一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液及其用途

摘要

本发明提供了一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液及其用途，本发明的培养液可实现快速、高效、一步法诱导间充质干细胞为胰岛样细胞。经3天的诱导分化后，本发明实施例1‑3诱导后的胰岛样细胞的胰岛当量显著提高，且本发明所述培养液存在协同增效的技术效果，尤其是在培养液中添加ITS液体培养液补充剂、GLP‑1和人参总皂苷后，使其诱导分化效果得到显著改善，经诱导分化的胰岛样细胞会高表达胰岛素和胰高血糖素基因，且经诱导后的细胞团在低浓度和高浓度的葡萄糖刺激下胰岛素分泌量显著增加，具有体内分泌胰岛素调控血糖的功能。

权利要求

1.一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液，其特征在于，由如下组分组成：

1‑3％BSA，1×ITS液体培养液补充剂，10‑30mM GLP‑1，50‑150mg/L人参总皂苷，100‑300u/L青霉素，100‑300u/L链霉素，DMEM/F12培养液余量。

2.如权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液由如下组分组成：1％BSA，1×ITS液体培养液补充剂，10mM GLP‑1，50mg/L人参总皂苷，100u/L青霉素，100u/L链霉素，DMEM/F12培养液余量。

3.如权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液由如下组分组成：2％BSA，1×ITS液体培养液补充剂，20mM GLP‑1，100mg/L人参总皂苷，200u/L青霉素，200u/L链霉素，DMEM/F12培养液余量。

4.如权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液由如下组分组成：3％BSA，1×ITS液体培养液补充剂，30mM GLP‑1，150mg/L人参总皂苷，300u/L青霉素，300u/L链霉素，DMEM/F12培养液余量。

5.一种制备权利要求1‑4任一项所述的诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液的方法，包括以下步骤：(1)取DMEM/F‑12的干粉溶解在高压灭菌的双蒸水中，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解制得基础培养液；

(2)向由步骤(1)制得的基础培养液中加入一定量的BSA，1×ITS液体培养液补充剂，GLP‑1，人参总皂苷，青霉素，链霉素，搅拌至完全溶解；

(3)调节步骤(2)所得混合物的PH至7.2‑7.4，过膜除菌后即得。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在使用所述培养液时，要将培养液置于37℃预热后使用。

7.权利要求1‑4任一项所述的培养液在诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞为脂肪、骨髓或脐带来源的干细胞。

9.权利要求1‑4任一项所述培养液在制备糖尿病治疗药物中的应用。

说明书

一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液及其用途

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液及其用途。

背景技术

[0002] 糖尿病主要由因遗传、环境、精神等因素相互作用而导致胰岛素相对或绝对缺乏，并以持续高血糖为其主要生化特征的一种慢性全身性代谢疾病。胰岛素的注射与药物治疗成为了当前临床上控制糖尿病和降低其并发症发生的主要方法，但是不能从根本上治愈糖尿病。相关研究证实，体外实验中胰岛细胞的移植能够有效降低血糖和减少其并发症的发生。于是胰岛移植成为从根本上治愈糖尿病的方法之一，但是由于供体缺乏、胰腺/胰岛分离费用高、移植产生的炎性反应需要多次移植和长期服用免疫排斥药物等问题而未能在临床上广泛应用。

[0003] 近几年来，利用干细胞移植技术来克服胰岛短缺的问题成为人们研究的焦点，将具有某种特定功能的细胞移植到体内相应的受损部位，不仅避免了传统药物治疗引起的毒副作用，而且可以恢复受损器官部分功能干细胞具有多向分化潜能，其中间充质干细胞是中胚层中具有高度自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化为神经、汗腺、骨、软骨、脂肪、肝脏等多种组织细胞。脂肪、脐带和胎盘来源的MSC具有取材方便，传代能力强，免疫反应低，被污染的概率较小，无伦理学限制等优点，在一定条件下可分化为胰岛β细胞或胰岛素生成细胞(IPCs)，此方法成为替代现有短缺的胰岛细胞、实现临床糖尿病治疗的重要研究途径。

[0004] 然而，现有技术中多是采用通过多步诱导的方式将间充质干细胞成功分化为胰岛素分泌型细胞。该诱导技术步骤繁杂、诱导因子使用较多，诱导周期一般为14‑21天，诱导周期长、残留因子种类繁多、细胞活性低、诱导转化率低，增加了临床应用的风险。因此，急需要开发一种体外一步法、快速且高效地诱导间充质干细胞定向分化为胰岛素分泌型细胞的培养液。

发明内容

[0005] 针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液及其用途。

[0006] 具体而言，本发明首先提供了一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液包括如下组分：1‑3％(v/v)BSA，1×ITS液体培养液补充剂(100x)，10‑30mM GLP‑1，50‑150mg/L人参总皂苷，100‑300u/L青霉素，100‑300u/L链霉素，DMEM/F12培养液余量。

[0007] 优选地，所述诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液包括如下组分：1％(v/v)BSA，1×ITS液体培养液补充剂(100x)，10mM GLP‑1，50mg/L人参总皂苷，100u/L青霉素，100u/L链霉素，DMEM/F12培养液余量。

[0008] 优选地，所述诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液包括如下组分：2％(v/v)BSA，1×ITS液体培养液补充剂(100x)，20mM GLP‑1，100mg/L人参总皂苷，200u/L青霉素，200u/L链霉素，DMEM/F12培养液余量。

[0009] 优选地，所述诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液包括如下组分：3％(v/v)BSA，1×ITS液体培养液补充剂(100x)，30mM GLP‑1，150mg/L人参总皂苷，300u/L青霉素，300u/L链霉素，DMEM/F12培养液余量。

[0010] 进一步地，本发明还提供了一种制备上述诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液的方法，包括以下步骤：

[0011] (1)取DMEM/F‑12的干粉溶解在高压灭菌的双蒸水中，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解制得基础培养液；

[0012] (2)向由步骤(1)制得的基础培养液中加入一定量的BSA，1×ITS液体培养液补充剂(100x)，GLP‑1，人参总皂苷，青霉素，链霉素，搅拌至完全溶解；

[0013] (3)调节步骤(2)所得混合物的PH至7.2‑7.4，过膜除菌后即得。

[0014] 进一步的，所述步骤(3)中用0.22μm的透析袋过滤除菌。

[0015] 优选地，使用时，要将上述培养液置于37℃预热后使用。

[0016] 另一方面，本发明还提供了所述的培养液在诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化中的应用。

[0017] 优选地，所述间充质干细胞为脂肪、骨髓和脐带来源的干细胞。

[0018] 另一方面，本发明还提供了由所述培养液诱导间充质干细胞分化的胰岛样细胞。

[0019] 进一步地，本发明还提供了所述培养液或所述的胰岛样细胞在制备糖尿病治疗药物中的应用。

[0020] 本发明的优点如下：本发明的培养液可实现快速、高效、一步法诱导间充质干细胞为胰岛样细胞。经3天的诱导分化后，本发明实施例1‑3诱导后的胰岛样细胞的胰岛当量显著提高，且本发明所述培养液存在协同增效的技术效果，尤其是在培养液中添加ITS液体培养液补充剂、GLP‑1和人参总皂苷后，使其诱导分化效果得到显著改善，经诱导分化的胰岛样细胞会高表达胰岛素和胰高血糖素基因，且经诱导后的细胞团在低浓度和高浓度的葡萄糖刺激下胰岛素分泌量显著增加，具有体内分泌胰岛素调控血糖的功能。

附图说明

[0021] 图1为经双硫腙染色的胰岛当量计数；

[0022] 图2为Real‑Time PCR特异性基因检测的相对定量结果；

[0023] 图3为不同浓度葡萄糖刺激下胰岛素的分泌量。

具体实施方式

[0024] 下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。

[0025] 以下各实施例，仅用于说明本发明，并不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。

[0026] 在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

[0027] 本发明的诱导剂各成分均为市售产品：DMEM/F12，购自于武汉普诺赛生命科技有限公司；GLP‑1(胰高血糖素样肽1)，购自Sigma公司；ITS液体培养液补充剂(100x)，购自Sigma公司；BSA，购自Sigma公司；青霉素/链霉素，购自Solarbio公司，双硫腙，购自上海一飞生物公司；人参总皂苷，购自于南京泽朗医药科技有限公司。

[0028] 实施例1

[0029] 一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液包括如下组分：1％(v/v)BSA，1×ITS液体培养液补充剂(100x)，10mM GLP‑1，50mg/L人参总皂苷，100u/L青霉素，100u/L链霉素，DMEM/F12培养液余量。将上述物质按常规的配制方法配制成诱导培养液备用。使用时，要将上述培养液置于37℃预热后使用。

[0030] 实施例2

[0031] 一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液包括如下组分：2％(v/v)BSA，1×ITS液体培养液补充剂(100x)，20mM GLP‑1，100mg/L人参总皂苷，200u/L青霉素，200u/L链霉素，DMEM/F12培养液余量。将上述物质按常规的配制方法配制成诱导培养液备用。使用时，要将上述培养液置于37℃预热后使用。

[0032] 实施例3

[0033] 一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液包括如下组分：3％(v/v)BSA，1×ITS液体培养液补充剂(100x)，30mM GLP‑1，150mg/L人参总皂苷，300u/L青霉素，300u/L链霉素，DMEM/F12培养液余量。将上述物质按常规的配制方法配制成诱导培养液备用。使用时，要将上述培养液置于37℃预热后使用。

[0034] 对比例1

[0035] 一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液，以DMEM/F‑12为基础培养液，还包括体积百分含量9％胎牛血清、7μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、14μg/mL人参茎叶皂苷、19μg/L表皮生长因子(EGF)、3mg/L胰岛素、80mg/L青霉素、95mg/L链霉素。

[0036] 对比例2

[0037] 相比于实施例2，省略2×ITS液体培养液补充剂(100x)。

[0038] 对比例3

[0039] 相比于实施例2，省略20mM GLP‑1。

[0040] 对比例4

[0041] 相比于实施例2，省略100mg/L人参总皂苷。

[0042] 实施例4

[0043] 一种诱导人脂肪间充质干细胞分化为胰岛样细胞的方法，包括以下步骤：

[0044] (1)人脂肪间充质干细胞的分离。

[0045] 获得离体人脂肪组织，消化得单细胞悬液，并使用CD29，CD73，CD49d，CD90为脂肪干细胞的阳性指标，CD14，CD45，CD34，HLA‑DR为阴性指标的单抗标记脂肪间充质干细胞，流式细胞仪检测其纯度，并对脂肪间充质干细胞进行分选获得细胞悬液。

[0046] (2)人脂肪间充质干细胞的贴壁培养。

[0047] 将步骤(1)获得的细胞悬液经1000r/min离心去上清后，重悬于基础培养液中培养，汇合度达80‑90％时传代。基础培养液为含有10％FBS，2mM L‑谷氨酰胺，100U/mL青霉素，100mg/mL链霉素的DMEM/F12中

[0048] (3)诱导间充质干细胞分化。

[0049] 经3代连续培养后，收集人脂肪间充质干细胞，采用上述实施例和对比例中的培养液重悬所述人脂肪间充质干细胞，并将其细胞悬液接种于6孔培养板进行胰岛样细胞诱导6
分化，细胞接种量为2‑3×10/孔，诱导3天。空白对照组为步骤(2)中的基础培养液。

[0050] (4)胰岛样细胞鉴定。

[0051] (4.1)双硫腙染色鉴定

[0052] 对诱导后的胰岛样细胞进行双硫腙染色，移除细胞培养液，用PBS清洗2次，然后加入10ml PBS和100μl双硫腙工作液，37℃孵育20min，移出双硫腙染液，用PBS洗2次，在倒置显微镜下观察细胞着色情况并拍照记录。在显微镜下计数直径50μm以上的胰岛，计数100‑450μm各数量级的胰岛细胞数，以直径为150μm为基准系数1，计数胰岛当量(IEQ)，重复取样
3次，并求出平均值。

[0053] 结果如图1所示，经3天的诱导分化后，本发明实施例1‑3诱导后的胰岛样细胞的胰岛当量显著高于对比例1‑4任一项的胰岛当量，且本发明所述培养液存在协同增效的技术效果。尤其是相比于对比例2‑4任一项而言，在培养液中添加ITS液体培养液补充剂、GLP‑1和人参总皂苷后，使其诱导分化效果得到显著改善。上述结果证实：本发明的培养液可实现快速、高效、一步法诱导间充质干细胞为胰岛样细胞。

[0054] (4.2)Real‑Time PCR特异性基因检测

[0055] 用Trizol试剂提取间充质干细胞和诱导后胰岛样细胞的总RNA，经Real‑Time PCR检测人胰岛素和胰高血糖素基因的表达，同时以GAPDH基因为参照，引物见表1，Real‑Time PCR的相对荧光定量结果见图2。

[0056] 表1：RT‑PCR基因引物

[0057]

[0058] 结果显示，间充质干细胞和胰岛样细胞均表达内参基因GAPDH，间充质干细胞不表达胰岛素和胰高血糖素基因，而诱导后产生的胰岛样细胞表达胰岛素和胰高血糖素基因，说明间充质干细胞已诱导分化为胰岛样细胞。Real‑Time PCR的相对荧光定量结果也显示，本发明实施例1‑3经诱导分化的胰岛样细胞会高表达胰岛素和胰高血糖素基因，进而证明本发明实施例1‑3的诱导的胰岛样细胞数量显著高于对比例1‑4，具备预料不到的技术效果。

[0059] (4.3)葡萄糖刺激胰岛素分泌实验

[0060] 上述实施例和对比例经诱导分化后，移除分化培养液，加入1×PBS清洗3次，小心弃去PBS，分别加入10mL含2.8mM葡萄糖、16.7mM葡萄糖的DMEM/F12，于细胞培养箱中平衡2h后，收集上清液，用ELISA法检测上清中不同浓度葡萄糖刺激下胰岛素的分泌量。

[0061] 结果如图3所示：未经诱导的人脂肪间充质干细胞上清中检测不到胰岛素，而实施例1经诱导后的细胞团在2.8mM葡萄糖刺激下胰岛素分泌量为(35.11±4.08mU/L)，经16.7mM葡萄糖孵育2h后胰岛素分泌量为(128.33±6.24mU/L)，随着葡萄糖浓度的增加其胰岛素分泌量增加，且差异显著。而对比例1‑4在葡萄糖刺激下其胰岛素的分泌量远不及本发明实施例1‑3任一项。由此可以证明，采用本发明所述的培养液诱导后胰岛样细胞团对葡萄糖刺激极为敏感，具有体内分泌胰岛素调控血糖的功能。

[0062] 在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。