一种IL-29生物学活性测定方法

摘要

本发明公开了一种IL‑29生物学活性测定方法。具体地，本发明的方法选用人胚胎肺上皮细胞（L132细胞）作为检测细胞，水泡性口炎病毒（VSV）作为检测病毒，依据IL‑29可以保护人胚胎肺上皮细胞（L132）免受水泡性口炎病毒（VSV）破坏的作用，对存活的L132细胞染色，在一定波长处测定其吸光度，得到IL‑29对L132细胞的保护效应曲线，以此测定IL‑29生物学活性。本发明的方法采用四参数回归计算法进行处理数据，得到的四参数曲线拟合度R2高，准确度好，重复性高，非常适用于IL‑29生物学活性检测。

权利要求

1.一种IL‑29生物学活性测定方法，所述方法包括以下步骤：(1) 病毒扩增：将水泡性口炎病毒（VSV）接种于培养的单层L132细胞中进行病毒扩增，待L132细胞病变达75% 100%时，收集培养上清，所述上清中含有扩增的水泡性口炎病毒；

~

(2) 病毒滴定：使用L132细胞滴定步骤(1)获得的扩增的水泡性口炎病毒的半数细胞培养感染量（50% cell culture infectious dose,CCID50），记半数细胞培养感染时病毒的稀释倍数为1：X，即为病毒滴度；

(3) 参考品和供试品溶液制备：将参考品原液和供试品原液进行系列稀释，获得m1个剂量组的参考品溶液和m2个剂量组的供试品溶液，其中m1=m2，m1(m2)为8‑12；

(4) 供试品测定：使用L132细胞和所述扩增的水泡性口炎病毒对供试品进行测定，具体包括以下子步骤：(4‑a) 将L132细胞接种至培养板的检测孔中，培养T1小时；

(4‑b) 将步骤(3)中制备的参考品溶液和供试品溶液分别加入接种L132细胞的培养板的检测孔中培养T2小时，对应于每个剂量组设置n个复孔，其中n为2或3；

(4‑c) 将步骤(1)获得的扩增的水泡性口炎病毒以1：Y的稀释倍数稀释后加入接种L132细胞的培养板的检测孔中，培养T3小时，其中，X/Y的值为5‑20；

(4‑d) 培养结束后，弃去培养上清，使用结晶紫染色液对检测孔中的细胞进行染色，并测定各个检测孔的吸光度值；

(5) 数据处理和结果计算：采用四参数回归计算法进行处理数据，以系列稀释的参考品溶液和供试品溶液的各剂量组的浓度为横坐标，以基于各浓度的复孔计算的吸光度平均值为纵坐标，作参考品和供试品的四参数曲线，并分别计算参考品和供试品的半数有效浓度(EC50)，从而计算供试品IL‑29生物学相对活性；

2

同时，对测定结果进行可靠性测验，包括参考品和供试品的四参数曲线的曲线拟合度R以及偏离平行。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述系列稀释为等比稀释，等比稀释倍数为2‑5倍。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，使用测定培养液进行系列稀释，所述测定培养液包含：DMEM培养液，7%的胎牛血清，按所述测定培养液的总体积计。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4‑a)中，L132细胞接种的密度为1.0´

5 5

10‑2.0´10cells/ml。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4‑a)中，使用测定培养液接种L132细胞，所述测定培养液包含：DMEM培养液，7%的胎牛血清，按所述测定培养液的总体积计。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，T1为4‑6，T2为18‑24，以及T3为24±2。

7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4‑c)中，使用攻毒培养液稀释步骤(1)获得的扩增的水泡性口炎病毒，所述攻毒培养液包含：DMEM培养液，3%的胎牛血清，按所述攻毒培养液的总体积计。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中，选择四参数回归计算法，采用约束模型中拟合曲线的参考品EC50和供试品EC50相除计算供试品IL‑29生物学相对活性，即供试品IL‑29生物学相对活性(%)=（参考品EC50÷供试品EC50）×100%。

9.一种IL‑29生物学活性测定试剂组合，其特征在于，所述试剂组合包含：(Z1) L132细胞；

(Z2) 水泡性口炎病毒种子液；

(Z3) 参考品，所述参考品为生物学活性确定的IL‑29标准品。

10.一种IL‑29生物学活性测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：(C1) 第一容器，以及位于所述第一容器内的L132细胞；

(C2) 第二容器，以及位于所述第二容器内的水泡性口炎病毒种子液；

(C3) 第三容器，以及位于所述第三容器内的参考品，所述参考品为生物学活性确定的IL‑29标准品；

并且，所述试剂盒包含一说明书，所述说明书记载有权利要求1所述的IL‑29生物学活性测定方法。

说明书

一种IL‑29生物学活性测定方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物学检测技术领域，具体地，涉及一种IL‑29生物学活性测定方法。

背景技术

[0002] 生物检定法是利用生物体包括整体动物、离体组织、器官、细胞和微生物等评估药物生物活性的一种方法。它以药物的药理作用为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计在一定条件下比较供试品与其相当的标准品或对照品所产生的特定反应，通过等反应剂量间比例的运算或限值剂量引起的生物反应程度，从而测定供试品的效价、生物活性或杂质引起的毒性。

[0003] 生物检定是将供试品和其标准品或参考品在相同的实验条件下同时对生物体或其离体器官组织等的作用进行比较，通过对比，计算出它们的等反应剂量比值（R）。生物检定具有一定的实验误差，其主要来源是生物变异性，因此生物检定必须注意控制生物变异，或减少生物变异本身，或用适宜的实验设计来减少生物变异对实验结果的影响，以减少实验误差。生物检定的可靠性测验要求在实验所用的剂量范围内，剂量或对数剂量的反应（或反应的函数）符合特定模型要求，且标准品与供试品的线性满足计算原理的要求，即满足系统适用性和样品适用性要求，方可按有关公式计算供试品的效价和可信限。四参数模型要求其在所用剂量范围内，对数剂量与反应（或反应的函数）呈S曲线关系，供试品和标准品的S形曲线平行。

[0004] IL‑29为III型干扰素IFN‑λ1，其抗病毒效应首先需要通过与III型干扰素受体结合，形成IFNLR1‑IFN‑λ‑IL10R2三元络合物，然后和I型干扰素激活相同的Jak‑STAT（Janus kinase‑signal transducer of transcription）信号传导途径，触发多种具有抗病毒功能的ISGs（干扰素刺激基因）的表达，产生抗病毒的效应。

[0005] 虽然IL‑29与I型干扰素（包括IFNα及IFNβ）的受体不同，但在信号转导途径的高度相似，因此其生物学活性检测方法可参考I型干扰素。《中国药典》三部通则 3523 干扰素生物学活性测定法 第一法 细胞病变抑制法，该法依据干扰素可以保护人羊膜细胞（WISH）免受水泡性口炎病毒（VSV）破坏的作用，用结晶紫对存活的WISH细胞染色，在波长570nm处测定其吸光度，可得到干扰素对WISH细胞的保护效应曲线，以此测定I型干扰素生物学活性。

[0006] 因此，本领域仍需研发一种能够准确测定IL‑29生物学活性的测定方法。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种能够准确评价IL‑29生物学活性测定方法。本发明的IL‑29生物学活性测定方法测试原理为：依据IL‑29可以保护人胚胎肺上皮细胞（L132）免受水泡性口炎病毒（VSV）破坏的作用，并对存活的L132细胞染色，在一定波长处测定其吸光度，可得到IL‑29对L132细胞的保护效应曲线，以此测定IL‑29生物学活性。

[0008] 本发明的第一方面，提供了一种IL‑29生物学活性测定方法，所述方法包括以下步骤：

[0009] (1) 病毒扩增：将水泡性口炎病毒（VSV）接种于培养的单层L132细胞中进行病毒扩增，待L132细胞病变达75% 100%时，收集培养上清，所述上清中含有扩增的水泡性口炎病~毒；

[0010] (2) 病毒滴定：使用L132细胞滴定步骤(1)获得的扩增的水泡性口炎病毒的半数细胞培养感染量（50% cell culture infectious dose,CCID50），记半数细胞培养感染时病毒的稀释倍数为1：X，即为病毒滴度；

[0011] (3) 参考品和供试品溶液制备：将参考品原液和供试品原液进行系列稀释，获得m1个剂量组的参考品溶液和m2个剂量组的供试品溶液，其中m1=m2；

[0012] (4) 供试品测定：使用L132细胞和所述扩增的水泡性口炎病毒对供试品进行测定，具体包括以下子步骤：

[0013] (4‑a) 将L132细胞接种至培养板的检测孔中，培养T1小时；

[0014] (4‑b) 将步骤(3)中制备的参考品溶液和供试品溶液分别加入接种L132细胞的培养板的检测孔中培养T2小时，对应于每个剂量组设置n个复孔，其中n为2或3；

[0015] (4‑c) 将步骤(1)获得的扩增的水泡性口炎病毒以1：Y的稀释倍数稀释后加入接种L132细胞的培养板的检测孔中，培养T3小时，其中，X/Y的值为5‑20；

[0016] (4‑d) 培养结束后，弃去培养上清，使用结晶紫染色液对检测孔中的细胞进行染色，并测定各个检测孔的吸光度值；

[0017] (5) 数据处理和结果计算：采用四参数回归计算法进行处理数据，以系列稀释的参考品溶液和供试品溶液的各剂量组的浓度为横坐标，以基于各浓度的复孔计算的吸光度平均值为纵坐标，作参考品和供试品的四参数曲线，并分别计算参考品和供试品的半数有效浓度(EC50)，从而计算供试品IL‑29生物学相对活性；

[0018] 同时，对测定结果进行可靠性测验，包括参考品和供试品的四参数曲线的曲线拟2
合度R以及偏离平行。

[0019] 在另一优选例中，在步骤(1)中，收集的培养上清被冷冻保存供后续使用，所述冷冻保存条件为‑80℃及以下。

[0020] 在另一优选例中，在步骤(1)中，使用完全培养液对L132细胞进行培养，所述完全培养液包含：DMEM培养液，10%的胎牛血清，按所述完全培养液的总体积计。

[0021] 在另一优选例中，在步骤(1)中，使用含10%胰酶的DMEM培养液，按1:100稀释水泡性口炎病毒原液（种子液）后，再将其接种于培养的单层L132细胞中进行病毒扩增。

[0022] 在另一优选例中，在步骤(2)中，所述病毒滴定具体包括以下步骤：

[0023] (2‑a) 将L132细胞接种至培养板的检测孔中，培养Ta小时；

[0024] (2‑b) 将步骤(1)获得的扩增的水泡性口炎病毒进行系列稀释；

[0025] (2‑c) 将系列稀释的水泡性口炎病毒加入到接种有L132细胞的检测孔中，培养Tb小时；

[0026] (2‑d) 培养结束后，弃去培养上清，使用结晶紫染色液对检测孔中的细胞进行染色，并测定各个检测孔的吸光度值，从而计算出步骤(1)获得的扩增的水泡性口炎病毒的半数细胞培养感染量（50% cell culture infectious dose,CCID50）,记半数细胞培养感染时病毒的稀释倍数为1：X，即为病毒滴度。

[0027] 在另一优选例中，在步骤(2‑a)中，L132细胞接种的密度为1.0´105‑2.0´105个/ml。

[0028] 在另一优选例中，在步骤(2‑a)中，使用测定培养液接种L132细胞，所述测定培养液包含：DMEM培养液，7%的胎牛血清，按所述测定培养液的总体积计。

[0029] 在在另一优选例中，在步骤(2‑a)中，Ta为24±2。

[0030] 在另一优选例中，在步骤(2‑b)中，使用测定培养液进行系列稀释，所述测定培养液包含：DMEM培养液，7%的胎牛血清，按所述测定培养液的总体积计。

[0031] 在另一优选例中，在步骤(2‑b)中，所述系列稀释为等比稀释，等比稀释倍数为2‑10倍，较佳地为5倍。

[0032] 在在另一优选例中，在步骤(2‑c)中，Tb为24±2。

[0033] 在另一优选例中，在步骤(2‑d)中，“使用结晶紫染色液对检测孔中的细胞进行染色”包括步骤：50μl/孔加入染色液后室温放置20‑40分钟（较佳地30分钟），用流水冲去染色液和死细胞，并吸干残留水分后，加入脱色液100μl/孔，室温放置3‑5分钟。

[0034] 在另一优选例中，所述结晶紫染色液的配方如下：称取结晶紫50mg，加无水乙醇20ml溶解后，加水稀释至100ml。

[0035] 在另一优选例中，所述脱色液的配方如下：量取无水乙醇50ml、醋酸0.1ml，加水稀释至100ml。

[0036] 在另一优选例中，在步骤(2‑d)中，以630nm为参比波长，570nm为检测波长测定吸光度。

[0037] 在另一优选例中，在步骤(3)中，所述系列稀释为等比稀释，等比稀释倍数为2‑5倍，较佳地为3‑4倍。

[0038] 在另一优选例中，在步骤(3)中，所述系列稀释的首个剂量组的适宜浓度为100‑300ng/ml，较佳地，200ng/ml。

[0039] 在另一优选例中，在步骤(3)中，m1(m2)为8‑12，较佳地为10。

[0040] 在另一优选例中，在步骤(3)中，使用测定培养液进行系列稀释，所述测定培养液包含：DMEM培养液，7%的胎牛血清，按所述测定培养液的总体积计。

[0041] 在另一优选例中，在步骤(4‑a)中，L132细胞接种的密度为1.0´105‑2.0´105cells/ml。

[0042] 在另一优选例中，在步骤(4‑a)中，使用测定培养液接种L132细胞，所述测定培养液包含：DMEM培养液，7%的胎牛血清，按所述测定培养液的总体积计。

[0043] 在另一优选例中，在步骤(4‑a)中，T1为4‑6。

[0044] 在另一优选例中，在步骤(4‑b)中，T2为18‑24。

[0045] 在另一优选例中，在步骤(4‑b)中，系列稀释的参考品溶液和供试品溶液加入各检测孔的体积为50‑200μl/孔，较佳地100μl/孔。

[0046] 在另一优选例中，在步骤(4‑c)中，使用攻毒培养液稀释步骤(1)获得的扩增的水泡性口炎病毒，所述攻毒培养液包含：DMEM培养液，3%的胎牛血清，按所述攻毒培养液的总体积计。

[0047] 在另一优选例中，在步骤(4‑c)中，T3为24±2。

[0048] 在另一优选例中，在步骤（4‑c）中，X/Y的值为10，即扩增的水泡性口炎病毒的攻毒量为10 CCID50。

[0049] 在另一优选例中，在步骤(4‑d)中，“使用结晶紫染色液对检测孔中的细胞进行染色”包括步骤：50μl/孔加入染色液后室温放置20‑40分钟（较佳地30分钟），用流水冲去染色液和死细胞，并吸干残留水分后，加入脱色液100μl/孔，室温放置3‑5分钟。

[0050] 在另一优选例中，所述结晶紫染色液的配方如下：称取结晶紫50mg，加无水乙醇20ml溶解后，加水稀释至100ml。

[0051] 在另一优选例中，所述脱色液的配方如下：量取无水乙醇50ml、醋酸0.1ml，加水稀释至100ml。

[0052] 在另一优选例中，在步骤(4‑d)中，以630nm为参比波长，570nm为检测波长测定吸光度。

[0053] 在另一优选例中，在步骤(5)中，选择四参数回归计算法，采用约束模型中拟合曲线的参考品EC50和供试品EC50相除计算供试品IL‑29生物学相对活性，即

[0054] 供试品IL‑29生物学相对活性(%)=（参考品EC50÷供试品EC50）×100%。

[0055] 在另一优选例中，在步骤(5)中，测定结果的可靠性标准如下：

[0056] 参考品和供试品的四参数曲线的自由模型和约束模型的曲线拟合度R2不低于0.98；

[0057] 偏离平行应不显著，即P≥0.01。

[0058] 在另一优选例中，所述参考品为生物学活性确定的IL‑29标准品。

[0059] 在另一优选例中，所述培养板为96孔细胞培养板。

[0060] 在另一优选例中，所述方法中，培养条件为37℃，5% CO2。

[0061] 本发明的第二方面，提供了一种IL‑29生物学活性测定试剂组合，所述试剂组合包含：

[0062] (Z1) L132细胞；

[0063] (Z2) 水泡性口炎病毒种子液；

[0064] (Z3) 参考品，所述参考品为生物学活性确定的IL‑29标准品。

[0065] 在另一优选例中，所述试剂组合进一步包含：

[0066] (Z4) 用于配制完全培养液、测定培养液和攻毒培养液的DMEM培养液和胎牛血清，其中所述完全培养液包含：DMEM培养液，10%的胎牛血清，按所述完全培养液的总体积计；所述测定培养液包含：DMEM培养液，7%的胎牛血清，按所述测定培养液的总体积计；所述攻毒培养液包含：DMEM培养液，3%的胎牛血清，按所述攻毒培养液的总体积计；和/或[0067] (Z5) 结晶紫染色液和脱色液。

[0068] 本发明的第三方面，提供了一种IL‑29生物学活性测定试剂盒，所述试剂盒包含：

[0069] (C1) 第一容器，以及位于所述第一容器内的L132细胞；

[0070] (C2) 第二容器，以及位于所述第二容器内的水泡性口炎病毒种子液；

[0071] (C3) 第三容器，以及位于所述第三容器内的参考品，所述参考品为生物学活性确定的IL‑29标准品；

[0072] 并且，所述试剂盒包含一说明书，所述说明书记载有本发明第一方面所述的IL‑29生物学活性测定方法。

[0073] 在另一优选例中，所述试剂盒进一步包含：

[0074] (C4) 第四容器和第五容器，以及位于所述第四容器中的DMEM培养液和位于所述第五容器中的胎牛血清；和/或

[0075] (C5) 第六容器和第七容器，以及位于所述第六容器中的结晶紫染色液和位于第七容器中的脱色液。

[0076] 应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

[0077] 图1显示了WISH‑VSV检测IL‑29和IFNα1b生物学活性剂量反应曲线图；其中，Plot1为IFNα1b，Plot2为自制批次IL‑29样品A，Plot3为自制批次IL‑29样品B。

[0078] 图2显示了HepG2‑VSV检测IL‑29的生物学活性剂量反应曲线图；其中，Plot1为自制批次IL‑29样品C，Plot2为自制批次IL‑29样品D。

[0079] 图3显示了L132‑VSV检测三批IL‑29样品的生物学活性剂量反应曲线图。

[0080] 图4显示了参考品和供试品自由模型拟合曲线；其中Plot2为参考品的自由模型拟合曲线，Plot3为供试品的自由模型拟合曲线。

[0081] 图5显示了参考品和供试品约束模型拟合曲线；其中，Plot3为参考品约束模型的拟合曲线，Plot4为供试品约束模型的拟合曲线。

[0082] 图6显示了本发明参考品和供试品四参数拟合曲线图；其中，Plot1为参考品约束模型的拟合曲线，Plot3为供试品约束模型的拟合曲线。

[0083] 图7显示了IL‑29生物学测定法生物学活性理论值对数值与测定值对数值的直线回归方程。

具体实施方式

[0084] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地研发出了一种能够准确评价IL‑29生物学活性测定方法。本发明人通过大量的筛选实验，从众多细胞中选择了对检测病毒VSV和IL‑29均有很好的响应，且被VSV病毒感染后容易从细胞培养板脱落的L132细胞（一种人胚胎肺上皮细胞）作为检测细胞，最大程度地降低了后续细胞染色的本底水平，使细胞染色检测结果更加准确。同时，制定了合理化的检测步骤和数据分析方法，并进一步确定了包括病毒扩增、病毒滴定、参考品和供试品溶液制备、供试品测定各步骤中的各项参数，使测定结果准确可靠，施用于广泛的IL‑29生物学活性评估。

[0085] 在此基础上，完成了本发明。

[0086] 术语

[0087] 为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

[0088] 如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1%。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

[0089] 如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

[0090] 本发明的方法

[0091] 本发明提供了一种IL‑29生物学活性测定方法，所述方法包括以下步骤：

[0092] (1) 病毒扩增：将水泡性口炎病毒（VSV）接种于培养的单层L132细胞中进行病毒扩增，待L132细胞病变达75% 100%时，收集培养上清，所述上清中含有扩增的水泡性口炎病~毒；

[0093] (2) 病毒滴定：使用L132细胞滴定步骤(1)获得的扩增的水泡性口炎病毒的半数细胞培养感染量（50% cell culture infectious dose,CCID50），记半数细胞培养感染时病毒的稀释倍数为1：X，即为病毒滴度，该步骤包括以下子步骤：

[0094] (2‑a) 将L132细胞接种至培养板的检测孔中，培养24±2小时；

[0095] (2‑b) 将步骤(1)获得的扩增的水泡性口炎病毒进行系列稀释；

[0096] (2‑c) 将系列稀释的水泡性口炎病毒加入到接种有L132细胞的检测孔中，培养24±2小时；

[0097] (2‑d) 培养结束后，弃去培养上清，使用结晶紫染色液对检测孔中的细胞进行染色，并测定各个检测孔的吸光度值，从而计算出步骤(1)获得的扩增的水泡性口炎病毒的半数细胞培养感染量（50% cell culture infectious dose,CCID50）；

[0098] (3) 参考品和供试品溶液制备：将参考品原液和供试品原液进行系列稀释，获得m1个剂量组的参考品溶液和m2个剂量组的供试品溶液，其中m1=m2，且m1(m2)为8‑12，较佳地为10；

[0099] (4) 供试品测定：使用L132细胞和所述扩增的水泡性口炎病毒对供试品进行测定，具体包括以下子步骤：

[0100] (4‑a) 将L132细胞接种至培养板的检测孔中，培养4‑6小时；

[0101] (4‑b) 将步骤(3)中制备的参考品溶液和供试品溶液分别加入接种L132细胞的培养板的检测孔中培养18‑24小时，对应于每个剂量组设置n个复孔，其中n为2或3；

[0102] (4‑c) 将步骤(1)获得的扩增的水泡性口炎病毒以1：Y的稀释倍数稀释后加入接种L132细胞的培养板的检测孔中，培养24±2小时，其中，X/Y的值为5‑20，优选地为10；

[0103] (4‑d) 培养结束后，弃去培养上清，使用结晶紫染色液对检测孔中的细胞进行染色，并测定各个检测孔的吸光度值；

[0104] (5) 数据处理和结果计算：采用四参数回归计算法进行处理数据，以系列稀释的参考品溶液和供试品溶液的各剂量组的浓度为横坐标，以基于各浓度的复孔计算的吸光度平均值为纵坐标，作参考品和供试品的四参数曲线，并分别计算参考品和供试品的半数有效浓度(EC50)，从而计算供试品IL‑29生物学相对活性；

[0105] 同时，对测定结果进行可靠性测验，包括参考品和供试品的四参数曲线的曲线拟2
合度R以及偏离平行。

[0106] 对于检测细胞和检测病毒的选择：

[0107] 检测细胞为人胚胎肺上皮细胞（L132细胞），相较于其它细胞，该细胞对检测病毒VSV和IL‑29均有很好的响应，而且被病毒感染死亡后能够从细胞培养板脱落，并不会影响后续结晶紫的染色从而导致本底很高。

[0108] 对于试剂的制备：

[0109] 完全培养液：含10% FBS的DMEM培养液，用于L132细胞的正常培养；测定培养液：含7% FBS的DMEM培养液，用于病毒滴定步骤中L132细胞接种前稀释和水泡性口炎病毒的系列稀释，参照品和供试品溶液制备步骤中系列稀释，以及供试品测定步骤中L132细胞接种前稀释；攻毒培养液：含3% FBS的DMEM培养液，用于供试品测定步骤中对水泡性口炎病毒进行系列稀释。其中测定培养液和攻毒培养液的FBS浓度不应随意调整，调整后会影响IL‑29参考品和供试品的加入浓度、攻毒用量和四参数拟合曲线的上下平台。

[0110] 在病毒滴定中：

[0111] 病毒滴定的方式和IL‑29生物学活性测定的条件保持一致，包括接种的细胞数量、培养基、染色方法、数据处理等，这样可以保证病毒滴度可以和IL‑29的测定所建议使用的病毒滴度相匹配。

[0112] 对于在参考品和供试品溶液制备中：

[0113] 实验设计中要求的参考品溶液和供试品溶液的剂量组数应相等，每个剂量组反应值的个数也应相等。每组剂量间隔一般呈连续的等比稀释。参考品和供试品溶液的板内的系列浓度应保证最终的四参数曲线均近似于S形，且出现明显上下平台。考虑到有边缘效应的外周孔弃用，一般参考品和供试品溶液为10个系列浓度。

[0114] 按照本发明的比较，系列稀释倍数选择4倍可以保证上下平台各有2 3个浓度点，~符合可靠性检验中“有明显的上下平台”的要求。如果实验条件和供试品比较稳定、操作比较熟练，可将系列稀释倍数调整为3倍，能进一步提高检测的准确度，倍比稀释不推荐，难以保证同时出现明显的上下平台。

[0115] 对于供试品测定：

[0116] VSV攻毒所用滴度应保证IL‑29的量效反应拟合曲线为S型，过高的病毒滴度可能会影响上平台的出现，而过低的病毒滴度可能会影响下平台的出现。

[0117] 细胞染色后需用流水小心冲去染色液，并吸干残留水分，如果流水比较急，可能会将贴壁的活细胞层冲下来，导致复孔差异大。同时需要吸干残留水分，有残留水分同样会导致复孔差异大。

[0118] 在数据处理并计算结果中的四参数回归计算法中：

[0119] 需按照《中国药典》2020版 三部通则1431生物检定统计法中四参数回归计算法进行数据处理和结果计算。该法要求在一定剂量范围内，标准品或参考品（S）和供试品（T）的对数剂量x与反应值或反应值的特定函数y呈“S”或反“S”形关系，可拟合成四参数逻辑斯蒂回归方程，拟合曲线对称于拐点，上下各有一渐进线，当S和T的活性组分基本相同时，两拟合曲线平行。

[0120] 四参数逻辑斯蒂曲线方程：

[0121]

[0122] 上述式中     y为反应值或反应值的特定函数

[0123]              d为标准品或供试品的各剂量

[0124]              A为d→0时的y（S形：下渐近线；反S形：上渐近线）

[0125]              D为d→∞时的y(S形：下渐近线；反S形：上渐近线)

[0126]              C为y=(A+D)/2时对应的d，即50%效应浓度（EC50或ED50）

[0127]              B为斜率因子（与EC50或ED50处曲线斜率相关）

[0128] 采用计算机软件中四参数逻辑斯蒂自由模型和约束模型，按照非线性最小二乘法的原则，进行S和T自由拟合及约束拟合曲线中A、B、C、D四个参数的估计值，约束模型为一平行曲线模型，其中S与T拟合方程的A、B、D三个参数的估计值分别相同，仅参数C的估计值不同。

[0129] 对于可靠性成立的实验结果，方可按等反应剂量比的原则，采用约束模型中的S和T拟合曲线EC50的比值，计算供试品的相对生物学活性（R）

[0130] R=（标准品EC50÷供试品EC50）×100%

[0131] 在数据处理并计算结果中的四参数回归计算法可靠性测验中：

[0132] 参考品和供试品四参数曲线要求是均近似于S形，且出现明显上下平台。这样的四参数曲线进行自由拟合及约束拟合的A、B、C、D四个参数的估计值更准确。

[0133] R2衡量的是四参数回归方程整体的拟合度，是表达因变量与所有自变量之间的总2
体关系，R的值越接近1，说明四参数回归曲线对检测值的拟合程度越好。

[0134] 偏离平行反映的是两拟合曲线平行程度，当S和T的活性组分基本相同时，两拟合曲线平行。当偏离平行越不显著，说明两拟合曲线平行程度越高。约束模型中估算的参数C（代表S和T的EC

[0135] 50）越准确。

[0136] 本发明的试剂组合和试剂盒

[0137] 根据本发明的IL‑29生物学活性测定方法，本发明还提供了一种用于IL‑29生物学活性测定的试剂组合，所述试剂组合包含：(Z1) L132细胞；(Z2) 水泡性口炎病毒种子液；(Z3) 参考品，所述参考品为生物学活性确定的IL‑29标准品；或者，所述试剂组合可进一步包含：(Z4) 用于配制完全培养液、测定培养液和攻毒培养液的DMEM培养液和胎牛血清；和/或(Z5) 结晶紫染色液和脱色液。

[0138] 进一步地，可将上述试剂组合的各成分置于各自独立的容器中，并将其组合放置于一试剂盒内，从而获得一种IL‑29生物学活性测定试剂盒。并且，所述试剂盒内配置一说明书，所述说明书记载有本发明第一方面所述的IL‑29生物学活性测定方法。

[0139] 本发明所用的细胞

[0140] L132细胞：一种市售的人胚胎肺上皮细胞，ATCC货号为CCL‑5,可购自宁波明舟生物科技有限公司

[0141] WISH细胞：一种市售的人羊膜细胞，ATCC货号为CCL‑25,可购自上海奥陆生物科技有限公司

[0142] HepG2细胞：一种市售的人肝癌细胞，CCTCC库编号GDC0024，可购自中国典型培养物保藏中心

[0143] A549细胞：一种市售的人非小细胞肺癌细胞，ATCC货号为CCL‑185，可购自上海中乔新舟生物科技有限公司

[0144] 本发明的有益效果包括：

[0145] 本发明的研究表明：即使加入高浓度的IL‑29，也不能对WISH细胞产生保护作用。而文献中常用的人肺腺癌细胞（A549）、人肝癌细胞（HepG2）虽然对IL‑29和VSV病毒都有响应，但该细胞被VSV病毒感染后很难从细胞培养板脱落，造成很高的本底，存在四参数拟合曲线下平台值高、剂量‑反应曲线不特别陡峭、实验误差较大等问题。

[0146] L132细胞对检测病毒VSV敏感，对检测样品IL‑29有很好的响应，而且L132细胞被病毒VSV攻击致死后能够从细胞培养板脱落，只需通过流水就可以冲去，避免残留在细胞板上造成很高的本底。

[0147] 通过确定优选的各培养液血清浓度、细胞接种量、病毒攻击滴度、IL‑29加样浓度范围、IL‑29作用时间，VSV病毒作用时间，细胞染色方式可以保证IL‑29的对数剂量x与吸光度y成“S”形关系，可拟合成四参数逻辑斯蒂回归方程。该方法剂量‑反应曲线陡峭，四参数曲线拟合度高，可靠性测验通过率高，实验误差小，检测结果重复性高。

[0148] 下面，通过具体的实施例对本发明做进一步说明。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。

[0149] 实施例1 细胞筛选

[0150] 为建立IL‑29的生物学活性测定法，首先尝试采用WISH细胞和VSV病毒组合检测IL‑29的生物学活性，但即使加入高浓度的IL‑29，也不能对WISH细胞产生保护作用，而IFNα1b则能保护WISH细胞免受VSV病毒的破坏作用，结果如图1所示。

[0151] 由于WISH细胞对IL‑29的响应不明显，选取了根据文献常用的HepG2（人肝癌细胞）进行测试。结果显示IL‑29可以对HepG2提供保护，而且结晶紫染色后结果如图2所示：上下平台吸光度有0.8左右的差异，存在IL‑29的剂量反应曲线，不过，HepG2‑VSV法仍存在检测的下平台值高、剂量‑反应曲线不特别陡峭、实验误差较大等问题。

[0152] 根据文献又测试了人非小细胞肺癌细胞（A549细胞），虽然显微镜可以观察到IL‑29对A549细胞有保护作用，但用结晶紫染色后，病毒对照组和IL‑29保护组的吸光度几乎没有变化。

[0153] 鉴于上皮细胞一般高表达III型干扰素受体，又继续筛选了人上皮细胞细胞株，包括HBE(人支气管上皮样细胞)、HBEpiC（人支气管上皮细胞）、hACE2‑HeLa（转入人ACE2基因的宫颈癌细胞）、HNEpC（鼻粘膜上皮细胞）、Vero（非洲绿猴肾细胞）、L132（人胚胎肺上皮细胞）、Calu‑3（人肺腺癌细胞）、IEC‑6（大鼠小肠上皮细胞）、INS‑1（大鼠胰岛细胞瘤细胞）和GL261（小鼠胶质瘤细胞）。研究显示L132不仅对IL‑29敏感，结晶紫染色后吸光度差异大，四2
参数曲线拟合度高，R能达到0.99以上（见图3），最终确定选用该方法用于IL‑29的生物学测定。

[0154] 实施例2 本发明的IL‑29生物学活性测定方法

[0155] （1）试剂、检测病毒和检测细胞的准备

[0156] 主要使用以下原始材料：DMEM培养基；胎牛血清；胰酶；L132细胞。

[0157] 染色液：称取结晶紫50mg，加无水乙醇20ml溶解后，加水稀释至100ml；

[0158] 脱色液：量取无水乙醇50ml、醋酸0.1ml，加水稀释至100ml；

[0159] 完全培养液：胎牛血清 10ml，加DMEM培养液90ml；

[0160] 测定培养液：胎牛血清 7ml，加DMEM培养液93ml，现配现用。

[0161] 攻毒培养液：胎牛血清 3ml，加DMEM培养液97ml，现配现用。

[0162] （2）病毒扩增、保存和滴定

[0163] a. 扩增和保存：

[0164] 用DMEM培养液稀释的10%胰酶，按1:100稀释VSV，接种于生长良好的单层L132细胞中进行增殖，于37℃，5% CO2培养箱中培养至细胞病变达75%~100%时，吹打后3000rpm离心20分钟，收集上清（含有扩增的水泡性口炎病毒），冻存于‑80℃以下；

[0165] b.滴定：

[0166] 将细胞密度调整为1.0´105 2.0´105cells/ml，取细胞悬液接种于96孔板，100μl/~孔，于37℃培养24小时，将扩增的水泡性口炎病毒从原倍开始依次5倍系列稀释，100μl/孔加入到细胞中，于37℃，5% CO2培养箱中培养24小时后结晶紫染色读数并计算出半数细胞培养感染量（50% cell culture infectious dose,CCID50），用于攻毒的病毒滴度一般为约
10 CCID50。

[0167] （3）参考品和供试品溶液制备

[0168] 将参考品和供试品稀释至适宜浓度，在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共10个稀释度，每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。

[0169] （4）供试品测定

[0170] a.L132细胞接种：取对数生长期的L132细胞，离心后加入DMEM培养液洗涤3次。细5 5
胞重悬于测定培养液中，将细胞密度调整为1.0´10 2.0´10cells/ml，取细胞悬液接种于~
96孔板，100μl/孔，于37℃，5% CO2培养箱中培养4~6小时。

[0171] b.加样：将配制完的参考品和供试品溶液移入接种L132细胞的培养板中，100μl/孔，于37℃，5% CO2培养箱中培养18~24小时。96孔板外圈加入测定培养液，100μl/well；

[0172] c.细胞攻毒：弃去细胞培养板中的上清液，将保存的水泡性口炎病毒（前述(2)a中的“上清”）用攻毒培养液稀释至约10 CCID50，100μl/孔，于37℃，5% CO2培养箱中培养24小时；

[0173] d. 结晶紫检测：弃去细胞培养板中的上清液，每孔加入染色液50μl，室温放置30分钟后，用流水小心冲去染色液，并吸干残留水分，每孔加入脱色液100μl，室温放置3 5分~钟。将96孔板放入多功能酶标仪，混匀并以630nm为参比波长，在570nm波长处测定吸光度，记录测定结果；

[0174] （5）数据处理并计算结果

[0175] a.采用酶标仪自带的四参数回归计算法进行处理，以参考品和供试品蛋白浓度（ng/ml）为横坐标，以OD570平均值为纵坐标，作四参数曲线并分别计算参考品和供试品的半数有效浓度EC50(ng/ml)，按下式计算供试品IL‑29生物学相对活性（参考品EC50和供试品EC50均为约束模型）

[0176] 供试品IL‑29生物学相对活性(%)=（参考品EC50÷供试品EC50）×100%

[0177] b.系统适用性和样品适用性可接受标准（可靠性测验）

[0178] 参考品和供试品四参数曲线均近似于S形，且出现明显上下平台；

[0179] 曲线拟合度R2不低于0.98；

[0180] 偏离平行应不显著（P≥0.01）。

[0181] 经上述试验，获得系列浓度参考品和供试品的吸光度值见表2‑1和表2‑2。

[0182] 表2‑1 参考品系列浓度和吸光度值

[0183]

[0184] 表2‑2 供试品系列浓度和吸光度值

[0185]

[0186] 采用计算机软件中四参数逻辑斯蒂自由模型和约束模型，按照非线性最小二乘法的原则，进行参考品和供试品自由拟合（图4）及约束拟合，并估计曲线中A、B、C、D四个参数2
值，R 为曲线拟合度；约束模型为一平行曲线模型，其中参考品与供试品拟合方程的A、B、D三个参数的估计值分别相同，仅参数C的估计值不同（见图5）。约束模型中Plot4的Estimated Ref.Plot值为供试品的相对生物学活性，F‑Prob值为偏离平行的P值。

[0187] 实施例3 本发明方法的四参数拟合度R2评估经上述试验，获得参考品和供试品的2
四参数拟合曲线（图6），曲线的拟合度R 是本实验检测结果可靠性、准确性和重复性的关
2
键。拟合度R 衡量的是回归方程整体的拟合度，是表示因变量与所有自变量之间的总体关
2
系。R 等于回归平方和在总平方和中所占的比率，即回归方程所能解释的因变量变异性的
2
百分比。R的值越接近1，说明四参数回归曲线对检测值的拟合程度越好。

[0188] 《中国药典》三部 通则3531 尼妥珠单抗生物学活性测定法和 通则3535 康柏西2 2 2
普生物学活性测定法中对四参数曲线拟合度R 要求分别是“R 应大于0.92”和“拟合度R 大于0.95”。本例同样是基于细胞的生物学活性测定方法，经多次上述试验获得参考品的四参
2
数拟合曲线，列举了6次不同日期测试的参考品的四参数曲线拟合度R ，均高于0.99（见表
3‑1），该拟合度结果已经达到基于ELISA原理的检测方法对四参数曲线拟合度的要求，远高于中国药典中列举的两种基于细胞的生物活性检测方法对四参数曲线拟合度的要求。

[0189] 表3‑1 参考品四参数曲线拟合度R2的结果汇总

[0190]

[0191] 实施例4 本发明方法的相对准确度、精密度评估

[0192] 相对准确度：系指在规定的范围内，测得的相对活性与真实值或参考值接近的程度，一般用相对偏倚（RB，%）表示。取供试品稀释至不同的目标活性水平，为了获得更可靠的结果，需评估5个，每个活性水平分别至少独立测定3次。以活性理论值的对数（横坐标）对其相应的活性测定值的对数（纵坐标）作直线回归。采用每个活性水平测定值的相对偏倚和不同活性水平相对偏倚的变化趋势来评价相对准确度，其中相对偏倚的变化趋势可用直线回归方程的斜率进行评价。

[0193] RB=（（效价测定值÷效价理论值）‑1）×100%

[0194] 本发明选取了配制相当于参考品生物学活性的200%、150%、100%、50%和10%的供试品溶液，用于考察检测方法的相对准确度，结果见表4‑1。本发明方法检测的各个浓度的相对偏倚均在±25%范围内，尤其是100%浓度以上，均在±10%范围内。以活性理论值的对数（横坐标）对其相应的活性测定值的对数（纵坐标）作直线回归，回归方程为y=1.05x+0.02，回归方程的斜率为1.05，不仅符合0.80 1.25的范围要求，而且非常接近于斜率最佳值~1.00。结果表明该方法的相对准确度很高。

[0195] 表4‑1 IL‑29生物学测定法不同生物学活性水平测定值的相对偏倚

[0196]

[0197] 精密度：指在规定的测定条件下，同一份均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度，相对活性测定方法的精密度一般用几何标准偏差（GSD）或几何变异系数（GCV，%）表示。在规定范围内，考察随机变动因素如不同日期、不同分析人员、不同仪器、不同关键试剂批次等对精密度的影响。在每个活性水平上，测得的相对活性的几何标准偏差计算公式如下：

[0198] GSD=antilog(SD)

[0199] 式中SD为每个活性水平活性测定值的对标标准偏差。

[0200] 每个活性水平上，测得的相对活性的几何变异系数计算公式如下：

[0201] GCV=(GSD‑1)×100%

[0202] 本发明选取了配制相当于参考品生物学活性的200%、150%、100%、50%和10%的供试品溶液，用于考察检测方法的精密度。结果见表4‑2，本发明方法的各个浓度的测定的相对活性的几何变异系数GCV均在±25%范围内，表明该方法精密度高。

[0203] 表4‑2 IL‑29生物学测定法不同生物学活性水平测定值的几何标准偏差和几何变异系数

[0204]

[0205] 线性：通常系指在设计的范围内，测得相对活性与真实值或参考值之间的线性关系，为与相对准确度相关的稀释线性。通常在规定的范围内，取参考品稀释至不同的目标活性水平，以活性理论值的对数（横坐标）对其相应的活性测定值的对数（纵坐标）作图，采用最小二乘法进行线性回归，线性一般用直线回归方程的相关系数r表示，结果如图7所示，拟合的直线回归方程为y=1.0535x+0.02，相关系数为0.995。

[0206] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。