一种futCB突变体及生物合成2’-岩藻糖基乳糖的方法

摘要

本发明公开了一种futCB突变体以及生物合成2’‑岩藻糖基乳糖的方法，通过酶的定向进化技术筛选得到了比野生型futCB催化效率显著提高的futCB(A61Q)突变体，通过基因编辑技术对大肠杆菌基因组进行改造，敲除wcaj、LcaZ、nudD和nudK基因，futCB突变体的编码核酸被插入到wcaj位点，通过质粒瞬转的方式导入manB、manC、gmD和wcaG基因和futCB突变体的编码核酸，得到基因工程菌株。经过发酵条件的进一步调整、优化，显著提高了2’‑岩藻糖基乳糖的发酵产量。

权利要求

1.一种futCB突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述futCB突变体的编码核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种载体，其包含如权利要求2所述的编码核酸。

4.一种微生物，其包含如权利要求2所述编码核酸或如权利要求3所述载体。

5.如权利要求4所述的微生物，其特征在于：所述微生物为细菌。

6.如权利要求5所述的微生物，其特征在于：所述细菌为大肠杆菌。

7.如权利要求6所述的微生物，其特征在于：所述大肠杆菌基因组中的wcaj、LcaZ、nudD和nudK基因被敲除，并且所述的futCB突变体的编码核酸被插入到wcaj位点。

8.一种用于发酵生产2’‑岩藻糖基乳糖的大肠杆菌的制备方法，包括：(1)敲除大肠杆菌基因组中的wcaj、LcaZ、nudD和nudK基因，并将如权利要求2所述的编码核酸插入到wcaj位点，得到基因组改造的大肠杆菌；

(2)将manB、manC、gmD和wcaG四个基因与如权利要求2所述的编码核酸插入到pRSFDuet‑1构建重组载体，再将所述重组载体转入所述基因组改造的大肠杆菌中。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：在所述重组载体上manB、manC、gmD和wcaG四个基因之间通过连接肽的编码核酸依次连接，其中：(1)manB与manC之间的连接肽Linker1的编码核酸序列为：TCTGGGGGAAGTGGCGGAAGCGGTGGGTCAGCGGGT；

(2)manC与gmD之间的连接肽Linker2的编码核酸序列为：GGGGGGGGAGGTTCAGGTGGAGGCGGAAGTGGCGGTGGTGGCAGC；

(3)gmD与wcaG之间的连接肽Linker3的编码核酸序列为：GCGGAAGCAGCTGCTAAAGAGGCAGCTGCCAAGGCG。

10.如权利要求1所述的futCB突变体、如权利要求2所述的编码核酸、如权利要求3所述的载体或如权利要求8或9所述的制备方法制备得到的大肠杆菌在发酵生产2’‑岩藻糖基乳糖中的应用。

11.一种发酵生产2’‑岩藻糖基乳糖的方法，其包括：将如权利要求8或9所述的制备方法制备得到的大肠杆菌在培养基中进行发酵。

12.如权利要求11所述的发酵生产2’‑岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)菌种活化：将所述大肠杆菌解冻，划线培养，挑取单菌落，在LB培养基中培养过夜，获得活化后的菌液；

(2)种子培养：将活化后的菌液以1～5％的比例接种于LB培养基中培养，获得一级种子液；将所述一级种子液以5～10％的比例接种于二级种子罐，搅拌转速200～450rpm，通气1～1.5vvm，控制溶氧25～35％，待种子罐OD长至0.8～1.2，获得二级种子液；

(3)补料分批发酵：将二级种子液以5～10％的比例接种于含发酵培养基的发酵罐中，通过向发酵罐中补加补料培养基来控制基因工程菌的比生长速率在0.2～0.5之间，控制发酵体系的pH为6.8～7.2；加入IPTG进行诱导，继续培养，收获2’‑岩藻糖基乳糖。

13.如权利要求12所述的发酵生产2’‑岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于：所述发酵培养基包含5.0～7.0g/L酵母粉，7.0～10.0g/L胰蛋白胨，20～50g/L甘油，10～25g/LNa2HPO4·12H2O，1.0～2.0g/L(NH4)2HPO4，3.0～4.0g/L KH2PO4，1.0～2.5g/L NH4Cl，2.0～

2.5g/L柠檬酸钠，0.5～1.0g/L MgSO4·7H2O，10.0mg/L硫胺素，40～80μg/mL卡那霉素。

14.如权利要求12所述的发酵生产2’‑岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于：所述补料培养基包含600～800g/L甘油，10～30g/L MgSO4·7H2O，50～100g/L胰蛋白胨，10～20mL/L的微量元素溶液。

说明书

一种futCB突变体及生物合成2’‑岩藻糖基乳糖的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及发酵工程技术领域，具体涉及一种生物合成2’‑岩藻糖基乳糖的方法。

背景技术

[0002] 母乳低聚糖(human milk oligosaccharides，HMOs)是母乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大营养物质，在母乳中的含量约为15％。现有的研究表明，母乳低聚糖对新生儿有许多重要的影响：1、母乳低聚糖可以防止病原体附着在婴儿粘膜表面，降低病毒、细菌和原生动物寄生虫感染的风险；2、母乳低聚糖可以降低婴儿腹泻的频率；3、母乳低聚糖可以为婴儿提供大脑发育和认知的必需营养素；4、母乳低聚糖可以影响胃肠运动收缩，治疗肠道疼痛有关疾病。

[0003] 母乳低聚糖的主要作用被归为六大类：(1)作为益生元，调节婴儿肠道菌群组成；(2)预防病原体粘附肠道；(3)免疫调节作用；(4)抗病毒活性；(5)预防坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)；(6)促进大脑发育。

[0004] 实际生活中，常常出现不能使用母乳进行喂养的情况，这时候一般会使用婴儿配方奶粉进行替代，由于2’‑岩藻糖基乳糖(2’‑fucosyllactose,2’‑FL)相较于其它的有益群体有更好的有利功能，大多数的婴儿奶粉都开始重视母乳低聚糖成分。目前，美国食品和药物管理局(FDA)和欧洲食品安全局(EFSA)正式批准将母乳低聚糖用作婴儿配方奶粉中的新型食品添加剂。在早期科学研究中，2’‑岩藻糖基乳糖是从母乳中分离提取的。并且人们也从牛乳和羊乳中提取到了少量的2’‑岩藻糖基乳糖，但这远远达不到生产的需求，因此实现2’‑岩藻糖基乳糖工业化生产化是婴儿配方食品发展的必然要求。

[0005] 2’‑岩藻糖基乳糖的化学结构相对简单，可以通过工业手段规模生产，满足商业化食品配料的生产需要。如今，2’‑岩藻糖基乳糖的工业合成方法主要分为化学合成法和酶法合成法。

[0006] 化学合成法一般以乳糖和L‑岩藻糖为原料分别合成乳糖受体和岩藻糖基供体，岩藻糖和乳糖受体经过几步连续的化学反应，得到反应产物2’‑岩藻糖基乳糖混合物；混合物经过脱盐、脱色和提纯等步骤得到2’‑岩藻糖基乳糖(Agoston K,Hederos MJ,Bajza I,Dekany G.Kilogram scale chemical synthesis of 2'‑fucosyllactose.Carbohydr Res.2019Apr1；476:71‑77.doi:10.1016/j.carres.2019.03.006.Epub 2019Mar 18.PMID:30921739.)。化学合成法具有易于放大生产、产品纯度高的优点，但因操作步骤复杂，反应过程所需条件苛刻、最终获得的产物存在食品安全隐患等问题，并未被业界广泛接受。

[0007] 生物合成法被认为是目前的主流方法，因为它可以用简单的发酵工艺进行大规模生产。生物合成法需要供体GDP‑l‑focus、受体乳糖和α‑1,2‑focusyltransferase(FT)的持续供应。其中，乳糖作为一种低廉的底物，一般可以被野生型生产者自身同化和降解，这会导致工程菌的乳糖利用率下降。但如果能消除β‑半乳糖苷酶活性，并同时提高乳糖的量，将会确保生物合成法的积极进行。GDP‑L‑岩藻糖是合成2’‑岩藻糖基乳糖的关键前体，可以通过两种途径合成。一种是源自colanic acid生物合成的大肠杆菌中自然存在的途径。从中枢代谢中的果糖6‑磷酸开始，通过5个酶促步骤(ManA、ManB、ManC、Gmd、WcaG)转化为GDP‑L‑岩藻糖(又称为“从头合成途径”)。另一个是最初来源于真核细胞的补救途径，这需要昂贵的L‑focuse作为底物和来自fragilis(B.fragilis)的催化酶Fkp来产生GDP‑L‑岩藻糖。出于成本考虑，一般选用从头合成途径合成GDP‑L‑岩藻糖。将参与可拉酸生物合成的wcaj基因失活，或者正向调控基因RcsA过表达，均可以增加细胞内的GDP‑L‑岩藻糖的量，但这一途径中某些中间产物(如GDP‑甘露糖)的缺乏，仍可能降低GDP‑L‑岩藻糖的合成量。Zhijian Ni等利用lacZ突变的大肠杆菌C41(DE3)ΔZ产生2’‑岩藻糖基乳糖，具体是对染色体基因wcaj、nudD和nudK进行基因敲除，在C41(DE3)ΔZ内转入futC基因，通过从头合成途径合成GDP‑L‑岩藻糖，并利用一对异源阳性调控因子RcsA和RcsB增强ManA、ManB、ManC、Gmd、WcaG的表达量从而促进GDP‑L‑岩藻糖的形成，从而2’‑岩藻糖基乳糖的产量可达5.39g/L(Ni Z,Li Z,Wu J,Ge Y,Liao Y,Yuan L,Chen X,Yao J.Multi‑Path Optimization for Efficient Production of 2'‑Fucosyllactose in an Engineered Escherichia coli C41(DE3)Derivative.Front Bioeng Biotechnol.2020Dec 3；8:611900.doi:10.3389/fbioe.2020.611900.PMID:33425876；PMCID:PMC7793955.)。尽管如此，如何进一步提高2’‑岩藻糖基乳糖产率仍然是本领域有待解决的难题。

发明内容

[0008] 针对现有技术存在的上述不足，本发明提供一种能够显著提高生物合成2’‑岩藻糖基乳糖效率的futCB突变体，以及应用该突变体高效合成2’‑岩藻糖基乳糖的方法。

[0009] 为实现上述目的，本发明在第一方面提供一种futCB突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述futCB突变体在2’‑岩藻糖基乳糖发酵过程中，相比于现有技术采用的futC，能够更加高效地将乳糖与GDP‑L‑岩藻糖合成2’‑岩藻糖基乳糖。

[0010] 本发明在另一方面提供所述futCB突变体的编码核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

[0011] 本发明在另一方面提供包含所述futCB突变体的编码核酸的载体。作为优选，所述载体为pRSFDuet‑1。

[0012] 本发明在另一方面提供包含所述futCB突变体的编码核酸或所述载体的微生物。目前，大肠杆菌等原核微生物和酵母等真核微生物都已被应用于2’‑岩藻糖基乳糖的生物合成。

[0013] 作为优选，所述微生物为细菌。

[0014] 作为进一步优选，所述细菌为大肠杆菌。

[0015] 作为进一步优选，所述大肠杆菌基因组中的wcaj、LacZ、nudD和nudK基因被敲除，并且所述的futCB突变体的编码核酸被插入到wcaj位点。

[0016] 本发明在另一方面提供一种发酵生产2’‑岩藻糖基乳糖的微生物的制备方法，包括将所述futCB突变体的编码核酸转入所述微生物的步骤。

[0017] 作为优选，所述微生物为细菌。

[0018] 作为进一步优选，所述细菌为大肠杆菌。

[0019] 作为进一步优选，将所述futCB突变体的编码核酸插入到pRSFDuet‑1质粒以构建重组载体，再将所述重组载体转入大肠杆菌中。

[0020] 作为优选，所述制备方法包括如下步骤：

[0021] (1)敲除大肠杆菌基因组中的wcaj、LacZ、nudD、nudK基因，并将所述futCB突变体的编码核酸插入到wcaj位点，得到基因组改造的大肠杆菌；

[0022] (2)将manB、manC和gmD、wcaG四个基因与所述futCB突变体的编码核酸插入到pRSFDuet‑1构建重组载体，再将所述重组载体转入所述基因组改造的大肠杆菌中。

[0023] 作为进一步优选，在所述重组载体上manB、manC、gmD、wcaG四个基因之间通过连接肽的编码核酸依次连接，其中：

[0024] (1)manB与manC之间的连接肽Linker1的编码核酸序列为：

[0025] TCTGGGGGAAGTGGCGGAAGCGGTGGGTCAGCGGGT；

[0026] (2)manC与gmD之间的连接肽Linker2的编码核酸序列为：

[0027] GGGGGGGGAGGTTCAGGTGGAGGCGGAAGTGGCGGTGGTGGCAGC；

[0028] (3)gmD与wcaG之间的连接肽Linker3的编码核酸序列为：

[0029] GCGGAAGCAGCTGCTAAAGAGGCAGCTGCCAAGGCG。

[0030] 本发明在另一方面提供前述futCB突变体、所述futCB突变体的编码核酸、所述载体、所述微生物及由所述制备方法得到的微生物在发酵生产2’‑岩藻糖基乳糖中的应用。

[0031] 本发明在另一方面提供一种发酵生产2’‑岩藻糖基乳糖的方法，包括将所述的微生物或所述的制备方法制备得到的微生物在培养基中进行发酵。

[0032] 作为优选，所述微生物为大肠杆菌。

[0033] 作为进一步优选，所述方法包括以下步骤：

[0034] (1)菌种活化：将所述大肠杆菌解冻，划线培养，挑取单菌落，在LB培养基中培养过夜，获得活化后的菌液；

[0035] (2)种子培养：将活化后的菌液以1～5％的比例接种于LB培养基中培养，获得一级种子液；将所述一级种子液以5～10％的比例接种于二级种子罐，搅拌转速200～450rpm，通气1～1.5vvm，控制溶氧25～35％，待种子罐OD长至0.8～1.2，获得二级种子液；

[0036] (3)补料分批发酵：将二级种子液以5～10％的比例接种于含发酵培养基的发酵罐中，通过向发酵罐中补加补料培养基来控制基因工程菌的比生长速率在0.2～0.5之间，控制发酵体系的pH为6.8～7.2；加入IPTG进行诱导，继续培养，收获2’‑岩藻糖基乳糖。

[0037] 作为进一步优选，所述发酵培养基包含5.0～7.0g/L酵母粉，7.0～10.0g/L胰蛋白胨，20～50g/L甘油，10～25g/L Na2HPO4·12H2O，1.0～2.0g/L(NH4)2HPO4，3.0～4.0g/L KH2PO4，1.0～2.5g/L NH4Cl，2.0～2.5g/L柠檬酸钠，0.5～1.0g/L MgSO4·7H2O，10.0mg/L硫胺素，40～80μg/mL卡那霉素。除上述成分外，必要的金属元素也以离子的形式被提供。

[0038] 作为进一步优选，所述补料培养基包含600～800g/L甘油，10～30g/L MgSO4·7H2O，50～100g/L胰蛋白胨，10～20mL/L的微量元素溶液。

[0039] 通过以上的技术方案，本发明能够取得如下的有益效果：

[0040] 1.选择了相比futC效率更高的同工酶futCB，并进一步使用酶的定向进化技术，通过VESPAl和GEMME工具，预测并确定了futCB最佳的定点突变位点，定向进化后的futCB(A61Q)酶的催化效率高于亲本酶52.9％。

[0041] 2.用Red同源重组基因敲除技术将wcaj基因敲除，再将futCB基因序列插入到wcaj位点，相比插入其他位点来说，futCB敲入到wcaj位点有利于futCB酶的更好表达。同时，futCB基因还通过质粒转化的方式在工程菌内以增加拷贝数(即futCB基因在工程菌中存在稳定转化与瞬时转化两种形态)，使得其表达量得到进一步提高。

[0042] 3.现有专利或文献报道的技术路线都需要构建ManB、ManC、Gmd、WcaG四酶级联表达质粒，本发明突破性地将四酶融合表达，与级联表达质粒相比，含有四酶融合表达质粒的工程菌的产量提高了21.3％。

[0043] 4.与公知技术相比，本发明构建的菌株实现了2’‑岩藻糖基乳糖的大量生产，摇瓶产量达到12.4g/L，经培养基成分和发酵工艺的优化后，1000L发酵罐产量可达85g/L。

附图说明

[0044] 图1为本发明2’‑FL标准品HPLC色谱图；

[0045] 图2为futCB与futC发酵效率比较；

[0046] 图3为本发明发酵生产2’‑FL的示意图；

[0047] 图4为本发明多种futCB突变体发酵效率的比较；

[0048] 图5为本发明构建的pRSFDuet‑1‑CB‑GW载体图谱；

[0049] 图6为本发明ManB、ManC、Gmd、WcaG四酶融合蛋白的质粒构建图谱；

[0050] 图7为本发明五种培养基的摇瓶发酵曲线图；

[0051] 图8为本发明1000L规模发酵曲线图；

[0052] 图9为本发明发酵最终产物HPLC色谱图。

具体实施方式

[0053] 下面结合说明书附图和实施例对本发明作进一步说明。

[0054] 实施例1 2’‑FL检测方法

[0055] 采用高效液相色谱‑示差折光检测器对产物2’‑岩藻糖基乳糖进行定性分析。

[0056] 首先，需要对样品进行预处理。取适量的发酵液，12000rpm，4℃离心10min后收集上清液，并配制2’‑岩藻糖基乳糖标准溶液，将适度稀释后的样品上清液和标准溶液经过0.22μm微孔滤膜过滤后，得到的样品用于后续液相色谱分析。其中2’‑FL标准品HPLC色谱图如图1所示。通过不同浓度的标准品绘制回归曲线，即可对发酵液中的2’‑FL浓度进行推算。

[0057] HPLC采用SCIEX Triple QuadTM 5500LC‑MS/MS高效液相色谱仪。色谱柱：ACQUITY UPLC BEN C18 1.7μm 2.1mm×50mm；检测器：示差折光检测器；流动相：溶液A(氨水10％(v/v))，溶液B(乙腈)；流速：0.4mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL。

[0058] 如无特殊说明，本发明有关2’‑FL的检测均采用本实施例提供的方法。

[0059] 实施例2futC同工酶的选取

[0060] 现有技术中选取的futC来自幽门螺杆菌(H.pylori)，我们尝试对其进行多种同工酶替换，发现当将其替换为来自蜡样芽孢杆菌futCB(alpha‑1,2‑fucosyltransferase[Bacillus cereus]，NCBI Reference Sequence:WP_002174293.1)后，参照前述现有技术文献(Ni Z,et al.)实施两组平行的摇瓶培养实验，在发酵开始12h后，每隔12h取发酵液样品，以实施例1的方法测定2’‑FL含量，结果如图2所示。说明将futC替换为futCB后构建的菌株发酵产2’‑FL的产率大幅提高。由futCB替换futC后发酵生产2’‑FL的示意图如图3所示。

[0061] 实施例3futCB基因的定点突变

[0062] 使用VESPAl(Variant Effect Score Prediction without Alignments)工具和GEMME(Global Epistatic Model Predicting Mutational Effects)工具对futCB基因进行定点突变位点的预测，最终选取了12个得分最高，预测突变结果最好的突变位点并设计引物如下表所示。

[0063]

[0064]

[0065] 首先将未经突变的futCB基因通过酶切连接的方式整合至pRSFDuet‑1，构建获得质粒pRSFDuet‑futCB，并转化至E.coli DH5a，37摄氏度过夜培养后提取质粒。

[0066] 以R82C突变位点为例，使用一步法进行futCB基因的单点突变，分三次PCR反应进行。首先第一步PCR反应PCR1，使用质粒pRSFDuet‑futC作为模板+正向引物R82C‑F扩增，循环数为12次；第二步PCR反应PCR2，使用质粒pRSFDuet‑futC作为模板+反向引物R82C‑R扩增，循环数为12次，第一次和第二次PCR均按照常规PCR程序进行。第三步PCR反应PCR3，将PCR1和PCR2二者体系混合成一个体系并补加适量的高保真聚合酶，然后按照常规PCR程序继续反应16个循环。由于E.coli DH5a是dam+大肠杆菌，用特异性识别甲基化位点的酶DpnI处理，可以消化掉待突变的质粒模板。向PCR 3产物中加入1μL DpnI酶和4μL的10×NEB cutsmart buffer消化模板质粒置于37℃反应1h，取出5μL跑胶检测，剩余的取部分做细菌转化，涂板。筛选转化子，测序。随后把DpnI处理过的产物转化E.coli Jm109(DE3)感受态(购买于上海昂羽生物技术有限公司)后，涂布卡那抗性平板，测序并筛选阳性克隆，最终测序正确的阳性转化子即为E.coli Jm109(DE3)‑pRSFDuet‑futCB‑R82C。

[0067] 用上述同样的方法，最终构建得到菌株Zeno1(E.coli Jm109(DE3)‑pRSFDuet‑futCB‑C82R)，Zeno2(E.coli Jm109(DE3)‑pRSFDuet‑futCB‑C82I)，Zeno3(E.coli Jm109(DE3)‑pRSFDuet‑futCB‑A61E)，Zeno4(E.coli Jm109(DE3)‑pRSFDuet‑futCB‑A61Q)，Zeno5(E.coli Jm109(DE3)‑pRSFDuet‑futCB‑A61T)，Zeno6(E.coli Jm109(DE3)‑pRSFDuet‑futCB‑G99K)，Zeno7(E.coli Jm109(DE3)‑pRSFDuet‑futCB‑E136P)，Zeno8(E.coli Jm109(DE3)‑pRSFDuet‑futCB‑G172K)，Zeno9(E.coli Jm109(DE3)‑pRSFDuet‑futCB‑T79L)，Zeno10(E.coli Jm109(DE3)‑pRSFDuet‑futCB‑N140H)，Zeno11(E.coli Jm109(DE3)‑pRSFDuet‑futCB‑M218L)，Zeno12(E.coli Jm109(DE3)‑pRSFDuet‑futCB‑Q182Y)。

[0068] 将Zeno1～Zeno12接种至LB培养基中，培养条件37℃转速200rpm，培养6小时，加入0.2mM IPTG诱导，降低培养温度至25℃，在诱导开始后的0、10、20、30小时分别加入0.2g乳糖作为底物。培养结束后，使用高效液相色谱‑示差折光检测器测定2‑岩藻糖基乳糖含量以计算产量。结果如图4所示，Zeno4最终的2‑FL的产量最高，达到1.3g/L，高于出发菌株的
0.85g/L。超出出发菌株52.9％。因此最终确定了最佳的定点突变位点为A61Q，突变后的futCB(A61Q)的催化效率高于出发基因52.9％。

[0069] 所述futCB(A61Q)突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示：

[0070] MKIIQVSSGLGNQMFQYALYKKISLNDNDVFLDSSTSYMMYKNQHNGYELERIFHIKPRHQGKEIIDNLSDLDSELISRIRRKLFGAKKSMYVELKEFEYDPIIFEKKETYFKGYWQNYNYFKDIEQELRKDFVFTEKLDKRNEKLANEIRNKNSVSIHIRRGDYYLNKVYEEKFGNIANLEYYLKAINLVKKKIEDPKFYIFSDDIDWAQKNINLTNDVVYISHNQGNESYKDMQLMSLCKHNIIANSTFSWWGAFLNNNDDKIVVAPKKWINIKGLEKVELFPENWITY

[0071] 所述futCB(A61Q)突变体的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示：

[0072] ATGAAAATAATTCAAGTAAGTAGTGGACTAGGGAACCAGATGTTTCAGTACGCCCTGTATAAGAAGATCAGTCTGAACGACAACGATGTGTTCTTAGATTCGAGCACGAGCTACATGATGTACAAAAATCAGCATAACGGTTACGAGTTGGAACGTATTTTCCACATCAAGCCGCGTCATCAAGGTAAAGAGATCATTGATAATCTGAGCGATCTGGACTCTGAACTCATTAGCCGTATCCGCCGTAAATTGTTTGGCGCTAAAAAGTCTATGTATGTCGAGTTGAAAGAGTTTGAGTATGACCCGATTATCTTCGAGAAGAAAGAAACCTACTTCAAAGGCTACTGGCAGAATTACAATTATTTCAAAGACATCGAGCAAGAACTGCGTAAAGATTTTGTTTTCACCGAAAAACTGGATAAACGCAACGAAAAGCTGGCGAACGAGATCCGCAACAAGAACAGCGTTAGCATTCACATTAGACGTGGTGATTACTACCTGAATAAGGTTTATGAAGAGAAATTCGGCAATATCGCGAATTTGGAGTACTACCTGAAAGCGATCAACTTGGTTAAAAAGAAGATCGAAGACCCAAAATTCTATATCTTCAGCGATGACATCGACTGGGCACAGAAAAACATTAACCTGACTAATGACGTGGTTTATATCTCACATAACCAAGGTAATGAAAGCTACAAAGACATGCAACTGATGAGCCTTTGCAAACACAACATTATTGCTAATTCCACCTTTAGCTGGTGGGGTGCGTTTCTGAACAACAACGACGACAAAATCGTGGTGGCGCCGAAAAAGTGGATTAACATTAAGGGCCTGGAAAAGGTGGAACTTTTTCCGGAAAATTGGATCACCTATTAA

[0073] 实施例4构建重组菌Jm109(DE3)(E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB)

[0074] 1)以pKD4质粒(本公司保存)为模板，使用引物FLP/Kan‑S和FLP/Kan‑A，扩增出含有FLP/Kan基因的片段1；FLP/Kan‑S和FLP/Kan‑A的碱基序列如下：

[0075] FLP/Kan‑S：gtgtaggctggagctgc；FLP/Kan‑A：catatgaatatcctccttagttcct[0076] 2)以实施案例1获得的futCB作为模板，使用引物futCB/FLPb‑S、futCB/FLPb‑A，扩增出含有片段1同源臂的片段2；futCB/FLPb‑S、futCB/FLPb‑A的碱基序列如下：

[0077] futCB/FLPb‑S：ATGAAAATAATTCAAGTAAGTAGTGGACTAG；

[0078] futCB/FLPb‑A：tccagcctacacTTAATAGGTGATCCAA；

[0079] 3)通过融合PCR的方式在片段1的5’端加上futCB的碱基序列，

[0080] 通过overlap PCR融合片段1和片段2。由于片段1和片段2存在一段10～15bp的同源序列，本次overlap PCR分为两步PCR反应，第一步PCR反应将片段1和片段2以摩尔比1：1的比例加入50μL的体系，加入10μL高保真聚合酶，常规PCR，循环5次；第二步PCR反应加入引物futCB/FLPb‑S和FLP/Kan‑A，补入适量高保真聚合酶，循环30次，胶回收测序正确最终得到2353bp的futCB‑FLP片段。

[0081] 3)以futCB‑FLP片段为模板，根据Escherichia coli Jm109(DE3)中wcaj基因3’和5’端45bp序列设计携带有wcaj同游臂的引物QC‑wcaj‑S和QC‑wcaj‑A，扩增出含有wcaj同游臂的卡那霉素抗性基因敲除框wcajAK；QC‑wcaj‑S和QC‑wcaj‑A的碱基序列如下：QC‑wcaj‑S：atgacaaatctaaaaaagcgcgagcgagcgaaaaccaatgcatcg ATGAAAATAATTCAAGTAAGT QC‑wcaj‑A：tcaatatgccgctttgttaacgaaacctttgaacaccgtcaggaaCACATATGAATATCCTCCTTAG[0082] 4)将上述基因片段敲除片段wcajAK电转化至含pKD46质粒的Escherichia coli Jm109(DE3)感受态细胞中(电转化电压和时间分别为2500V和5mS)。迅速于1mL LB培养基中
37℃、150rpm复苏1h后涂布于含卡那霉素30g/mL)LB固体培养基平板上。倒置培养24h后采用鉴定引物wcaj‑U和wcaj‑D通过菌落PCR的方法鉴定阳性转化子，卡那霉素抗性基因敲除框成功整合到基因组的菌落其扩增片段约2443bp。wcaj‑U和wcaj‑D的碱基序列如下：wcaj‑U：atgacaaatctaaaaaagcgc；wcaj‑D：tcaatatgccgctttgtt

[0083] 5)将pCP20质粒转化至上述阳性转化子以消除卡那霉素抗性基因，经42℃过夜培养后，筛选能够在无抗性平板上生长而在含卡那霉素平板上不生长的单菌落并采用鉴定引物wcaj‑U和wcaj‑D进行验证，wcaj被成功敲除的菌株扩增片段约1030bp，测序正确后即可确定敲除。wcaj敲除后的菌株‑80℃保存并命名为E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB。

[0084] 实施例5构建重组菌Jm109(DE3)wcaJ::futCB△ZDK

[0085] 1、lacZ敲除：

[0086] 1)以pKD4质粒为模板，根据Escherichia coli Jm109(DE3)中lacZ基因3’和5’端45bp序列设计携带有lacZ同游臂的引物QC‑lacZ‑S和QC‑lacZ‑A，扩增出含有lacZ同游臂的卡那霉素抗性基因敲除框lacZAK；QC‑lacZ‑S和QC‑lacZ‑A的碱基序列如下：QC‑lacZ‑S：atgaccatgattacggattcactggccgtcgttttacaacgtcgtGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC QC‑lacZ‑A：ttatttttgacaccagaccaactggtaatggtagcgaccggcgctCACATATGAATATCCTCCTTAG

[0087] 2)将上述基因片段敲除片段lacZAK电转化至含pKD46质粒的E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB感受态细胞中(电转化电压和时间分别为2500V和5mS)。迅速于1mL LB培养基中37℃、150rpm复苏1h后涂布于含卡那霉素30g/mL)LB固体培养基平板上。倒置培养24h后采用鉴定引物lacZ—U和lacZ—D通过菌落PCR的方法鉴定阳性转化子，卡那霉素抗性基因敲除框成功整合到基因组的菌落其扩增片段约1570bp。lacZ—U和lacZ—D的碱基序列如下：

[0088] lacZ—U：atgaccatgattacggattcact；lacZ—D：ttatttttgacaccagaccaactg[0089] 3)将pCP20质粒转化至上述阳性转化子以消除卡那霉素抗性基因，经42℃过夜培养后，筛选能够在无抗性平板上生长而在含卡那霉素平板上不生长的单菌落并采用鉴定引物lacZ—U和lacZ—D进行验证，lacZ被成功敲除的菌株扩增片段约157bp。lacZ敲除后的菌株‑80保存并命名为E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCBΔlacZ。

[0090] 2、nudD敲除：

[0091] 1)以pKD4质粒为模板，根据E.coli Jm109(DE3)中nudD基因3’和5’端45bp序列设计携带有nudD同游臂的引物QC‑nudD‑S和QC‑nudD‑A，扩增出含有nudD同游臂的卡那霉素抗性基因敲除框nudDAK；QC‑nudD‑S和QC‑nudD‑A碱基序列如下：

[0092] QC‑nudD‑S:atgtttttacgtcaggaagactttgccacggtagtgcgctccactGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC QC‑nudD‑A:tcataatccgggtactccggtacgcttctcagcgagaaaataggcCACATATGAATATCCTCCTTAG

[0093] 2)将上述基因片段敲除片段nudDAK电转化至含pKD46质粒的E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCBΔlacZ感受态细胞中(电转化电压和时间分别为2500V和5mS)。迅速于1mL LB培养基中37℃、150rpm复苏1h后涂布于含卡那霉素30g/mL)LB固体培养基平板上。倒置培养24h后采用鉴定引物nudD—U和nudD—D通过菌落PCR的方法鉴定阳性转化子，卡那霉素抗性基因敲除框成功整合到基因组的菌落其扩增片段约1570bp。nudD—U和nudD—D的碱基序列如下：

[0094] nudD—U：atgtttttacgtcaggaagactttg；nudD—D：tcataatccgggtactccgg；

[0095] 3)将pCP20质粒转化至上述阳性转化子以消除卡那霉素抗性基因，经42℃过夜培养后，筛选能够在无抗性平板上生长而在含卡那霉素平板上不生长的单菌落并采用鉴定引物nudD—U和nudD—D进行验证，nudD被成功敲除的菌株扩增片段约157bp。nudD敲除后的菌株‑80℃保存并命名为E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCBΔlacZΔnudD。

[0096] 3、nudK敲除：

[0097] 1)以pKD4质粒为模板，根据E.coli Jm109(DE3)中nudD基因3’和5’端45bp序列设计携带有nudK同游臂的引物QC‑nudK‑S和QC‑nudK‑A，扩增出含有nudK同游臂的卡那霉素抗性基因敲除框nudKAK；QC‑nudK‑S和QC‑nudK‑A的碱基序列如下：

[0098] QC‑nudK‑S:atgacgcaacaaatcaccctcattaaagacaaaattctctccgatGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC QC‑nudK‑A:tcagtccattaaatgtgacgtttgcaaatagttaagcaataacacCACATATGAATATCCTCCTTAG

[0099] 2)将上述基因片段敲除片段nudKAK电转化至含pKD46质粒的E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCBΔlacZΔnudD感受态细胞中(电转化电压和时间分别为2500V和5mS)。迅速于1mL LB培养基中37℃、150rpm复苏1h后涂布于含卡那霉素30g/mL)LB固体培养基平板上。倒置培养24h后采用鉴定引物nudK‑U和nudK‑D通过菌落PCR的方法鉴定阳性转化子，卡那霉素抗性基因敲除框成功整合到基因组的菌落其扩增片段约1570bp。nudK‑U和nudK‑D的碱基序列如下：

[0100] nudK—U：atgacgcaacaaatcaccct；nudK—D：tcataatccgggtactccgg

[0101] 3)将pCP20质粒转化至上述阳性转化子以消除卡那霉素抗性基因，经42℃过夜培养后，筛选能够在无抗性平板上生长而在含卡那霉素平板上不生长的单菌落并采用鉴定引物nudK‑U和nudK‑D进行验证，nudK被成功敲除的菌株扩增片段约157bp。nudK敲除后的菌株‑80℃保存并命名为E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCBΔZDK。

[0102] 实施例6manC、manB和gmD、wcaG表达载体构建

[0103] 1)目的基因的获取

[0104] 由于在大肠杆菌的基因组里，gmD(NP_254140.1)和wcaG(WP_194160639.1)基因是连续的，因此可以同时获取这两个基因。

[0105] 对于GW基因(即上述gmD和wcaG的组合)片段，以寡核苷酸5’‑GTATAAGAAGGAGATATACAATGTCAAAAGTCGCTCTCATCACC‑3’为正向引物，记为GW‑F。5’‑TTACCAGACTCGAGGGTACCTTACCCCCGAAAGCGGTCTT‑3’为反向引物，记为GW‑R，以E.coli Jm109(DE3)为模板，进行PCR反应，将PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，GW片段的长度约为2090bp。

[0106] manC(WP_000694991.1)和manB(WP_011028721.1)基因也是连续的，也可以同时获取。由于没有成功通过PCR反应获得CB基因片段，交由华大基因科技有限公司合成。

[0107] 对于CB基因(即上述manC和manB的组合)片段，以寡核苷酸5’‑ACTTTAATAAGGAGATATACATGGCGCAGTCGAAACTCTATC‑3’为正向引物，记为CB‑F。5’‑GCATTATGCGGCCGCAAGCTTTACTCGTTCAGCAACGTCAG‑3’为反向引物，记为CB‑R，以E.coli Jm109(DE3)为模板，CB片段的长度约为2952bp。

[0108] 2)重组表达载体pRSFDuet‑1‑GW的构建

[0109] 将质粒pRSFDuet‑1用内切酶NdeⅠ和KpnⅠ进行双酶切反应，其中NdeⅠ酶切位点：CA↓TATG，KpnⅠ酶切位点：GGTAC↓C，回收得到大小约为3829bp的DNA片段。

[0110] 配制10μL连接体系：双酶切过的载体pRSFDuet‑1 0.016pmols、GW基因片段0.032pmols、Gibson Assemble Master Mix(2×)连接液5μL，补加无菌水至10μL，载体与插入片段的摩尔比为1:2。轻轻混匀，于放入50℃水浴中孵育30min，即得到重组质粒，命名为重组质粒pRSFDuet‑1‑GW。反应结束立即放在冰上进行转化。

[0111] 3)重组表达载体pRSFDuet‑1‑CB‑GW的构建

[0112] 将质粒pRSFDuet‑1‑GW用内切酶NcoⅠ和HindIII进行双酶切反应，其中NcoⅠ酶切位点：C↓CATGG，HindIII酶切位点：A↓AGCTT，回收得到大小约为5870bp的DNA片段。

[0113] 配制10μL连接体系：双酶切过的载体pRSFDuet‑1‑GW 0.016pmols、CB基因片段0.032pmols、Gibson Assemble Master Mix(2×)连接液5μL，补加无菌水至10μL，载体与插入片段的摩尔比为1:2。轻轻混匀，于放入50℃水浴中孵育30min，即得到重组质粒，命名为重组质粒pRSFDuet‑1‑CB‑GW(质粒图谱如图5所示，其中第50‑3001位核苷酸为GW基因序列，第3117‑5246位核苷酸为CB基因序列)。反应结束立即放在冰上进行转化。

[0114] 4)验证

[0115] 将上一步得到的重组质粒通过化学转化法转入top10感受态细胞，并涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基中，在37℃下孵育，固体培养基中长出单菌落，则证明载体构建成功。

[0116] 实施例7融合蛋白载体pRSFDuet‑1‑ManB‑Linker1‑ManC‑Linker2‑Gmd‑Linker3‑WcaG‑futCB构建

[0117] 以CB基因作为模板，以寡核苷酸序列5’‑GTGGCTGCTGATCTGTCGCA‑3’作为正向引物引物，记为manB‑F,以寡核苷酸序列5’‑GCGATCATCCGGGCGTGA‑3’作为反向引物，记为manB‑R，PCR扩增获得1365bp的manB片段。以CB基因作为模板，以寡核苷酸序列5’‑ATGGCGCAGTCGAAACTCTA‑3’作为正向引物引物，记为manC‑F，以寡核苷酸序列5’‑TCGCTACGGACGGGTGTAA‑3’作为反向引物，记为manC‑R，PCR扩增获得1437bp的manC片段。以GW基因作为模板，以寡核苷酸序列5’‑ATGACAAGAAGTGCACTGGT‑3’作为正向引物引物，记为gmd‑F，以寡核苷酸序列5’‑ACGCGTTTCCCGGGAGTAA‑3’作为反向引物，记为gmd‑R，扩增获得
972bp的gmd片段。以GW基因作为模板，以寡核苷酸序列5’‑ATGAGTAAACAACGAGTTTTTATTGC‑
3’作为正向引物引物，记为wcaG‑F，以寡核苷酸序列5’‑CAAGACCGCTTTCGGGGGTAA‑3’作为反向引物，记为wcaG‑R，PCR扩增获得972bp的wcaG片段。

[0118] 以上分别获得了manB，manC，gmd，wcaG四个基因片段，为了获得四个蛋白的融合蛋白，本发明经比较选用三种不同的Linker(Linker1～Linker3)。柔性Linker1，其蛋白序列为SGGSGGSGGSAG，经过逆转录及密码子优化，确定其核酸序列为5’‑TCTGGGGGAAGTGGCGGAAGCGGTGGGTCAGCGGGT‑3’；柔性Linker2的蛋白序列为GGGGSGGGGSGGGGS，密码子优化后的碱基序列为5’‑GGGGGGGGAGGTTCAGGTGGAGGCGGAAGTGGCGGTGGTGGCAGC‑3’；刚性Linker3的蛋白序列为AEAAAKEAAAKA，密码子优化后的碱基序列为5’‑GCGGAAGCAGCTGCTAAAGAGGCAGCTGCCAAGGCG‑3’；Linker1～3序列由苏州金唯智公司合成。由于其序列间的酶切位点较少，因此选择体外构建B‑L1‑C‑L2‑G‑L3‑W片段。

[0119] 首先构建B‑L1‑C‑L2片段，以manB片段作为模板，寡核苷酸序列5’‑CGCGGATCCGCGgtggctgctgatctgtc‑3’作为正向引物，记为B‑L1‑F，核苷酸序列5’‑ACCCGCTGACCCACCGCTTCCGCCACTTCCCCCAGAtcacgcccggatgatc‑3’作为反向引物，记为B‑L1‑R，胶回收测序正确得到manBL1；以manC片段作为模板，寡核苷酸序列5’‑TCTGGGGGAAGTGGCGGAAGCGGTGGGTCAGCGGGTatggcgcagtcgaa‑3’作为正向引物，记为C‑L1‑F，寡核苷酸序列5’‑CACTTCCGCCTCCACCTGAACCTCCCCCCCCttacacccgtccgtagcgatccgcgaaacg‑3’作为反向引物，记为C‑L1‑R‑L2，胶回收测序正确得到片段manCL1‑L2。manBL1和manCL1‑L2分别在5’和3’添加了linker1序列作为同源区域，使用重叠延伸PCR融合两段基因，分为两步PCR反应，第一步PCR反应将manBL1和manCL1‑L2以摩尔比1：1的比例加入50μL的体系，加入10μL高保真聚合酶，常规PCR，循环5次；第二步PCR反应加入引物B‑L1‑F和C‑L1‑R‑L2，补入适量高保真聚合酶，循环30次，胶回收测序正确最终得到B‑L1‑C‑L2片段。

[0120] 第二步构建L2‑G‑L3‑W片段，以gmd片段作为模板，寡核苷酸序列5’‑GTGGAGGCGGAAGTGGCGGTGGTGGCAGCatgacaagaagtgc‑3’作为正向引物，记为G‑L3‑F‑L2，寡核苷酸序列5’‑CGCCTTGGCAGCTGCCTCTTTAGCAGCTGCTTCCGCttactcccgggaaac‑3’作为反向引物，记为G‑L3‑R，胶回收测序正确得到gmdL3；以wcaG片段作为模板，寡核苷酸序列5’‑GCGGAAGCAGCTGCTAAAGAGGCAGCTGCCAAGGCG atgagtaaacaacg‑3’作为正向引物，记为W‑L3‑F，寡核苷酸序列5’‑CCCAAGCTTttacccccgaaag‑3’作为反向引物，记为W‑L3‑R，胶回收测序正确得到片段wcaGL3。gmdL3和wcaGL3分别在5’和3’添加了linker3序列作为同源区域，使用重叠延伸PCR融合两段基因，分为两步PCR反应，第一步PCR反应将gmdL3和wcaGL3以摩尔比1：1的比例加入50μL的体系，加入10μL高保真聚合酶，常规PCR，循环5次；第二步PCR反应加入引物G‑L3‑F‑L2和W‑L3‑R，补入适量高保真聚合酶，循环30次，胶回收测序正确最终得到L2‑G‑L3‑W片段。

[0121] 第三步通过overlap PCR融合B‑L1‑C‑L2和L2‑G‑L3‑W两个片段。由于B‑L1‑C‑L2和L2‑G‑L3‑W存在一段15bp的同源序列，本次overlap PCR分为两步PCR反应，第一步PCR反应将B‑L1‑C‑L2和L2‑G‑L3‑W以摩尔比1：1的比例加入50μL的体系，加入10μL高保真聚合酶，常规PCR，循环5次；第二步PCR反应加入引物B‑L1‑F和W‑L3‑R，补入适量高保真聚合酶，循环30次，胶回收测序正确最终得到4878bp的B‑L1‑C‑L2‑G‑L3‑W片段。

[0122] 第四步由于B‑L1‑C‑L2‑G‑L3‑W片段两段加上了BamHI和HindIII的酶切位点，将质粒pRSFDuet‑1和B‑L1‑C‑L2‑G‑L3‑W片段用内切酶BamHI和HindIII进行双酶切反应，胶回收得到酶切后片段，双酶切过的载体pRSFDuet‑1‑GW 0.016pmols、B‑L1‑C‑L2‑G‑L3‑W基因片段0.032pmols、Gibson Assemble Master Mix(2×)连接液5μL，补加无菌水至10μL，载体与插入片段的摩尔比为1:2。轻轻混匀，于放入50℃水浴中孵育30min，即得到重组质粒，命名为重组质粒pRSFDuet‑1‑B‑L1‑C‑L2‑G‑L3‑W，反应结束立即放在冰上进行转化。

[0123] 第五步将futCB通过酶切连接的方式整合至MCS2中。以futCB为模板，寡核苷酸序列5’‑ATCGATCGATGAAAATAATTCAAGT‑3’作为正向引物，记为futCB‑F，核苷酸序列5’‑CGGGGTACCCCGTTAATAGGTGATCCAATT‑3’作为反向引物，记为futCB‑R。两段加上了PvuI和KpnI的酶切位点，将质粒pRSFDuet‑1‑B‑L1‑C‑L2‑G‑L3‑W和B‑L1‑C‑L2‑G‑L3‑W片段用内切酶PvuI和KpnI进行双酶切反应，胶回收得到酶切后片段，双酶切过的载体pRSFDuet‑1‑B‑L1‑C‑L2‑G‑L3‑W 0.016pmols、B‑L1‑C‑L2‑G‑L3‑W基因片段0.032pmols、Gibson Assemble Master Mix(2×)连接液5μL，补加无菌水至10μL，载体与插入片段的摩尔比为1:2。轻轻混匀，于放入50℃水浴中孵育30min，即得到重组质粒，命名为重组质粒pRSFDuet‑1‑B‑L1‑C‑L2‑G‑L3‑W‑futCB(质粒图谱如图6所示)，反应结束立即放在冰上进行转化DH5a感受态，37℃过夜后提取质粒保存。

[0124] 实施例8转化构建菌种

[0125] 将pRSFDuet‑1‑B‑L1‑C‑L2‑G‑L3‑W质粒化学转化于E.coli Jm109(DE3)wcaJ::futCB△ZDK中，步骤如下：

[0126] 将感受态细胞置于冰上融化，取50μL感受态细胞于1.5mL无菌EP管中，加入目标质粒后混合，然后在冰水浴中静置20‑30min；静置完成，在42℃条件下对上述混合物进行60s热激；迅速放入冰水浴中，静置1‑2min；加入450μL无抗生素的无菌LB液体培养基，混合均匀后水平放置EP管，在37℃、160r/min条件下振荡培养40min，使细菌复苏；复苏完毕后，吸取100μL菌液涂布在1‰卡那霉素的LB固体培养基上，在37℃下孵育，固体培养基中长出单菌落，则证明转化成功。

[0127] 实施例9摇瓶培养优化

[0128] 为了探究不同培养基对该酶产率的影响，以期获得更高的转化率，因此设计出以下5种不同的培养基，寻求最优培养基配方。

[0129] 培养基Ⅰ：KH2PO4 3g/L,K2HPO4 12g/L,(NH4)2SO4 5g/L,MgSO4·7H2O 0.3g/L,CaCl2·2H2O0.015g/L,NaCl 0.1g/L,glycerol 10g/L,FeSO4·7H2O/sodium citrate(柠檬酸钠)15ml/L(from the solution of 7.5g/L FeSO4·7H2O and 100g/L sodium citrate),thiamine(硫胺素)7.5μg/L,微量元素溶液33mL/L。

[0130] 培养基II：5.0g/L yeast extract,10.0g/L tryptone,17.1g/L Na2HPO4·12H2O,1.0g/L(NH4)2HPO4,3.0g/L KH2PO4,2.0g/L NH4Cl,2.0g/L trisodium citrate(柠檬酸钠),
1.4g/L MgSO4·7H2O,10.0mg/L thiamine(硫胺素),1.0mL/L微量元素溶液。

[0131] 培养基III：8.0g/L yeast extract,12.0g/L tryptone,1.0g/L citric acid(柠檬酸),13.2g/L K2HPO4,9.3g/L KH2PO4,4.0g/L(NH4)2SO4,1.4g/L MgSO4·7H2O,10mg/Lthiamine(硫胺素),and 1mL/L微量元素溶液，另外添加20g/L glycerol作为碳源。

[0132] 培养基IV：5.0g/L yeast extract,10.0g/L tryptone,10.0g/L NaCl，20g/L glycerol.

[0133] 培养基V：12.8g/L Na2HPO4·7H2O,3g/L KH2PO4,2g/L NH4Cl,0.5g/L NaCl,0.25g/LMgSO4·7H2O,14.7mg/L CaCl2·2H2O,10mg/L thiamine(硫胺素),2g/L yeast extract,0.1％(v/v)Triton‑X 100,and 1mL/L微量元素溶液。

[0134] 设计5组平行实验，每组使用的培养基不同，分别50ml培养基，接种量均为1％，培养条件37℃转速200rpm，培养6小时，加入0.2mM IPTG诱导，降低培养温度至25℃，在诱导开始后的0、10、20、30小时分别加入0.2g乳糖作为底物。培养结束后，使用高效液相色谱‑示差折光检测器测定2’‑岩藻糖基乳糖含量以计算产量，结果如图7所示，诱导40小时后，培养基II产量最高，其中2‘FL产量达到12.4g/L。

[0135] 实施例10发酵罐放大工艺

[0136] 该发酵工艺显著提高了大肠杆菌的菌体浓度和2’‑FL的单位滴度。其特征包括：菌种活化、种子培养和补料分批发酵。

[0137] (1)菌种活化：将冻存于液氮中保存有基因工程菌的甘油管放置于冰上缓慢解冻，划线于含有卡那霉素抗性的LB平板中，37℃培养24～36h，挑取平板中形态饱满，边缘光滑的单菌落，接种于预先装有5～10mL LB培养基(卡那霉素浓度为40～80μg/mL)的50mL试管，放入摇床35～37℃，200rpm转速下培养过夜，将此步获得的菌保存于25～30％甘油管中并建立发酵菌种库；

[0138] (2)种子培养：将的活化后的菌液以1～5％的接种量接种于装有100mL LB培养基(卡那霉素浓度为40～80μg/mL)的500mL锥形瓶中，35～37℃，200rpm，培养8～9h，此步获得一级种子液。二级种子需要放大至50L发酵罐，装液LB培养基35L(卡那霉素浓度为40～80μg/mL)，将一级种子按5～10％的接种量接种至二级种子罐，搅拌转速200～450rpm，通气1～1.5vvm，控制溶氧25～35％，待种子罐OD长至0.8～1.2，此时应处于对数生长后期，即可获得二级种子；

[0139] (3)补料分批发酵：将培养结束的二级种子液以5～10％的接种量转种至含发酵培养基600L的1000L的发酵罐中，每隔2h取一次样检测OD600、菌体干湿重、2‑FL产量。其中发酵培养基的配方为5.0～7.0g/L酵母粉，7.0～10.0g/L胰蛋白胨，20～50g/L甘油，10～25g/L Na2HPO4·12H2O，1.0～2.0g/L(NH4)2HPO4，3.0～4.0g/L KH2PO4，1.0～2.5g/L NH4Cl，2.0～2.5g/L柠檬酸钠，0.5～1.0g/L MgSO4·7H2O，10.0mg/L硫胺素，40～80μg/mL卡那霉素，1mL/L的微量元素溶液。其中，培养的温度为30～37℃，初始转速为100rpm，通气1vvm，待溶氧降至30％以下缓慢提高转速和通气，通过溶氧与搅拌偶联控制发酵液的溶氧量为25～
40％，发酵液的pH值通过氨水自控至6.8～7.2；在培养过程中，通过向发酵液补加补料培养基来控制基因工程菌的比生长速率在0.2～0.5之间。其中补料培养基的配方为600～800g/L甘油，10～30g/L MgSO4·7H2O，50～100g/L胰蛋白胨，10～20mL/L的微量元素溶液。待甘油消耗完之后，OD600约为20～25左右，以2.0～4.0g/L/h的速率补入补料培养基，控制大肠杆菌的比生长速率不低于0.2。与此同时，培养温度降低至25℃，加入45g IPTG进行诱导，诱导后继续培养60小时，其中每隔4h补加4800g的乳糖。结束发酵后测量OD及产物，此时的OD达到120，2’‑FL的产量可达85g/L。发酵过程各参数变化如图8所示，发酵最终产物HPLC色谱图如图9所示。

[0140]

[0141]

[0142] 上述实施例的具体描述不能理解为对本发明保护范围的限定，本领域的技术人员根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整均落入本发明的保护范围之内。