一种方格星虫酶解液的应用

摘要

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种方格星虫酶解液的应用。具体技术方案为：一种方格星虫酶解液的应用，所述方格星虫酶解液在制备治疗慢性肾病药物中的应用，可显著地改善顺铂导致的慢性肾病的肾功能损伤，且对动物无毒无副作用，不会在动物体内富集，其本身还可以参与新陈代谢，当摄取到人体后不会造成危害，具有显著经济社会贡献。

权利要求

1.一种方格星虫酶解液的应用，其特征在于：所述方格星虫酶解液在制备治疗慢性肾病药物中的应用；所述慢性肾病为顺铂诱导损伤的慢性肾病，所述方格星虫酶解液为＞

50KDa的超滤组分；

所述方格星虫酶解液的制备过程为：将方格星虫清洗破碎后，加水，用蛋白酶进行酶解，取上清液过超滤膜，滤液浓缩、干燥后即得方格星虫酶解液超滤组分；

加入水的体积为方格星虫质量的7～12倍，pH为7～8，所述蛋白酶为胰蛋白酶，所述蛋白酶的质量是方格星虫质量的0.2～0.7％，酶解条件为45±2℃下，1000rmp，酶解4h，酶解终止条件为升温至60℃，保持30min，对料液离心后，所得上清液即为方格星虫酶解液；所述方格星虫酶解液逐级通过50KDa和2.5KDa超滤膜后获得方格星虫酶解液超滤组分。

2.根据权利要求1所述的一种方格星虫酶解液的应用，其特征在于：将所述超滤组分通过反渗透膜脱盐浓缩，在‑86℃下冷冻干燥，制成粉剂后于‑20℃下保存。

说明书

一种方格星虫酶解液的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种方格星虫酶解液的应用。

背景技术

[0002] 慢性肾病(chronic kidney disease,CKD)现已成为威胁世界公共健康的主要疾病之一。慢性肾病的定义是肾小球滤过率的降低或是有慢性肾脏损害的迹象,其病理特征是出现肾小球硬化、间质纤维化、炎症、损伤、萎缩和小管上皮细胞以及管周毛细血管的减少。慢性肾病如未能及时有效救治，导致病情恶化进展，则随病程迁延，慢性肾病患者将发展成为慢性肾功能不全、肾衰竭，最终形成尿毒症。现代医学针对CKD治疗主要是消除肾损伤的可逆性因素和治疗原发病，多采用激素、利尿剂、免疫抑制剂等进行治疗，患者长期使用产生药物依赖性、不敏感性等不良反应及并发症，反复影响CKD治疗效果。目前CKD临床疗效有限，无法满足实际治疗预期。近年来，中药由于具有靶点广，毒副作用低的特点在防治慢性肾病上越来越引起人们的注意。

[0003] 方格星虫(Sipunculusnudus)，又名光裸星虫、沙虫等，属星虫科方格星虫属。方格星虫肉质鲜美，营养丰富，素有“海洋冬虫夏草”之称。据《中华海洋本草》记载，方格星虫味咸、性寒，归肺、肾经，具有滋阴降火、清肺补虚、活血强身及补肾养颜之功效。沿海民间更有应用沙虫煨粥治疗小儿遗尿和肾病水肿，提示方格星虫可能有保护肾脏的功能。

[0004] 现代药理学研究发现海洋星虫多肽具有抗辐射、抗缺氧、加速伤口愈合、调节免疫功能、抗氧化、抗肿瘤，抗血栓及抗炎等特性，具有很高的临床应用研究价值。目前应用现代医学对方格星虫药用价值的研究刚刚起步，而毒理学研究证明其几乎没有毒性作用，这些初步的研究结果显示方格星虫有广阔的药用开发前景。而用酶解物‑来自于方格星虫的酶解物，作为防治慢性肾病的药物，迄今尚未见文献报道。因此，研制防治慢性肾病的方格星虫的生物活性肽及其应用具有十分重要的意义与价值。

发明内容

[0005] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种方格星虫酶解液的应用，可显著地改善顺铂导致的慢性肾病的肾功能损伤，且对动物无毒无副作用，不会在动物体内富集，其本身还可以参与新陈代谢，当摄取到人体后不会造成危害，具有显著经济社会贡献。

[0006] 为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

[0007] 本发明公开了一种方格星虫酶解液的应用，所述方格星虫酶解液在制备治疗慢性肾病药物中的应用。

[0008] 优选的，所述方格星虫酶解液的制备过程为：将方格星虫清洗破碎后，加水，用蛋白酶进行酶解，取上清液过超滤膜，滤液浓缩、干燥后即得方格星虫酶解液超滤组分。

[0009] 优选的，加入水的体积为方格星虫质量的7～12倍，pH为7～8。

[0010] 优选的，所述蛋白酶为胰蛋白酶，所述蛋白酶的质量是方格星虫质量的0.2～0.7％。

[0011] 优选的，酶解条件为45±2℃下，1000rmp，酶解4h，酶解终止条件为升温至60℃，保持30min，对料液离心后，所得上清液即为方格星虫酶解液。

[0012] 优选的，所述方格星虫酶解液逐级通过超滤膜后获得方格星虫酶解液超滤组分。

[0013] 优选的，将所述超滤组分通过反渗透膜脱盐浓缩，在‑86℃下冷冻干燥，制成粉剂后于‑20℃下保存。

[0014] 本发明具备以下有益效果：

[0015] 1.本发明通过合适的酶解条件制备方格星虫酶解液，逐级通过超滤膜获得方格星虫酶解产物超滤组分。在顺铂诱导肾小管上皮HK‑2细胞损伤模型上，评价三个超滤组分对顺铂诱导的HK‑2细胞损伤的保护作用。最后选取细胞实验活性最佳的组分验证该其在顺铂诱导的慢性肾病模型上是否存在活性，并通过探究其对NF‑κB信号通路蛋白表达的影响。进一步了解方格星虫酶解产物在顺铂所致的肾毒性的防治作用，为今后的临床应用提供实验依据。

[0016] 2.本发明在医药方面，在顺铂诱导的的C57BL/6慢性肾病模型上 (10mg/kg剂量每周注射4周，连续4周)，方格星虫酶解产物超滤组分F‑Ⅲ在低中高剂量都能抑制顺铂诱导导致的血尿素氮和肌酐升高，并且呈现一定的剂量依赖关系。结果提示，超滤组分F‑Ⅲ能够有效逆转顺铂引起的肾功能损伤。此外病理染色结果也表明方格星虫酶解产物超滤组分F‑Ⅲ能改善顺铂损伤导致的肾小管上皮细胞损伤，炎性浸润，肾小管肿胀、肾小管扩张等现象以及肾脏组织纤维性。因此，方格星虫酶解产物可显著地改善顺铂导致的慢性肾病的肾功能损伤，且对动物无毒无副作用，不会在动物体内富集，其本身还可以参与新陈代谢，当摄取到人体后不会造成危害，具有显著经济社会贡献，可推动活性肤生物产品在功能食品行业和医药行业的快速发展。

附图说明

[0017] 图1是方格星虫各超滤组分对HK‑2细胞的毒性；

[0018] 图2是方格星虫各超滤组分对顺铂损伤的HK‑2细胞活力的影响；

[0019] 图3是超滤组分对顺铂损伤的HK‑2细胞凋亡的影响；

[0020] 图4是各超滤组分对顺铂损伤下细胞内ROS水平的影响；

[0021] 图5是超滤组分F‑Ⅰ对HK‑2细胞NF‑κB p65、p‑NF‑κB p65和Iκ b‑α、p‑Iκb‑α蛋白表达；

[0022] 图6是超滤组分F‑Ⅰ对慢性肾病小鼠血液肌酐的影响；

[0023] 图7是超滤组分F‑Ⅰ对慢性肾病小鼠血液尿素氮的影响；

[0024] 图8是超滤组分F‑Ⅰ对慢性肾病小鼠肾组织HE染色结果；

[0025] 图9是超滤组分F‑Ⅰ对慢性肾病小鼠肾组织Masson三元染色结果。

具体实施方式

[0026] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0027] 本实施例中采用的材料与试剂如下：新鲜方格星虫购于广东省湛江市东风水产品市场；超滤膜(50、2.5kDa)以及无菌滤膜(0.22μM)购自德国密理博公司；NaOH(500g/瓶)，盐酸购自广州化学试剂厂；中性蛋白酶 (30000U/g)购置广西南宁庞博生物工程有限公司；HK‑2细胞购自于苏州北纳创联生物技术有限公司；CCK‑8试剂盒购自日本同仁化学研究所； DEME(Dulbecco's modified eagle medium)高糖培养基和胎牛血清(Fetal Bovine 
Serum,FBS)购自Gibco；0.25％胰酶购自Hyclone公司；96孔、24 孔、6孔细胞培养板，25T细胞培养瓶以及细胞冻存管购自Corning公司；不含EDTA胰蛋白酶溶液(Solarbio)；Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)购自Gibco(Invitrogen,GrandIsland,NY)；青链霉素混合液 (Solarbio)；CCK8试剂(碧云天)；姜黄素(纯度≥98％，源叶)；PMA/Ionomycin Mixture(250×)(MultiSciences)；RIRA裂解液(碧云天)；PMSF(碧云天)；磷酸酶抑制剂混合物A(碧云天)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)； SDS‑PAGE蛋白上样缓冲液(碧云天)；
NF‑κB p65(SC‑8008)，磷酸化NF‑κ B p65(SC‑136548)，Iκb‑α(SC‑1643)、磷酸化Iκb‑α(SC‑
8403)均购自Santa Cruz公司；GAPDH和HRP标记山羊抗大鼠二抗购自赛维尔生物； BeyoECL Moon(极超敏ECL化学发光试剂盒)(碧云天)。

[0028] 本实施例中采用的仪器设备如下：二氧化碳培养箱(Thermo)；倒置相差显微镜(OLYMPUS)；微孔板分光光度计(Epoch)；IXploreSpinSR转盘超分辨激光共聚焦显微镜(OLYMPUS)；CYTATION5多功能微孔板检测系统 (BIOTEK)；Mithras LB940多功能酶标仪。

[0029] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

[0030] 实施例1方格星虫酶解液超滤组分的制备方法

[0031] (1)将新鲜的方格星虫原料，翻沙洗净，用绞肉机绞2遍，绞成肉泥；在酶解罐内预放与新鲜方格星虫1：10的纯水(1kg新鲜方格星虫按10L水加)，升温至50℃，加入搅碎的星虫肉泥，以1％氢氧化钠溶液调节pH值至 7.5，添加50g胰蛋白酶粉溶成浆状(其总加入质量是新鲜方格星虫的质量的0.5％)，缓慢加入星虫液中，维持温度为45℃(±2℃)，搅拌酶解；

[0032] (2)酶解期间，每小时监测pH，取样，10000r/min离心10min，取上清液测定540nm波长处的吸光值，记录吸光度数值，根据pH值变化，酶解 2小时左右后，以1％氢氧化钠溶液调节pH值至7.5。继续酶解2小时后，升温至60℃，保温30分钟灭酶，终止酶解，并在4℃下冷藏。

[0033] (3)使用管式高速离心机对料液进行离心处理，将离心的上清液逐级通过50KDa和2.5Kda超滤膜。获得＞50KDa(F‑Ⅰ)，2.5～50KDa(F‑Ⅱ)和＜2.5KDa(F‑Ⅲ)三个超滤组分。三个组分通过反渗透膜浓缩后，再经过真空冷冻干燥机中冷冻干燥，获得方格星虫酶解产物的三个超滤组分。

[0034] 实施例2方格星虫酶解超滤组分对顺铂损伤的肾上皮HK‑2细胞的保护作用

[0035] (1)超滤组分的细胞毒性测定

[0036] 将生长良好的HK‑2细胞制备成的细胞悬液，按每孔100μL接种于96 孔板(5000个/孔)。24h后加入不同浓度(31.25μg/mL、62.5μg/mL、 125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL)的超滤组分处理HK‑2细胞，再培养 24h，加入CCK8试剂10μL，检测450nm处的吸光度值。

[0037] 如图1所示：在31.25～500μg/mL浓度范围内，三个超滤组分均对HK‑2 细胞没有细胞毒性，相反能促进细胞的增殖，其中在31.25～250μg/mL浓度范围内，F‑Ⅰ和F‑Ⅱ能将HK‑2细胞活力提高到对照组的1.5倍以上。

[0038] (2)超滤组分对顺铂损伤的HK‑2细胞的保护作用

[0039] 将生长良好的HK‑2细胞制备成的细胞悬液，按每孔100μL接种于96 孔板(5000个/孔)，放入细胞培养箱，24h后加入不同浓度的顺铂(2.5μg/mL、 4μg/mL、5μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、16μg/mL、20μg/mL)，放入细胞培养箱孵育24h，加入CCK8试剂10μL，用微孔板分光光度计测450nm 处的吸光度，筛选顺铂损伤浓度。

[0040] 将HK‑2细胞分为11组，分别为空白对照组(NC组)、顺铂组(模型组)、超滤组分(F‑Ⅰ，F‑Ⅱ，F‑Ⅲ)低剂量组、超滤组分(F‑Ⅰ，F‑Ⅱ，F‑Ⅲ)中剂量组、超滤组分(F‑Ⅰ，F‑Ⅱ，F‑Ⅲ)高剂量组。除空白组外，其余10组均予以顺铂。低中高剂量超滤组分进行干预24h，空白组不予以处理。放入细胞培养箱孵育24h，加入CCK8试剂10μL，用微孔板分光光度计测450nm 处的吸光度。

[0041] 如图2所示：在2.5μg/mL～20μg/mL浓度范围内，顺铂对HK‑2细胞活力有明显抑制作用(p＜0.05)，且呈剂量效应。顺铂在10μg/mL浓度时，细胞活力为空白对照组细胞活力的0.63倍左右，我们选择此浓度的顺铂对HK‑2细胞进行损伤。如图1所示，对顺铂损伤的HK‑2细胞中加入低中高剂量(31.25μg/mL、62.5μg/mL、125μg/mL)的方格星虫蛋白酶解产物超滤组分F‑Ⅰ、F‑Ⅱ和F‑Ⅲ处理24h后，这三个超滤组分均对顺铂损伤的HK‑2细胞活力具有保护作用，其中F‑Ⅰ和F‑Ⅱ在大于31.25μg/mL后就能显著地提升顺铂损伤后细胞的活力，能将HK‑2细胞的活力恢复到对照的水平。顺铂损伤后的HK‑2细胞，加入31.25μg/mL F‑Ⅰ处理，能将HK‑2的细胞活力由对照组的0.72倍提升到对照组的1.12倍。由图1可知，超滤组分F‑Ⅰ对顺铂损伤后的HK‑2细胞活力的保护作用最好。

[0042] (3)超滤组分对顺铂损伤的HK‑2细胞凋亡的影响

[0043] 把HK‑2细胞培养于24孔板中，24h后，将HK‑2细胞分为6组，分别为空白对照组(NC组)、顺铂组、顺铂+超滤组分组(F‑Ⅰ，F‑Ⅱ，F‑Ⅲ)、顺铂+姜黄素组。除空白对照组外，其余5组均予以顺铂，其中姜黄素做阳性对照。24h后，吸除细胞培养液，加入PBS洗涤一次。每孔加入195μLAnnexin V‑FITC结合液。然后加入5μLAnnexin V‑FITC，轻轻混匀，再加入10μl 碘化丙啶染色液，轻轻混匀。室温(20‑25℃)避光孵育10‑20分钟，随后置于冰浴中。可以使用铝箔进行避光。随即在转盘超分辨激光共聚焦显微镜下观察，拍照记录。

[0044] 用Annexin V‑EGFP和碘化丙啶染色后，正常的活细胞不被Annexin V‑EGFP和碘化丙啶染色；凋亡早期的细胞仅被Annexin V‑EGFP染色，碘化丙啶染色呈阴性；坏死细胞和凋亡晚期的细胞可以同时被Annexin V‑EGFP和碘化丙啶染色。如图3所示：在10μg/mL顺铂损伤下，细胞出现大量凋亡和坏死情况，可见为大量被Annexin V‑EGFP(绿色荧光)和碘化丙啶(红色荧光)染色的细胞。对顺铂损伤的HK‑2细胞中加入125μg/mL各超滤组分处理24h后，HK‑2细胞出现的凋亡和坏死现象均得到了明显地改善，其中加入F‑Ⅰ处理后，HK‑2的细胞凋亡情况基本恢复到空白对照组的水平，比10μM 的阳性对照药物姜黄素效果更好。

[0045] (4)超滤组分对顺铂损伤的HK‑2细胞ROS的抑制作用

[0046] 将HK‑2细胞分为6组，分别为空白对照组(NC组)、顺铂组、顺铂+超滤组分组(F‑Ⅰ，F‑Ⅱ，F‑Ⅲ)、顺铂+姜黄素组。除空白对照组外，其余5 组均予以顺铂。按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH‑DA，使终浓度为10 微摩尔/升。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH‑DA。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养基洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH‑DA。在荧光显微镜下拍照记录DCF的荧光信息强度或如活性氧检测试剂盒所示，收集细胞后使用488nm激发波长，525nm发射波长，用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

[0047] ROS介导的氧化应激和细胞凋亡在顺铂诱导的肾损伤的发生发展中起着重要作用。如图4所示，在10μg/mL顺铂损伤下，经荧光探针染色后， HK‑2细胞内可见大量的绿色荧光，表明顺铂损伤HK‑2细胞，导致其细胞内大量的ROS的积累。对顺铂损伤的HK‑2细胞中加入125μg/mL各超滤组分处理细胞24h后，各超滤组分均能抑制HK‑2细胞内ROS的产生，HK‑2细胞内的绿色荧光强度明显下降。阳性对照药物姜黄素则能将顺铂损伤的HK‑2 细胞的ROS水平本恢复到空白对照组的水平。

[0048] (5)超滤组分对顺铂损伤的HK‑2细胞NF‑κB炎症信号通路

[0049] Western blotting检测NF‑κB p65、p‑p65和Iκb‑α、p‑Iκb‑α的总蛋白水平。将细胞接种到六孔板中，分为五组：空白对照组、顺铂组、顺铂+F‑Ⅰ低剂量组、顺铂+F‑Ⅰ高剂量组、顺铂+姜黄素组。培养24h后，加入裂解液(并加入1mM蛋白酶抑制剂和1×磷酸酶抑制剂混合物A)，冰上裂解三十分钟，然后将样品以14000rpm的速度离心15分钟。取上清并加入上样缓冲液(5×)，金属浴变性95℃，10min。采用BCA蛋白检测试剂盒(碧云天)定量检测蛋白浓度。用10％十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS‑PAGE)提取并分离蛋白，转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用封闭液封闭膜2h，用NF‑κB p65、p‑NF‑κB p65、Iκb‑α、p‑Iκb‑α和 GAPDH(1:1000)的一抗4℃孵育过夜。洗涤后，将膜与二抗(1:8000)在室温下孵育1小时，根据制造商的说明，使用BeyoECL Moon(极超敏ECL化学发光试剂盒)观察条带。

[0050] 如图5所示：与空白对照组相比，顺铂损伤的HK‑2细胞后，NF‑κB信号通路中的p65激活，其磷酸化水平增高至空白对照组的200％左右，加入超滤组分F‑Ⅰ处理后能显著抑制p65的过度磷酸化，且呈现出剂量依赖关系。阳性对照药物姜黄素也能极显著地抑制NF‑κB信号通路中的p65蛋白的磷酸化。与p65的趋势一致，顺铂处理HK‑2细胞后，NF‑κB信号通路中的Iκb‑α蛋白被激活，Iκb‑α磷酸化水平升高至空白对照组的210％左右，加入F‑Ⅰ超滤组分后，被顺铂损伤的HK‑2磷酸化水平降至空白对照组的 150％左右。值得注意的是阳性对照药物姜黄素对Iκb‑α的激活没有抑制作用。

[0051] 本实施案例表明：通过酶解方格星虫获得方格星虫蛋白酶解产物，逐级通过50Kda、2.5KDa分子筛超滤后，共截留出3个超滤组分F‑Ⅰ，F‑Ⅱ， F‑Ⅲ。在顺铂诱导HK‑2细胞炎症模型上：超滤组分F‑Ⅰ和F‑Ⅱ能提高顺铂损伤后的HK‑2细胞的细胞活力。进一步的研究表明：F‑Ⅰ和F‑Ⅱ能够抑制顺铂诱导HK‑2细胞凋亡和细胞内ROS产生。NF‑κB激活还与ROS生成增加有关，并调节包括细胞凋亡在内的各种细胞反应。

[0052] 实施例3方格星虫酶解超滤组分F‑Ⅰ对慢性肾病小鼠的肾功能的保护作用

[0053] (1)慢性肾病小鼠模型的建立及动物分组

[0054] 每周一次，连续四周对小鼠进行腹腔注射顺铂(第一次和第二次注射剂量为10mg/kg，第三次和第四次注射剂量为7mg/kg)，空白组注射生理盐水。

[0055] 将成年雄性小鼠随机分为以下组(N＝每组8只)：具体分组如下：空白对照组：给予灌胃0.05％羧甲基纤维素(CMC)，腹腔注射0.9％生理盐水；

[0056] 模型组：每周腹腔注射顺铂溶液(10mg/kg)+每天0.05％羧甲基纤维素 (CMC)灌胃；

[0057] 姜黄素组：每周腹腔注射顺铂溶液(10mg/kg)+每天姜黄素(200mg/kg) 灌胃；

[0058] F‑Ⅰ组分高剂量给药组：每周腹腔注射顺铂溶液(10mg/kg)+每天F‑Ⅰ组分(1g/kg)灌胃；

[0059] F‑Ⅰ组分中剂量给药组：每周腹腔注射顺铂溶液(10mg/kg)+每天F‑Ⅰ组分(500mg/kg)灌胃；

[0060] F‑Ⅰ组分低剂量给药组：每周腹腔注射顺铂溶液(10mg/kg)+每天F‑Ⅰ组分(100mg/kg)灌胃；

[0061] 实验周期为4周，注射顺铂造慢性肾病小鼠模型，同时灌胃给药处理4 周。

[0062] (2)检测小鼠血液的肌酐和尿素氮的水平评价方格星虫酶解超滤组分对慢性肾病小鼠的肾功能的保护作用。

[0063] (3)HE染色和Masson三元染色用于组织病理学分析。

[0064] 本案例实施发现在顺铂诱导的的C57BL/6慢性肾病模型上，如图6所示：方格星虫酶解产物超滤组分F‑Ⅰ在低中高剂量都能抑制顺铂诱导导致的血肌酐升高，并且呈现一定的剂量依赖关系。如图7所示：方格星虫酶解产物超滤组分F‑Ⅰ在中剂量都能抑制顺铂诱导导致的尿素氮升高。结果提示，超滤组分F‑Ⅰ能够有效逆转顺铂引起的肾功能损伤。

[0065] 如图8所示：HE病理染色结果也表明方格星虫酶解产物超滤组分F‑Ⅰ能改善顺铂损伤导致的肾脏组织及肾小管上皮细胞损伤，炎性浸润，肾小管肿胀、肾小管扩张等现象。

[0066] 如图9所示：Masson三元染色结果也表明方格星虫酶解产物超滤组分 F‑Ⅰ能改善顺铂损伤导致的肾脏组织的纤维化。

[0067] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。