提高UFBP1蛋白K267位点的UFM1化修饰的试剂在代谢相关脂肪性肝病中的应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体是提高UFBP1蛋白K267位点的UFM1化修饰水平的试剂在制备预防和/或治疗代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)药物中的应用。本发明首次揭示了提高UFBP1K267的UFM1化修饰水平的试剂可特异性地抑制MAFLD，并且首次揭示了UFBP1K267的UFM1化修饰水平与MAFLD的脂质合成及内质网应激密切相关，从而为MAFLD的防治提供了新的靶点。

权利要求

1.提高UFBP1 K267的UFM1化修饰水平的试剂在制备预防和/或治疗代谢相关脂肪性肝病的药物中的应用；所述的提高UFBP1 K267的UFM1化修饰水平的试剂为含有UFBP1蛋白编码基因的重组病毒。

2.根据权利要求1所述的提高UFBP1 K267的UFM1化修饰水平的试剂在制备预防和/或治疗代谢相关脂肪性肝病的药物中的应用，其特征在于，所述的重组病毒选自含有相关蛋白编码基因的重组慢病毒、重组腺病毒以及重组腺相关病毒。

3.根据权利要求1所述的提高UFBP1 K267的UFM1化修饰水平的试剂在制备预防和/或治疗代谢相关脂肪性肝病的药物中的应用，其特征在于，所述的提高UFBP1 K267的UFM1化修饰水平的试剂通过有效缓解代谢相关脂肪性肝病相关症状，包括肥胖、肝脏脂肪变性、肝脏脂质异常积聚、肝细胞气球样变、血脂上升或胰岛素抵抗，并通过抑制肝脏脂质合成通路以及内质网应激通路来发挥缓解代谢相关脂肪性肝病的作用。

4.根据权利要求1所述的提高UFBP1 K267的UFM1化修饰水平的试剂在制备预防和/或治疗代谢相关脂肪性肝病的药物中的应用，其特征在于，所述的预防和/或治疗代谢相关脂肪性肝病药物是由提高UFBP1 K267的UFM1化修饰水平的试剂作为活性成分，与常规药用载体制成的药物组合物。

说明书

提高UFBP1蛋白K267位点的UFM1化修饰的试剂在代谢相关脂

肪性肝病中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地说，是提高UFBP1蛋白K267位点的UFM1化修饰水平的试剂在制备预防和/或治疗代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)药物中的应用。

背景技术

[0002] 代谢相关脂肪性肝病(Metabolic associated fatty liver disease，MAFLD)，旧称非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD)，是一种以肝脏内脂质异常堆积以及肝脏细胞应激为主要特点的代谢紊乱性肝脏疾病。MAFLD是目前世界上最流行的肝脏疾病，而如果得不到有效控制，MAFLD就会从单纯存在可逆性的大泡为主脂肪变性的单纯性非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic Fatty Liver，NAFL)进展到合并炎症以及肝脏损伤(伴或不伴纤维化)的非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic Steatohepatitis,NASH)。而NASH则会及进一步恶化，导致肝硬化、肝功能衰竭、肝细胞癌等终末期肝病。此外，MAFLD还可以提高糖尿病、动脉粥样硬化、高血压、冠状动脉心脏病、缺血性和出血性中风以及心房颤动等其它代谢相关疾病的发病风险。因此，MAFLD给社会带来巨大的健康以及经济负担。而与MAFLD的流行现状和对健康的危害相比，由于MAFLD发生及进展的机制尚不明确，目前对NAFLD的治疗手段局限于改变生活方式、降脂、缓解肝脏胰岛素抵抗以及损伤等非特异性治疗，而缺少得到临床许可的针对MAFLD的特异性治疗手段。因此，深入揭示MAFLD发病机制，寻找潜在的干预靶标，成为肝脏领域和代谢领域的研究热点。

[0003] 基础研究的进展提示，MAFLD是一个肝细胞脂质异常合成、沉积并导致细胞内发生内质网应激等细胞应激的过程。近年来众多学者研究表明，高脂饮食以及胰岛素抵抗等因素诱导下，大量游离脂肪酸(FFA)通过血液被运送到肝脏并促进多种脂质合成相关基因表达的上升，引起肝脏脂质的积聚以及脂毒性代谢产物增加，进而引发内质网应激、氧化应激、炎症反应等病理生理反应，而这些应激反应又会进一步加剧肝脏的脂质合成代谢异常，形成MAFLD发病中的“多重打击”。这些研究发现提示，MAFLD是由脂质合成、细胞应激等多因素共同参与、积极调控的疾病过程，因此针对MAFLD肝脏脂质合成以及细胞应激的试剂在预防或治疗非酒精性脂肪性肝病中具有很高的应用价值。

[0004] 目前，临床上针对MAFLD的降脂药主要有他汀类药物和贝特类药物。但这些药物主要针对合并心脑血管疾病或血脂异常的MAFLD患者，且应用最广泛的降脂药物均存在不同程度的肝损伤风险和其他不良反应，考虑到MAFLD人群肝脏本身存在脂肪变性及炎症多重打击，我们需要探索更安全的针对MAFLD的特异性降脂治疗。肝脏脂肪生成由一个复杂的转录因子网络负责调节的，这包括固醇调节元件结合蛋白1/2(SREBP1/2)，过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)等转录因子以及硬脂酰辅酶a去饱和酶1(SCD1)，脂肪酸合成酶(FASN)，乙酰辅酶a羧化酶α1(ACC1)，二酰基甘油o‑酰基转移酶2(DGAT2)、CD36等脂肪合成相关蛋白。在非激活的情况下，SREBP1/2以非活性前体的形式存在于内质网中、，而在MAFLD发生发展的过程中，SREBP1/2的剪切成熟增加，进而导致MAFLD肝脏内脂质异常合成。其中，SREBP1主要负责合成脂肪酸以及甘油三酯的合成并促进肝脏的脂肪变性，而SREBP2则负责胆固醇的生成并能促进MAFLD进展为NASH。PPARγ也是肝脏脂肪生成和脂肪变性的重要转录因子。PPARγ通过促进CD36表达，促进肝脏中脂酸的摄取和脂质合成以及NAFLD的进展。DGAT2则是另一个广泛参与MAFLD肝脏中甘油三酯的合成以及肝脏脂肪变性的肝脏脂质合成基因，因此DGAT2也是MAFLD的治疗靶点。因此抑制MAFLD肝脏中脂质合成相关基因的表达及功能是预防及缓解MAFLD重要方向之一。

[0005] 在MAFLD相关的诸多细胞应激中，内质网应激发挥了重要作用。脂质及其代谢产物在肝细胞中的积累可引发内质网应激反应(未折叠蛋白反应)，该反应由肌醇‑必需酶1α(IRE1α)通路、PRKR样内质网激酶(PERK)通路和活化转录因子6(ATF6)通路组成。IRE1α磷酸化激活后，一方面通过发挥核酸内切酶功能，促进XBP1s以及Caspase 2的表达，一方面通过发挥蛋白激酶功能，促进JNK的磷酸化。其中，Caspase 2的表达与激活可以促进S1P对SREBP1/2的剪切以及激活，XBP1s的表达增加则能促进脂质合成相关基因DGAT2、SCD1、ACC2以及SREBP1的转录；而JNK的磷酸化则促进了肝脏的胰岛素抵抗以及炎症反应的发生。PERK磷酸化激活后，通过促进eIF2α磷酸化，促进ATF4的蛋白翻译，ATF4则促进CHOP以及脂质合成基因SREBP1、PPARγ的表达，进而促进肝脏脂质合成以及炎症反应。而ATF6被激活后其N端则会被剪切下来进入细胞核发挥细胞因子的作用，ATF6通路的功能很多和IRE1α以及PERK通路重合，但也有报道称，ATF6可以抑制MAFLD的发生发展(Villeneuve J,Lepreux S,Mulot A,et al.Aprotective role for  CD154 in hepatic steatosis in mice.Hepatology.2010.52(6):1968‑79.Xiao G,Zhang T,Yu S,et al.ATF4 protein deficiency protects against high fructose‑induced hypertriglyceridemia in mice.J Biol Chem.2013.288(35):25350‑25361.Chen X,Zhang F,Gong Q,et al.Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice Through Peroxisome Proliferator‑Activated Receptorα.Diabetes.2016.65(7):1904‑
15.Zeng L,Lu M,Mori K,et al.ATF6 modulates SREBP2‑mediated lipogenesis.EMBO J.2004.23(4):950‑8.)。但是目前尚没有针对肝脏内质网应激进行MAFLD治疗的有效药物。

[0006] UFBP1(UFM1‑Binding And PCI Domain‑Containing Protein 1)是新近发现的内质网应激调节蛋白。UFBP1主要定位在细胞内质网中，且内质网应激发生时，UFBP1的转录表达被激活，进而参与内质网稳态的维持，因此UFBP1的缺失往往导致严重的内质网应激以及细胞凋亡，这与UFBP1缺失导致的内质网发育障、内质网应激感受器蛋白IRE1a的稳定性下降以及内质网自噬障碍有关。UFBP1的主要功能域为其PCI结构域(AA229‑273)，该结构负责结合与UFBP1存在相互作用的蛋白，进而调控这些蛋白的折叠、降解、运输，且值得注意的是，类泛素折叠修饰因子1(UFM1‑Binding And PCIDomain‑Containing Protein 1，UFM1)可以对该PCI结构域的高度保守的第267位赖氨酸进行修饰，这对UFBP1功能的发挥至关重要。UFM1前体蛋白经过UFM1特异性蛋白酶UFSP2(UFM1 Specific Peptidase 2)水解切割后，UFM1的83位甘氨酸暴露出来，形成成熟的UFM1，之后UFM1通过UFM1激活酶UBA5(Ubiquitin Like Modifier Activating Enzyme 5)、UFM1结合酶UFC1(Ubiquitin‑Fold Modifier Conjugating Enzyme 1)、UFM1连接酶UFL1(UFM1Specific Ligase 1)的续贯作用，使UFM1的83位甘氨酸残基与UFBP1的267位赖氨酸残基(K267)形成共价连接，实现UFBP1蛋白的UFM1化修饰(Kang SH,Kim GR,Seong M,et al.Two novel ubiquitin‑fold modifier 1(Ufm1)‑specific proteases,UfSP1 and UfSP2.J Biol Chem.2007.282(8):5256‑62.Yoo HM,Kang SH,Kim JY,et al.Modification of ASC1 by UFM1 is crucial for ERαtransactivation and breast cancer development.Mol Cell.2014.56(2):261‑
274.Wei Y,Xu X.UFMylation:AUnique&Fashionable Modification for Life.Genomics Proteomics Bioinformatics.2016.14(3):140‑146.)。同时，UFSP2还能通过其N端独特的结构域识别位于内质网的UFBP1，并将与UFBP1 K267偶联的UFM1蛋白剪切下来，进而实现去UFM1化修饰(Ha BH,Jeon YJ,Shin SC,et al.Structure of ubiquitin‑fold modifier 
1‑specific protease UfSP2.J Biol Chem.2011.286(12):10248‑57.)。

[0007] UFBP1的UFM1化修饰已被证实参与许多生物学过程，但是目前，UFBP1以及UFM1化修饰在MAFLD中具体作用及其机制尚未有报道。

发明内容

[0008] 本发明显著不同于现有技术和当前趋势的是，认为UFBP1的UFM1化修饰是MAFLD的潜在治疗靶点之一，通过提供一种提高UFBP1蛋白第267位赖氨酸残基(K267)的UFM1化修饰水平的方法，对MAFLD进行预防及治疗。本发明的目的在于提供提高UFBP1 K267的UFM1化修饰水平的试剂在预防或治疗MAFLD中的新的医药用途。

[0009] 为了实现缓解MAFLD的目的，本发明的第一方面，提供提高UFBP1第267位赖氨酸残基(K267)的UFM1化修饰水平的试剂在制备预防和/或治疗代谢相关脂肪性肝病(Metabolic associated fatty liver disease，MAFLD)的药物中的应用。

[0010] 进一步的，所述的提高UFBP1 K267的UFM1化修饰水平的试剂包括以下任一：

[0011] A)体外纯化的UFBP1蛋白、UFM1蛋白；

[0012] B)含有UFBP1蛋白或UFM1蛋白编码基因的重组病毒；

[0013] C)同时含有UFBP1蛋白和UFM1蛋白编码基因的重组病毒；含有UFBP1与UFM1融合蛋白编码基因的重组病毒；

[0014] D)促进UFBP1发生UFM1化修饰或抑制UFBP1发生去UFM1化修饰的药物。

[0015] 上述B/C)中，可以是含有相关蛋白编码基因的重组慢病毒、重组腺病毒以及重组腺相关病毒等。

[0016] 上述D)中，可以是促进UFBP1与其UFM1化修饰E3连接酶UFL1结合的多肽或化合物、抑制UFBP1与其去UFM1化修饰蛋白酶UFSP2结合的多肽或化合物。

[0017] 进一步的，所述的提高UFBP1 K267的UFM1化修饰水平的试剂通过有效缓解MAFLD相关症状，包括肥胖、肝脏脂肪变性、肝脏脂质异常积聚、肝细胞气球样变、血脂上升以及胰岛素抵抗，并通过抑制肝脏脂质合成通路以及内质网应激通路来发挥缓解MAFLD的作用。

[0018] 本发明的第二方面，提供一种预防和/或治疗MAFLD的药物组合物，其活性成分为提高UFBP1 K267的UFM1化修饰水平的试剂。

[0019] 进一步的，所述的预防和/或治疗MAFLD的药物组合物还包括药学上可接受的载体或辅料。

[0020] 进一步的，所述的预防和/或治疗MAFLD的药物是由提高UFBP1 K267的UFM1化修饰水平的试剂作为活性成分，与常规药用载体制成的药物组合物。

[0021] 进一步的，所述的药物组合物是片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂。

[0022] 本发明的第三方面，提供一种筛选预防或治疗MAFLD的药物的方法，所述的方法为从获得的潜在物质中选择提高肝脏中UFBP1 K267的UFM1化修饰水平的药物。

[0023] 进一步的，所述的筛选方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于预防或治疗MAFLD有用的物质。

[0024] 本发明的第四方面，提供一种延缓或治疗MAFLD的方法，所述方法包括：上调所述目标体内UFBP1 K267的UFM1化修饰水平以延缓MAFLD的发生，UFBP1 K267的UFM1化修饰缺陷将促进MAFLD的进程。

[0025] 本发明优点在于：

[0026] 本发明首次揭示了提高UFBP1 K267的UFM1化修饰水平的试剂可特异性地抑制MAFLD，并且首次揭示了UFBP1 K267的UFM1化修饰水平与MAFLD的脂质合成及内质网应激密切相关，从而为MAFLD的防治提供了新的靶点。

附图说明

[0027] 图1.MAFLD肝脏中UFBP1的UFM1化修饰水平的改变分析。

[0028] A，定量PCR显示，与对照组相比，UFM1、UFBP1在MAFLD小鼠肝脏的表达升高。B，Western blot检测MAFLD小鼠肝脏中UFM1化修饰体系蛋白(UFM1、UBA5、UFC1、UFL1以及UFBP1)以及与UFM1偶联的肝脏蛋白的表达量，结果显示在MAFLD肝脏中UFM1化修饰体系蛋白以及与UFM1偶联的肝脏蛋白的表达上升，且UFBP1的UFM1化修饰增加(黑色箭头)。C，免疫组织化学染色显示，UFM1、UFBP1在MAFLD小鼠肝脏中表达上升。D，免疫组织化学染色显示，UFM1、UFBP1在MAFLD患者肝脏中表达上升。

[0029] 图2.体外实验中敲低UFBP1会促进MAFLD进程。

[0030] A，油红染色显示，与对照组相比，敲低UFBP1后肝细胞系L02细胞中游离脂肪酸诱导的脂质积聚明显增加。B，定量PCR显示，与对照组相比，敲低UFBP1后肝细胞系L02细胞中脂质合成相关基因(SREBP1、SCD1、DGAT2，PPARγ以及CD36)的转录上升。C，Western blot检测显示，与对照组相比，敲低UFBP1后肝细胞系L02细胞中脂质合成相关基因(SREBP1、SCD1、DGAT2、PPARγ以及CD36)的蛋白水平上升，且SREBP1蛋白的剪切水平上升。D，定量PCR显示，与对照组相比，敲低UFBP1后肝细胞系L02细胞中内质网应激相关基因(GRP78、XBP1s以及Caspase 2)的转录上升。E，Western blot检测显示，与对照组相比，敲减UFBP1后L‑02细胞内质网应激相关基因的蛋白水平(GRP78、ATF4、XBP1s、Caspase 2、ATF6)或蛋白磷酸化水平(PERK、eIF2α以及IRE1α)上升。。

[0031] 图3.体内实验中过表达UFBP1能以UFM1化修饰依赖的方式缓解MAFLD进程。

[0032] A，与对照组相比，注射表达野生型UFBP1(WT UFBP1)的腺相关病毒可以缓解MAFLD小鼠的肥胖，但是注射表达不能被UFM1化修饰的UFBP1突变体(UFBP1 K267R)的腺相关病毒则不能发挥该作用。B，与对照组相比，肝脏内过表达WT UFBP1可以减小MAFLD小鼠肝脏的体积以及重量，而过表达UFBP1 K267R则不能发挥该作用。C，油红染色以及HE染色显示，与对照组相比，肝脏内过表达WT UFBP1可以减少MAFLD小鼠肝脏内脂质积聚以及细胞气球样变，但是过表达UFBP1 K267R则不能减少肝脏细胞气球样变数量，并反而增加了肝脏组织内脂质的积聚。D，脂质含量检测发现，过表达WT UFBP1可以减少NAFLD肝脏内以及血清中甘油三酯(TG)的含量，而过表达UFBP1 K267R则不能降低肝脏内以及血清中的TG含量；且在肝脏内过表达UFBP1 K267R导致血清中的胆固醇含量上升，而过表达WT UFBP1后血清中的胆固醇含量改变没有统计学差异。E，GTT实验显示，与对照组相比，过表达WT‑UFBP1或过表达UFBP1 K267R均能提高MAFLD小鼠的糖耐量。F，ITT显示，与对照组相比，过表达WT‑UFBP1能提高MAFLD小鼠的胰岛素敏感性，而过表达UFBP1 K267R不能提高MAFLD小鼠的胰岛素敏感性。

[0033] 图4.过表达UFBP1能以UFM1化修饰依赖的方式抑制MAFLD肝脏中的脂质合成并缓解MAFLD肝脏中的内质网应激。

[0034] A，定量PCR显示，与对照组相比，过表达WT UFBP1后MAFLD肝脏中脂质合成相关基因(SREBP1、SCD1、DGAT2，PPARγ以及CD36)的转录水平下降，而过表达UFBP1 K267R后肝脏中PPARγ以及CD36的转录水平没有下降，且SREBP1、SCD1、DGAT2的转录水平反而有所上升。B，Western blot检测显示，与对照组相比，过表达WT UFBP1后MAFLD肝脏中脂质合成相关基因(SCD1、DGAT2，PPARγ以及CD36)的蛋白表达减少，且SREBP1的剪切成熟减少，而过表达UFBP1 K267R后肝脏中PPARγ以及CD36的蛋白表达没有下降，相反SREBP1的剪切成熟以及SCD1的表达反而增高。C，定量PCR显示，与对照组相比，过表达WT UFBP1后MAFLD肝脏中内质网应激相关基因(GRP78、XBP1s、Caspase 2)的转录水平下降，而过表达UFBP1K267R后肝脏中GRP78和Caspase 2的转录水平没有下降，且XBP1s的转录水平反而上升。D，Western blot检测显示，与对照组相比，过表达WT UFBP1后MAFLD肝脏中内质网应激相关基因的蛋白水平(GRP78、ATF4、XBP1s、Caspase 2、ATF6)或蛋白磷酸化水平(PERK、eIF2α以及IRE1α)下降，而过表达UFBP1 K267R后肝脏中内质网应激相关基因的蛋白水平或磷酸化水平没有发生明显改变。

具体实施方式

[0035] 下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

[0036] 这些实施例仅用于阐述本发明，而不用于限制本发明的范围。下述实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆(Molecular  Cloning:rd
ALaboratory Manual，3  ed.)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0037] 材料和方法

[0038] MAFLD小鼠模型构建

[0039] 高脂饮食诱导MAFLD小鼠模型：体重相近的8周雄性C57/BL6J小鼠购自上上海杰思捷实验动物有限公司，小鼠随机分为两组。高脂组予以高脂饲料喂养12周，对照组予以普通饲料饲养。

[0040] 病人组织标本收集及处理

[0041] 经医院伦理委员会批准及患者知情同意，人MAFLD肝脏组织及对照未合并MAFLD肝脏组织取自因肝细胞癌或肝脏转移性肿瘤而行肝脏外科手术的患者的癌旁组织。将组织标本迅速固定于福尔马林或冻存于液氮中以待检测。

[0042] 体外肝细胞系L‑02培养

[0043] 将购自中科院的人永生化肝细胞系L‑02于加入含链霉素、青霉素双抗、10％胎牛血清的RPM1‑1640培养基，置于含5％ CO2的37℃恒温培养箱中进行培养，每2‑4天换液传代。

[0044] 体外MAFLD模型构建

[0045] 使用配方为含有200μmol/L油酸、100μmol/L棕榈酸的高脂培养基诱导体外MAFLD细胞模型。

[0046] 在MAFLD小鼠模型肝脏中过表达UFBP1或UFBP1 K267R

[0047] 过表达野生型UFBP1或UFBP1 K267R的腺相关病毒AAV 8由汉恒生物科技(上海)有限公司构建，通过尾静脉分别将对照组腺相关病毒(AAV‑Control)、过表达野生型UFBP1的腺相关病毒(AAV‑WT UFBP1)以及过表达主要UFM1化修饰位点突变的UFBP1的腺相关病毒(AAV‑UFBP1K267R)注射到高脂喂养12周的小鼠体内，每组各注射5只，继续高脂喂养12周，以便让腺相关病毒在小鼠肝脏内充分表达。

[0048] 检测小鼠葡糖糖耐量(GTT)

[0049] 小鼠腹腔注射腺相关病毒10周后，测小鼠IPGTT：检测前一天，用生理盐水配置100mg/ml葡萄糖溶液，测量要检测的小鼠的体重，按每克体重注射1mg葡萄糖，准备每只小鼠的注射液。小鼠空腹处理12小时后，减掉小鼠尾尖，用血糖仪检测小鼠空腹血糖，并注射事先准备好的葡萄糖，放回笼子，注射0、15、30、60以及120分钟之后检测小鼠尾尖血糖。

[0050] 检测小鼠胰岛素耐量(ITT)

[0051] 小鼠腹腔注射腺相关病毒11周后，测小鼠ITT：检测当天早上，用生理盐水配置0.75U/ml胰岛素溶液，测量要检测的小鼠的体重，按每克体重注射0.75mU胰岛素，准备每只小鼠的注射液。撤食，小鼠空腹处理6小时后，减掉小鼠尾尖，用血糖仪检测小鼠空腹血糖，并注射事先准备好的胰岛素溶液，放回笼子，注射0、15、30、60以及120分钟之后检测小鼠尾尖血糖。

[0052] 检测样本甘油三酯含量

[0053] 使用南京建成生物工程研究所TG检测试剂盒检测各组小鼠肝脏、血清中甘油三酯含量：96孔板中，空白孔加入2.5μl ddH2O，标准孔加入2.5μl标准液，样品孔加入2.5μl样本液，之后在各个孔中加入250毫升检测液，混匀，37℃孵育10分钟，510纳米检测各孔吸光度。

[0054] TG含量(mmol/L)＝(样品OD值‑空白OD值)/(标准品OD值‑空白OD值)×标准品浓度(2.26mmol/L)。

[0055] 检测样本胆固醇含量

[0056] 使用南京建成生物工程研究所TC检测试剂盒检测各组小鼠肝脏、血清中胆固醇含量：96孔板中，空白孔加入2.5μl ddH2O，标准孔加入2.5μl标准液，样品孔加入2.5μl样本液，之后在各个孔中加入250毫升检测液，混匀，37℃孵育10分钟，510纳米检测各孔吸光度。

[0057] TC含量(mmol/L)＝(样品OD值‑空白OD值)/(标准品OD值‑空白OD值)×标准品浓度(5.17mmol/L)

[0058] 油红染色

[0059] 配制油红染色液对肝脏冷冻切片或细胞爬片进行染色，在一般光学显微镜下观察肝脏细胞脂质积聚情况。

[0060] HE染色

[0061] 肝脏切片脱蜡水化、苏木素/尹红染色、脱水封片。在一般光学显微镜下观察肝脏组织病理情况

[0062] 实时荧光定量PCR

[0063] 人肝脏组织以及培养细胞的总RNA用TRIzol(Invitrogen)抽提。紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度。取1000ng总RNA逆转录为cDNA，PCR法进行目的基因扩增，各反应体系均以β‑Actin作为内参引物，并通过溶解曲线和琼脂糖凝胶电泳确定基因扩增的特异性。

[0064] 免疫组织化学染色

[0065] 取MAFLD肝脏组织与对照组肝脏组织，用4％多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋。石蜡切片(4μm)后用S‑P法进行免疫组织化学染色，使用碧云天免疫染色一抗稀释液以特定比例稀释Anti‑UFM1(1:100,abclonal)或Anti‑UFBP1(1:300,Proteintech)，置于湿盒中4℃过夜，洗脱后常温孵育相应酶标二抗30分钟，利用DAB显色，以出现棕黄色为阳性染色，苏木素复染后脱水封片，正置显微镜下观察分析，使用Image Pro Plus软件进行图像分析。

[0066] 统计学分析

[0067] 用GraphPad Prism 8.0软件进行数据处理分析，所有计量资料数据采用平均值±标准误进行表示，组间比较使用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

[0068] 实施例1：UFBP1的UFM1化修饰水平分析

[0069] 本实施例收集MAFLD小鼠的肝脏组织作为实验组，正常小鼠肝脏组织作为对照组。利用实时荧光定量PCR的方法检测MAFLD小鼠肝脏组织中UFM1修饰体系蛋白(UFM1、UBA5、UFC1、UFL1以及UFBP1)的mRNA水平的表达变化，结果显示UFM1及UFBP1在MAFLD小鼠肝脏组织中表达显著升高(图1A)。通过western blot的方法检测肝脏组织中UFM1修饰体系蛋白的表达变化以及与UFM1偶联的肝脏蛋白的表达量，结果显示在MAFLD小鼠肝脏组织中，UFM1、UBA5、UFC1、UFL1以及UFBP1高表达，且与UFM1偶联的肝脏蛋白的表达量也升高，这包括与UFM1偶联的UFBP1(黑色箭头所示)(图1B)。

[0070] 实施例2：MAFLD小鼠的肝脏组织及MAFLD患者肝脏组织中UFM1以及UFBP1的表达增加

[0071] 本实施例采用免疫组织化学染色的方法检测MAFLD小鼠的肝脏组织及MAFLD患者肝脏组织中UFM1以及UFBP1的表达水平，结果发现UFM1以及UFBP1在MAFLD肝脏组织中高表达(图1C、D)。

[0072] 实施例3：敲减UFBP1促进MAFLD进程

[0073] 本实施例在体外培养人肝细胞系L‑02中，通过表达针对UFBP1的shRNA的重组慢病毒敲减UFBP1，并通过高脂培养基诱导MAFLD细胞模型。利用油红染色评定肝脏细胞脂质积聚情况。油红染色显示与对照组相比，敲减UFBP1后L‑02细胞脂质积聚明显增加(图2A)，肝脏内脂质合成相关基因(SREBP1、SCD1、DGAT2，PPARγ以及CD36)的转录以及蛋白水平也上升，且SREBP1蛋白的剪切水平上升(图2B、C)。同时，敲低UFBP1后L02细胞中内质网应激相关基因(GRP78、XBP1s以及Caspase 2)的转录上升，且内质网应激相关基因的蛋白水平(GRP78、ATF4、XBP1s、Caspase 2、ATF6)或蛋白磷酸化水平(PERK、eIF2α以及IRE1α)上升(图2D、E)。

[0074] 实施例4：过表达UFBP1能以UFM1化修饰依赖的方式缓解MAFLD进程

[0075] 实施例3实验结果表明，敲减UFBP1会促进MAFLD细胞模型的脂质积聚。为更好的探讨UFBP1的内源性功能及其与UFM1化修饰的关系，本实施例通过对MAFLD小鼠尾静脉注射腺相关病毒(AAV)，进而在MAFLD肝脏中过表达野生型UFBP1，或UFM1修饰位点(267位赖氨酸)突变的UFBP1(UFBP1 K267R)。结果显示，过表达野生型UFBP1可以降低MAFLD小鼠体重、肝脏的体积和重量，并缓解了MAFLD小鼠肝脏脂质积聚、降低MAFLD小鼠肝脏及血清中甘油三酯的水平，提高MAFLD小鼠的糖耐量和胰岛素敏感性，而过表达UFBP1 K267R则不能发挥这些MAFLD缓解作用，并反而促进了MAFLD小鼠肝脏脂质积聚以及血清胆固醇水平上升(图3)。

[0076] 实施例5：过表达UFBP1能以UFM1化修饰依赖的方式抑制MAFLD肝脏中的脂质合成并缓解MAFLD肝脏中的内质网应激

[0077] 上述实验证明了UFBP1能以UFM1化修饰依赖的方式缓解MAFLD进展，而UFBP1是一种主要分布于内质网的蛋白，UFBP1能以UFM1化修饰依赖的发生在内质网稳态维持方面起到重要作用，而内质网则是脂质合成的重要场所。本发明随后利用实时荧光定量PCR以及western blot，对UFBP1的UFM1化修饰在MAFLD肝脏脂质合成以及内质网应激中的作用进行检测。结果发现，过表达WT UFBP1后，MAFLD肝脏中的参与脂质合成的相关基因中，SREBP1的转录以及剪切成熟降低，且SCD1、PPARγ以及CD36的表达降低，而过表达UFBP1 K267R后肝脏中PPARγ以及CD36的表达没有下降，相反，SREBP1的转录、剪切成熟以及SCD1与DGAT2的表达反而都发生增高(图4A，B)。与此同时，过表达WT UFBP1后，MAFLD肝脏中的内质网应激相关基因(GRP78、XBP1s、Caspase 2)的转录水平下降，而过表达UFBP1 K267R后肝脏中GRP78和Caspase 2的转录水平没有下降，XBP1s的转录水平反而上升。同时，过表达WT UFBP1后MAFLD肝脏中内质网应激相关基因的蛋白水平(GRP78、ATF4、XBP1s、Caspase 2、ATF6)或蛋白磷酸化水平(PERK、eIF2α以及IRE1α)下降，而过表达UFBP1 K267R后肝脏中内质网应激相关基因的蛋白水平或磷酸化水平没有发生明显改变(图4C，D)。

[0078] 以上结果证实，UFBP1能以UFM1化修饰依赖的方式抑制MAFLD肝脏中的脂质合成并缓解MAFLD肝脏中的内质网应激，进而发挥缓解MAFLD的作用。

[0079] 本发明首先确定UFBP1的表达及其UFM1化修饰在MAFLD肝脏中增加。而在对敲减UFBP1的L‑02细胞进行高脂培养基培养诱导MAFLD细胞模型后，本发明发现，UFBP1缺失促进了MAFLD细胞模型中脂质的聚集，并促进了细胞中的脂质合成以及内质网应激。而在体内实验中，过表达野生型UFBP1可以降低MAFLD小鼠体重并减少MAFLD肝脏的体积和重量，过表达野生型UFBP1还缓解了MAFLD小鼠肝脏脂质积聚、降低MAFLD小鼠肝脏及血清中甘油三酯的水平并提高MAFLD小鼠的糖耐量和胰岛素敏感性，这提示小鼠MAFLD表型得到缓解，与之相反的是，过表达UFBP1 K267R则不能降低MAFLD小鼠体重、肝脏体积、肝脏重量或降低MAFLD小鼠肝脏及血清中甘油三酯的水平，并反而促进了MAFLD小鼠肝脏脂质积聚以及导致血清胆固醇水平上升。进一步实验显示，UFBP1发挥缓解MAFLD的作用与UFBP1 K267的UFM1化修饰抑制MAFLD肝脏中的脂质合成以及内质网应激有关，这也为利用UFBP1 K267的UFM1化修饰预防及治疗MAFLD提供了理论依据。

[0080] 同时，虽然本发明描述了具体的例子涉及调节MAFLD的发生发展，但是本领域技术人员将很容易理解这些实验可以预测对人或其他哺乳动物的生物效果，和/或可作为在人或其他哺乳动物中使用本发明来研究其他脂质代谢及内质网应激相关的模型。

[0081] 以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。