米粒在制备预防和/或治疗糖尿病的药物中的应用。

[0023] 优选的，所述GLP‑1类似物固体脂质纳米粒经口递送。

[0024] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

[0025] (1)本发明提供的GLP‑1类似物固体脂质纳米粒以肠壁细胞高相容性脂质为载体材料，高效包封多肽药物GLP‑1类似物。该固体脂质纳米粒不仅保护GLP‑1类似物免受胃肠道破坏，而且凭借肠壁细胞高相容性优势，无需开放肠道屏障，便可实现高效口服吸收，避免因频繁开放肠道屏障所带来的生物安全隐患。此外，该固体脂质纳米粒可帮助患者摆脱注射焦虑，提高用药依从性。

[0026] (2)市售注射用司美格鲁剂量1mg/周，市售口服司美格鲁肽片(商品名：Rybelsus)剂量7～14mg/天，口服片剂需要给与49～98倍的剂量，实现与皮下注射相当的效果，口服相对生物利用度极低，而本发明中GLP‑1类似物固体脂质纳米粒相对于GLP‑1类似物皮下注射剂的生物利用度达到9.5％～12.0％，远超市售制剂；也即该固体脂质纳米粒可显著提高GLP‑1类似物的口服生物利用度，降低用药成本，增加GLP‑1类似物在糖尿病治疗领域的应用前景。

附图说明

[0027] 图1为实施例1中处方3司美格鲁肽固体脂质纳米粒粒径分布与Zeta电位图，其中，A为粒径分布图，B为Zeta电位图。

[0028] 图2为实施例1中处方3司美格鲁肽固体脂质纳米粒透射电镜图。

[0029] 图3为正常ICR小鼠口服实施例1中处方3司美格鲁肽固体脂质纳米粒后口服葡萄糖耐量测试结果图。

[0030] 图4为实施例1中处方7利拉鲁肽固体脂质纳米粒粒径分布与Zeta电位图，其中，A为粒径分布图，B为Zeta电位图。

[0031] 图5为Ⅱ型糖尿病小鼠口服实施例1中处方7利拉鲁肽固体脂质纳米粒后体内血糖变化图。

具体实施方式

[0032] 下面结合实施例与附图，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。

[0033] 实施例1GLP‑1类似物固体脂质纳米粒的制备

[0034] 处方1～9：按照下述配方和方法制备所述GLP‑1类似物固体脂质纳米粒，参见表1。

[0035] 法一：称取GLP‑1类似物溶于磷酸盐水溶液得水溶液，处方量的第二类脂质材料溶于甲醇或乙醇得有机溶液，将水溶液与有机溶液复合后，旋蒸除去溶剂，得药脂复合物；将药脂复合物分散至含有处方量第一类脂质材料的有机溶剂中，得有机相；以泊洛沙姆水溶液为水相，将有机相注入水相搅拌扩散，得负载GLP‑1类似物的固体脂质纳米粒分散液；

[0036] 法二：称取处方量的GLP‑1类似物、第一类脂质材料以及第二类脂质材料溶于有机溶剂，涡旋混合，得有机相；以泊洛沙姆水溶液为水相，将有机相注入水相搅拌扩散，得负载GLP‑1类似物的固体脂质纳米粒分散液。

[0037] 取法一或法二所制得的负载GLP‑1类似物的固体脂质纳米粒分散液，以盐酸溶液调节pH至0.8～1.2，或者用氯化钠溶液调节离子强度至4.0～4.5mol/L，离心，取沉淀，以泊洛沙姆水溶液再分散并保持溶液的pH值为中性，即得目标物。

[0038] 表1负载GLP‑1类似物的固体脂质纳米粒的制备方法与处方组成

[0039]

[0040] 实施例2GLP‑1类似物固体脂质纳米粒的制备的理化性质

[0041] 取实施例1中各处方所制备的GLP‑1类似物固体脂质纳米粒，以泊洛沙姆水溶液为稀释剂，稀释至0.1mg/mL浓度，使用微粒粒度与表面电位分析仪测定其粒径与Zeta电位。

[0042] 利用高效液相色谱法测定实施例1中各处方所制备的GLP‑1类似物固体脂质纳米粒中GLP‑1类似物的包封率与载药量。

[0043] 司美格鲁肽的色谱条件：色谱柱：碳18柱；流动相：流动相A(90％NH4H2PO4水溶液+10％乙腈)：流动相B(20％水+60％乙腈+20％异丙醇)＝37:63(v/v)；柱温：30℃；检测波长：
210nm；流速：1mL/min；进样量：20μL。

[0044] 利拉鲁肽的色谱条件：色谱柱：碳18柱；流动相：流动相A(乙腈+0.1％三氟乙酸)：流动相B(水+0.1％三氟乙酸)＝53:47(v/v)；柱温：25℃；检测波长：220nm；流速：1mL/min；
进样量：20μL。

[0045] 取固体脂质纳米粒适量，流动相稀释20倍，按上述液相色谱条件测得GLP‑1类似物药物量W，分别按式(1)和式(2)计算GLP‑1类似物包封率与载药量：

[0046] GLP‑1类似物包封率(％)＝W/W总投药量×100％式(1)

[0047] GLP‑1类似物载药量(％)＝W/(W+第一类脂质材料用量+第二类脂质材料用量)×100％式(2)

[0048] 经测定，实施例1中各处方所制备的GLP‑1类似物固体脂质纳米粒的粒径、Zeta电位、包封率、载药量等理化性质结果，如表2所示。

[0049] 表2实施例1中各处方所制备的GLP‑1类似物固体脂质纳米粒的理化性质

[0050]

[0051] 实施例3实施例1中处方3制得的司美格鲁肽固体脂质纳米粒的性质、形貌与药效考察

[0052] 取实施例1中处方3所制备的司美格鲁肽固体脂质纳米粒，以泊洛沙姆水溶液为稀释剂，稀释至0.1mg/mL浓度，使用微粒粒度与表面电位分析仪测定其粒径与Zeta电位。经测定，该负载司美格鲁肽的固体脂质纳米粒的粒径为75.5±3.0nm，Zeta电位为40.8±0.9mV，其粒径分布与Zeta电位结果分别参见图1中的A和B。

[0053] 取该司美格鲁肽固体脂质纳米粒，以泊洛沙姆水溶液为稀释剂，稀释至0.1mg/mL浓度，吸取20μL滴于铜网上，晾干，2％(w/v)磷钨酸染色，滤纸吸干磷钨酸；高分辨率透射电镜观察形态与结构，结果如图2所示，该司美格鲁肽固体脂质纳米粒呈球形，外形规整，粒度分布均匀。

[0054] 高效液相色谱法测定该司美格鲁肽固体脂质纳米粒的包封率与载药量，其中色谱条件与计算方法同实施例2。经测定，该该司美格鲁肽固体脂质纳米粒的包封率为78.6％，载药量为5.2wt％。

[0055] 利用正常ICR小鼠口服葡萄糖耐量试验考察实施例1中处方3所制备的司美格鲁肽固体脂质纳米粒的体内降糖药效：取20‑25g雄性ICR小鼠若干，每组5只，禁食不禁水过夜，次日上午采集小鼠尾静脉血，Omron HGM‑112血糖仪测定空腹血糖值。葡萄糖灌胃前1h给药(对照组：生理盐水灌胃；皮下注射组：皮下注射司美格鲁肽；口服组：口服实施例1中处方3制备的司美格鲁肽固体脂质纳米粒)，随后按葡萄糖2g/kg灌胃，分别在葡萄糖灌胃后5、10、15、30、45、60、120min这7个时间点检测小鼠血糖值，比对各组小鼠血糖变化曲线，以此评价该负载司美格鲁肽的固体脂质纳米粒的体内降血糖药效。其结果参见图3。

[0056] 如图3所示，小鼠单次口服司美格鲁肽固体脂质纳米粒可实现与皮下注射剂相同的降糖效果，这表明该口服司美格鲁肽固体脂质纳米粒可成为司美格鲁肽皮下注射剂良好的替代产品，帮助患者摆脱注射焦虑，提高用药依从性，显示出在糖尿病治疗领域的良好应用前景。

[0057] 实验组与对照组之间血糖水平‑时间曲线下面积(Area under the curve,AUC)的差值可反映小鼠口服葡萄糖耐量试验的降糖药效，根据GraphPad Prism 8计算所得的血糖水平‑时间曲线下面积的差值可计算相对生物利用度(F)，计算方法如下式(3)所示：

[0058] F(％)＝{[AUC(0‑t)对照组‑AUC(0‑t)口服组]×Dose皮下注射组}/{[AUC(0‑t)对照组‑AUC(0‑t)[0059] 皮下注射组]×Dose口服组}×100％式(3)

[0060] 其中，AUC(0‑t)表示0至t时间内经计算得到的AUC值，对照组表示生理盐水灌胃组，皮下注射组表示皮下注射司美格鲁肽溶液组，口服组表示口服司美格鲁肽固体脂质纳米粒组，Dose表示司美格鲁肽的给药量。

[0061] 根据血糖水平‑时间曲线曲线下面积AUC(0‑2h)的差值计算，该司美格鲁肽固体脂质纳米粒相对于司美格鲁肽皮下注射剂的生物利用度达到9.5％，远超文献报道的市售制剂Rybelsus的口服生物利用度。

[0062] 实施例4实施例1中处方7制得的利拉鲁肽固体脂质纳米粒的性质与药效考察

[0063] 取实施例1中处方7所制备的利拉鲁肽固体脂质纳米粒，以泊洛沙姆水溶液为稀释剂，稀释至0.1mg/mL浓度，使用微粒粒度与表面电位分析仪测定其粒径与Zeta电位。经测定，该负载利拉鲁肽类似物的固体脂质纳米粒的粒径为60.5±2.0nm，Zeta电位为29.6±1.2mV，其粒径分布与Zeta电势结果分别参见图4中的A和B。

[0064] 高效液相色谱法测定固体脂质纳米粒中利拉鲁肽的包封率与载药量，其中色谱条件与计算方法同实施例2。经测定，该负载利拉鲁肽的固体脂质纳米粒的包封率为69.8％，载药量为4.6wt％。

[0065] 考察实施例1中处方7所制备的利拉鲁肽固体脂质纳米粒在Ⅱ型糖尿病小鼠体内的降糖药效：取若干只高脂高糖喂养4周的KM鼠称体重后，按50mg/kg的剂量称取链脲佐菌素，0.1M枸橼酸缓冲液(pH＝4.5)溶解，立即腹腔注射到小鼠体内，连续注射5天，饲养两周后，血糖值高于11.1mmol/L小鼠即为Ⅱ型糖尿病小鼠，用于后续实验；将Ⅱ型糖尿病小鼠随机分成3组，每组5只，分别为：模型对照组、皮下注射组、口服组，给药前禁食12h，不禁水。其中，模型对照组不进行利拉鲁肽治疗，灌胃生理盐水；皮下注射组皮下注射利拉鲁肽，口服组灌胃实施例1中处方7制备的利拉鲁肽固体脂质纳米粒，定时采集小鼠尾静脉血，Omron HGM‑112血糖仪测定血糖值变化。比对各组小鼠血糖变化曲线，以此评价该利拉鲁肽固体脂质纳米粒的体内降血糖药效，结果参见图5。

[0066] 如图5所示，空白对照组小鼠血糖在24小时内一直处于高血糖水平，皮下注射组和口服组均在6小时内血糖降至低点，后续血糖缓慢回升。此外，与皮下注射组相比，口服纳米粒组的药效更温和，维持时间更久。

[0067] 将初始的血糖值作为基线，根据GraphPad Prism 8计算初始血糖百分比‑时间曲线上面积(Area above the curve,AAC),以皮下注射组的AAC为对照，可计算相对生物利用度(F)，计算方法如下式(4)所示：

[0068] F(％)＝{[AAC(0‑t)口服组]×Dose皮下注射组}/{[AAC(0‑t)皮下注射组]×Dose口服组}×[0069] 100％式(4)

[0070] 其中，AAC(0‑t)表示0至t时间内经计算得到的AAC值，皮下注射组为皮下注射利拉鲁肽溶液组，口服组为口服利拉鲁肽固体脂质纳米粒组，Dose为利拉鲁肽的给药量。

[0071] 根据初始血糖百分比‑时间曲线上面积计算，该利拉鲁肽固体脂质纳米粒相对于利拉鲁肽皮下注射剂的生物利用度高达12.0％。

[0072] 上述结果均表明，本发明能显著提高GLP‑1类似物的口服生物利用度，降低用药成本，为口服多肽的进一步推广应用提供可能，进而缓解患者注射焦虑，提高用药依从性，在糖尿病治疗领域具备广阔应用前景。

[0073] 以上所述实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。