一种大环内酯类抗生素的增效剂及其应用

摘要

本发明属于抗生素增效剂技术领域，公开了一种大环内酯类抗生素的增效剂及其应用，本研究基于酚妥拉明和大环内酯类抗生素对大肠杆菌抑菌效果微弱(单独作用时杀菌量在0.5log‑1.5log)，将其进行联合作用后具有明显的协同抑菌效果。本发明相较于传统的抗生素，有更高效地抑菌作用并且能够减少抗生素的使用。

权利要求

1.酚妥拉明在制备红霉素抗大肠杆菌的增效剂的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coli BW 25113。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，红霉素的浓度为32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL，酚妥拉明浓度为0.5mM。

说明书

一种大环内酯类抗生素的增效剂及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及抗生素增效剂技术领域，更具体地，涉及一种大环内酯类抗生素的增效剂及其应用。

背景技术

[0002] 大环内酯类抗生素是继β‑内酰胺类和氨基糖苷类抗生素发现之后第三类具有抗菌活性的微生物产物，是一类分子结构中具有14至16碳内酯环的抗菌药物的总称。红霉素是第一种大环内酯类抗生素，最早于1949年在菲律宾环境样本的土壤细菌中分离出来。最初由于大环内酯类抗生素的药理特性，其主要用于治疗上呼吸道、皮肤和软组织感染。经过化学改造，第二代大环内酯类抗生素的药物特性得到了改进，其应用范围得到了扩大。具体来说，大环内酯现在被证明可以有效治疗革兰氏阳性细菌(如肺炎链球菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌)、一些革兰氏阴性细菌(如流感嗜血杆菌)以及非典型病原体(如沙眼衣原体——衣原体的病原体，梅毒螺旋体、肺炎支原体的病原体)引起的感染。

[0003] 大环内酯类抗生素能不可逆的结合到细菌核糖体50S亚基上，通过阻断转肽作用及mRNA位移，选择性抑制蛋白质合成。大环内酯类可结合到50S亚基23SrRNA的特殊靶位，阻止肽酰基tRNA从mRNA的“A”位移向“P”位，使氨酰基tRNA不能结合到“A”位，选择抑制细菌蛋白质的合成；或与细菌核糖体50S亚基的L22蛋白质结合，导致核糖体结构破坏，使肽酰tRNA在肽键延长阶段较早地从核糖体上解离。

[0004] 近年来，由于抗生素的大量使用，使得细菌耐药性越来越严重。细菌对大环内酯类抗生素也产生了耐药性，耐药机制包括：①抗生素能进入菌体的量减少和药物外排增加，如革兰氏阴性菌可增强脂多糖外膜屏障作用，使药物难以进入菌体；②金黄色葡萄球菌外排泵作用增强，药物排出增加，或细菌产生了灭活大环内酯类的酶，如酯酶、磷酸化酶及葡萄糖酶；细菌改变了与抗生素结合的核蛋白体结合部位，使其结合能力下降等。

[0005] 因此，对抗生素增效剂的研究应用越来越多，迫切需要找到一种抗生素增效剂，增强抗生素抗菌活性同时也缓解耐药形势。

[0006] 酚妥拉明为α1、α2肾上腺素受体阻滞剂，具有良好的血管扩张作用，且作用较温和，安全性相对较高，在改善肺部组织与心脏微循环方面发挥着积极作用，不仅可提高重症肺炎患者换气功能，亦可有效减轻心脏负荷，缓解机体氧化应激反应与炎症反应，促使重症肺炎引发的肾损伤与心功能衰竭等并发症良好转归，进一步控制病情。有研究报道了酚妥拉明联合抗生素在老年重症肺炎治疗中的可行性和应用价值。

[0007] 为了增强大环内酯类抗生素对大肠杆菌的抗菌效果，研究大环内酯类抗生素增效剂是必不可少的一步。但是目前报道的相关增效剂仍然较少，亟需补充新的大环内酯类抗生素增效剂，增加大环内酯类抗生素对大肠杆菌的抗菌效果。

发明内容

[0008] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述缺陷，提供酚妥拉明作为抗生素抗菌的增效剂的新应用。

[0009] 本发明的目的通过以下技术方案实现：

[0010] 酚妥拉明增强大环内酯类抗生素对大肠杆菌的抗菌活性的应用，所述大环内酯类抗生素为红霉素。

[0011] 酚妥拉明在制备红霉素抗大肠杆菌的增效剂的应用，所述大环内酯类抗生素为红霉素。

[0012] 本发明研究发现酚妥拉明与大环内酯类抗生素联用，能够显著增强大环内酯类抗生素对大肠杆菌的抑菌能力，因此可以作为大环内酯类抗生素对大肠杆菌的增效剂。

[0013] 优选的，所述大肠杆菌为E.coli BW 25113。

[0014] 优选的，当大肠杆菌为E.coli BW 25113时，红霉素的浓度为32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL，酚妥拉明浓度为0.5mM。

[0015] 本发明还提供一种非治疗目的的酚妥拉明联合红霉素进行杀菌的方法，将酚妥拉明和红霉素同时与菌液孵育，孵育温度为37℃，孵育时间为16～18h。

[0016] 优选的，上述方法中，孵育温度为37℃，孵育时间为24h，同时180rpm震荡孵育。

[0017] 优选的，上述方法中，菌液浓度为106CFU/mL。

[0018] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0019] 本发明提供了一种与大环内酯类抗生素有了协同作用的增效剂，本研究中红霉素和酚妥拉明抑菌效果微弱(单独作用时杀菌量在0.5log‑1.5log)，将其进行联合作用后具有明显的协同抑菌效果。本发明相较于传统的抗生素，能够更高效地杀灭细菌并且减少抗生素的使用。

附图说明

[0020] 图1为实施例3中抗菌的统计结果图。

具体实施方式

[0021] 下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

[0022] 下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

[0023] 所用的红霉素(Erythromycin,ERY)为Macklin(麦克林)品牌，MW为733.93，纯度为98％；

[0024] 所述甲磺酸酚妥拉明(Phentolamine,PE)为Macklin(麦克林)品牌，MW为377.456，纯度为98％。

[0025] 判定原则：如实验组降低的菌量在单独红霉素处理和单独酚妥拉明处理菌量下降的基础上再降低2个对数值，即表明红霉素与酚妥拉明具有协同抑菌作用。

[0026] 实施例1酚妥拉明和红霉素对大肠杆菌BW25113的MIC测定

[0027] 1、实验材料：

[0028] (1)试验：将经高压灭菌的MH肉汤冷却备用。

[0029] (2)红霉素：Macklin(麦克林)品牌，MW733.93，纯度为98％；

[0030] 酚妥拉明：Macklin(麦克林)品牌，MW377.456，纯度为98％；

[0031] 试验菌株：大肠杆菌野生菌株BW25113(实验室保藏)。

[0032] 2、试验前的准备工作：

[0033] (1)将大肠杆菌野生菌株BW25113传代于琼脂培养基上，培养至合适大小。

[0034] (2)用精密天平称取红霉素粉末0.0522g在离心管中，加入10mL无水乙醇进行溶解，红霉素浓度为5120μg/mL，涡旋混匀进行过滤，将滤液通过直径0.22μm的滤膜进行物理除菌，分装至灭菌的离心管中，置于‑20℃冰柜，避光保存。

[0035] (3)用精密天平称取甲磺酸酚妥拉明粉末0.3081g在离心管中，加入10mL纯水进行溶解，酚妥拉明溶液浓度为80mM，震荡混匀进行过滤，将滤液通过直径0.22μm的滤膜进行物理除菌，分装至灭菌的离心管中，置于‑20℃冰柜，避光保存。

[0036] 3、MIC测定实验：

[0037] (1)接种大肠杆菌BW25113在装有4mL MH肉汤的离心管中，放入37℃摇床中180rpm震荡4h后取出离心管；

[0038] (2)使用MH肉汤将孵育后的大肠杆菌稀释到100倍，约为106CFU/mL，备用；

[0039] (3)取无菌96孔板，第1孔加180μL MH肉汤培养基，第2‑12孔加入100μL MH肉汤培养基；

[0040] (4)在第1孔加入20μL红霉素(5120μg/mL)或20μL酚妥拉明(80mM)，吹打均匀后，吸取100μL到第2孔，依次类推，第10孔吸取100μL弃去；

[0041] (5)第1到11孔加入稀释好的菌液100μL，第12孔加入100μL MH肉汤；

[0042] (6)96孔板中1‑10孔红霉素终浓度(μg/mL)为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5，11孔为生长对照，12孔为空白对照；

[0043] (7)96孔板中1‑10孔酚妥拉明终浓度(mM)为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.0156、0.0078，11孔为生长对照，12孔为空白对照；

[0044] (8)每个药物设置3行重复；

[0045] (9)将接种好的96孔板放入37℃培养箱中孵育16‑18h，读取结果。

[0046] 结果如表1所示，BW 25113红霉素MIC值为32μg/mL，酚妥拉明MIC值为1mM。在低于MIC值的浓度下，细菌没有被明显的抑制生长。

[0047] 表1酚妥拉明和红霉素对大肠杆菌的MIC

[0048]

[0049] 实施例2酚妥拉明添加影响红霉素对大肠杆菌MIC值

[0050] 1、实验材料：

[0051] (1)试验：将经高压灭菌的MH肉汤冷却备用。

[0052] (2)红霉素：Macklin(麦克林)品牌，MW为733.93，纯度为98％；

[0053] 酚妥拉明：Macklin(麦克林)品牌，MW为377.456，纯度为98％；

[0054] 试验菌株：大肠杆菌野生菌株BW25113(实验室保藏)。

[0055] 2、试验前的准备工作：

[0056] (1)将大肠杆菌野生菌株BW25113传代于琼脂培养基上，培养至合适大小。

[0057] (2)用精密天平称取红霉素粉末0.0522g在离心管中，加入10mL无水乙醇进行溶解，红霉素浓度为5120μg/mL，涡旋混匀进行过滤，将滤液通过直径0.22μm的滤膜进行物理除菌，分装至灭菌的离心管中，置于‑20℃冰柜，避光保存。

[0058] (3)用精密天平称取甲磺酸酚妥拉明粉末0.3081g在离心管中，加入10mL纯水进行溶解，酚妥拉明溶液浓度为80mM，震荡混匀进行过滤，将滤液通过直径0.22μm的滤膜进行物理除菌，分装至灭菌的离心管中，置于‑20℃冰柜，避光保存。

[0059] 3、酚妥拉明和红霉素联合MIC测定实验：

[0060] (1)接种大肠杆菌BW25113单菌落在装有4mL MH肉汤的离心管中，放入37℃摇床中180rpm震荡4h后取出离心管；

[0061] (2)使用MH肉汤将孵育后的大肠杆菌稀释到100倍，约为106CFU/mL，备用；

[0062] (3)在离心管中将配置好的红霉素稀释成1024μg/mL，备用；

[0063] (4)在平皿中将上述配置好的酚妥拉明稀释成2mM和1mM，备用；

[0064] (5)取无菌96孔板，第1‑12孔加入50μL MH肉汤培养基；

[0065] (6)在第1孔加入50μL(3)中稀释后的红霉素溶液，吹打均匀后，吸取50μL到第2孔，依次类推，第10孔吸取50μL弃去，此时1‑10孔的红霉素浓度(μg/mL)为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1；

[0066] (7)第1到11孔加入50μL(4)中稀释好的2mM的酚妥拉明溶液，12孔加入50μMH肉汤，此时1‑10孔的红霉素浓度(μg/mL)为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5；1‑11孔的酚妥拉明浓度均为1mM；

[0067] (8)在第1到11孔加入稀释好的菌液100μL，12孔加入100μL肉汤，此时1‑10孔的红霉素浓度(μg/mL)为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25；1‑11孔的酚妥拉明浓度均为0.5mM，即1/2MIC，11孔为单独0.5mM酚妥拉明，12孔为空白对照，设置三行重复；

[0068] (9)重复步骤(6)；

[0069] (10)第1到11孔加入50μL(4)中稀释好的1mM的酚妥拉明溶液，12孔加入50μMH肉汤，此时1‑10孔的红霉素浓度(μg/mL)为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5；1‑11孔的酚妥拉明浓度均为0.5mM；

[0070] (11)在第1到11孔加入稀释好的菌液100μL，12孔加入100μL肉汤，此时1‑10孔的红霉素浓度(μg/mL)为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25；1‑11孔的酚妥拉明浓度均为0.25mM，即1/4MIC，11孔为单独0.25mM酚妥拉明，12孔为空白对照，设置三行重复；

[0071] (12)重复步骤(6)；

[0072] (13)第1到12孔加入50μLMH肉汤，此时1‑10孔的红霉素浓度(μg/mL)为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5；

[0073] (14)在第1到12孔加入稀释好的菌液100μL，12孔加入100μLMH肉汤，此时1‑10孔的红霉素浓度(μg/mL)为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25；11孔为生长对照，12组为空白对照，设置三行重复，该组为单独抗生素组；

[0074] (15)将接种好的96孔板放入37度培养箱中孵育16‑18h，读取结果。

[0075] 表2不同浓度的酚妥拉明和红霉素联合对大肠杆菌的MIC

[0076]

[0077] 实施例3酚妥拉明和红霉素联用对大肠杆菌的杀菌效果

[0078] 1、实验材料：

[0079] (1)试验：将经高压灭菌的MH肉汤冷却备用。

[0080] (2)红霉素：Macklin(麦克林)品牌，MW733.93，纯度为98％；

[0081] 酚妥拉明：Macklin(麦克林)品牌，MW377.456，纯度为98％；

[0082] 试验菌株：大肠杆菌野生菌株BW25113(实验室保藏)。

[0083] 2、试验前的准备工作：

[0084] (1)将大肠杆菌野生菌株BW25113传代于琼脂培养基上，培养至合适大小。

[0085] (2)用精密天平称取红霉素粉末0.0522g在离心管中，加入10mL无水乙醇进行溶解，红霉素浓度为5120μg/mL，涡旋混匀进行过滤，将滤液通过直径0.22μm的滤膜进行物理除菌，分装至灭菌的离心管中，置于‑20℃冰柜，避光保存。

[0086] (3)用精密天平称取甲磺酸酚妥拉明粉末0.3081g在离心管中，加入10mL纯水进行溶解，酚妥拉明溶液浓度为80mM，震荡混匀进行过滤，将滤液通过直径0.22μm的滤膜进行物理除菌，分装至灭菌的离心管中，置于‑20℃冰柜，避光保存。

[0087] 3、杀菌曲线实验：

[0088] (1)接种大肠杆菌BW25113单菌落在装有4mL MH肉汤的离心管中，放入37℃摇床中180rpm震荡4h后取出离心管。

[0089] (2)用MH肉汤稀释10倍，得到浓度菌液浓度为107CFU/mL，备用。

[0090] (3)本实验采用体系为4mL，加入菌液为(2)中稀释菌液：

[0091] A)对照组：3.6mLMH肉汤+0.4mL菌液；

[0092] B)单药组：3.2mLMH肉汤+A/B药+0.4mL菌液；

[0093] C)联合组：2.8mLMH肉汤+A药+B药+0.4mL菌液。

[0094] (4)本试验设置6组：

[0095] 大肠杆菌BW25113：①对照组；②单独红霉素组：1MIC(32μg/mL)红霉素；③单独红霉素组：1/2MIC(16μg/mL)红霉素；④单独酚妥拉明组：1/2MIC(0.5mM)酚妥拉明；⑤联合用药组：1MIC红霉素+1/2MIC酚妥拉明；⑥联合用药组：1/2MIC红霉素+1/2MIC酚妥拉明；

[0096] (5)体系配好之后，于37℃，180rpm摇床震荡培养24h。

[0097] (6)在24h时，每管吸取100μL菌液加入装有900μL 0.85％生理盐水的2ml离心管中进行十倍梯度稀释，稀释后吸取25μL滴在MH琼脂培养基上，37度培养箱孵育16～18h，进行菌落计数，实验结果经过三个生物学重复后进行统计。

[0098] 结果如表3和图1所示，空白对照组中细菌正常生长，说明该实验条件下大肠杆菌BW25113能够正常生长；在单药组下，大肠杆菌BW 25113与空白对照组相比没有明显减少，说明单药对大肠杆菌BW 25113的抑制作用不明显；同样结果也显示了单独使用酚妥拉明对大肠杆菌BW 25113的抑制作用不明显；联合组结果表明，红霉素和酚妥拉明的协同作用对大肠杆菌BW 25113的杀菌效果显著。

[0099] 表3红霉素和酚妥拉明联合对大肠杆菌野生菌株BW 25113的杀菌效果

[0100]

[0101] 以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。