一株针对猪δ冠状病毒S1蛋白构象表位的中和性单克隆抗体

摘要

本发明属于免疫学领域，涉及一株针对猪δ冠状病毒S1蛋白构象表位的中和性单克隆抗体和分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。中和性单克隆抗体的重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的CDR1、CDR2和CDR3；轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO:4、RAS、SEQ ID NO:5所示的CDR1、CDR2和CDR3。分泌该中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2022248。本发明的单克隆抗体具有治疗和预防猪δ冠状病毒感染猪的临床效果，也可用于制备猪δ冠状病毒检测试剂或者试剂盒。

权利要求

1.针对猪δ冠状病毒S1蛋白构象表位的中和性单克隆抗体，其特征在于，所述中和性单克隆抗体的重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3；中和性单克隆抗体的轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的CDR1、氨基酸序列为RAS的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的CDR3。

2.根据权利要求1所述的中和性单克隆抗体，其特征在于，中和性单克隆抗体的重链可变区如SEQ ID NO:6所示、轻链可变区如SEQ ID NO:7所示。

3.编码权利要求1或2所述的中和性单克隆抗体的DNA。

4.根据权利要求3所述的DNA，其特征在于，编码所述中和性单克隆抗体的重链可变区的DNA如SEQ ID NO:8所示，编码所述中和性单克隆抗体的轻链可变区的DNA如SEQ ID NO:9所示。

5.含有权利要求3或4所述DNA的生物材料，所述生物材料为表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或宿主细胞。

6.权利要求1或2所述的中和性单克隆抗体经过改造得到的单链抗体或者抗原结合片段。

7.含权利要求1或2所述的中和性单克隆抗体或权利要求6所述的单链抗体或抗原结合片段的药物、检测试剂或试剂盒。

8.分泌针对猪δ冠状病毒S1蛋白构象表位的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2022248。

9.权利要求1或2所述的中和性单克隆抗体或权利要求6所述的单链抗体或抗原结合片段的以下任一应用：A：用于制备预防或治疗由猪δ冠状病毒感染以及由其感染所致相关疾病的药物；

B：用于制备猪δ冠状病毒检测试剂或试剂盒。

说明书

一株针对猪δ冠状病毒S1蛋白构象表位的中和性单克隆抗体

技术领域

[0001] 本发明属于免疫学领域，具体涉及一株针对猪δ冠状病毒S1蛋白构象表位的中和性单克隆抗体和分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

[0002] 猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)是一种新发现的肠道冠状病毒，属于冠状病毒科δ冠状病毒属成员，主要引起新生仔猪呕吐、腹泻、脱水和死亡。临床症状与猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)和猪传染性胃肠炎(Porcine transmissible gastroenteritis，TGE)相似。迄今为止，全球已有10多个国家或地区报道了PDCoV的发生与流行，对养猪业构成巨大威胁，而且PDCoV还具有跨物种传播的潜力，可以感染鸡、火鸡、牛、小鼠甚至人类，具有重要的公共卫生意义和基础研究价值。

[0003] PDCoV呈球形，直径为60nm～180nm。病毒粒子有囊膜，囊膜表面有Spike(S)蛋白形成的棒状纤突。核衣壳呈螺旋对称，由蛋白质衣壳包裹单股RNA基因组形成，位于病毒粒子的中心(Ma Y M,Zhang Y,Liang X Y,et al.2015.Origin,evolution,and virulence of porcine deltacoronaviruses in the United States.mBio,6(2):e00064.)。病毒粒子包含4个主要的结构蛋白：纤突蛋白S、小膜蛋白E、膜蛋白M和衣壳蛋白N，其中S蛋白、E蛋白和M蛋白与脂质双层共同构成病毒的囊膜，N蛋白构成病毒的衣壳。PDCoV基因组全长约为25.4kb，在5′端有帽子结构和非编码区(5′UTR)，3′端有poly(A)尾和3′UTR。基因组包含至少9个开放阅读框(open reading frame,ORF)，由5′端至3′端的排列顺序为ORF1a、ORF1b、S、E、M、NS6、N、NS7、NS7a，共编码15个成熟的非结构蛋白(nsp2～nsp16)、4个结构蛋白(纤突蛋白S、小膜蛋白E、膜蛋白M和核衣壳蛋白N)和3个辅助蛋白(NS6、NS7和NS7a)。编码辅助蛋白NS6的基因位于M基因和N基因之间，NS7基因位于N基因内部，NS7a基因位于NS7基因C端(Fang P X,Fang L R,Hong Y Y,et al.2017.Discovery of a novel accessory protein NS7a encoded by porcine deltacoronavirus.J Gen Virol,98(2):173‑178.；Woo P C,Lau S K,Lam C S,et al.2012.Discovery of seven novel Mammalian and avian coronaviruses in the genus deltacoronavirus supports bat coronaviruses as the gene source of alphacoronavirus and betacoronavirus and avian coronaviruses as the gene source of gammacoronavirus and deltacoronavirus.J Virol,86(7):
3995‑4008.)。PDCoV的S蛋白属于I型膜蛋白，在病毒囊膜表面以三聚体形式存在，形成病毒的纤突，其主要功能是识别受体，介导病毒进入宿主细胞，对病毒的宿主范围和组织嗜性起决定性作用，同时也是诱导中和抗体产生的主要蛋白。

[0004] 目前尚无针对PDCoV的商品化疫苗和诊断试剂，也没有治疗性药物，给该病的有效预防和控制带来了巨大挑战。具有中和活性的单克隆抗体不仅能特异性识别PDCoV，还能与特定的中和表位结合，阻止病毒与宿主细胞的相互作用，从而阻断感染，对宿主起到保护作用。制备具有PDCoV中和活性的单克隆抗体，可为PDCoV中和表位的研究以及PDCoV的临床防治奠定基础。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一株杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株能稳定分泌PDCoV中和性单克隆抗体，所述单克隆抗体通过中和PDCoV，有效保护了细胞不被PDCoV感染，进而推测所述单克隆抗体具有治疗和预防PDCoV感染猪的临床效果。

[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0007] 本发明提供了一株能稳定分泌PDCoV中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株D‑2H10，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2022248，具有良好的遗传稳定性。

[0008] 本发明提供了一株PDCoV中和性单克隆抗体D‑2H10，由保藏编号为CCTCC NO：C2022248的杂交瘤细胞株D‑2H10分泌得到。PDCoV中和性单克隆抗体D‑2H10的重链可变区包括氨基酸序列为GYTFTKYA(如SEQ ID NO:1所示)的CDR1、氨基酸序列为INPNNGGT(如SEQ ID NO:2所示)的CDR2和氨基酸序列为AGRMWFAF(如SEQ ID NO:3所示)的CDR3；PDCoV中和性单克隆抗体D‑2H10的轻链可变区包括氨基酸序列为ESVSFAGSIL(如SEQ IDNO:4所示)的CDR1、氨基酸序列为RAS的CDR2和氨基酸序列为MQSMEDPYT(如SEQ IDNO:5所示)的CDR3。
PDCoV中和性单克隆抗体D‑2H10的重链可变区为EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTKYAMHWVKQSHGKSLEWIGGINPNNGGTT YNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCAGRMWFAF(如SEQ ID NO:6所示)、轻链可变区为DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCQASESVSFAGSILMHWYQQKPGQPP KLLIYRASNLESGVPARFSGSGSESDFTLTIDPVEDDDAAMYVCMQSMEDPYT(如SEQ IDNO:7所示)。

[0009] 本发明通过间接免疫荧光实验(Immunofluorescence Assay,IFA)检测证实所述单克隆抗体可与PDCoV感染的LLC‑PK1细胞发生特异性荧光反应。

[0010] 本发明所述的单克隆抗体D‑2H10纯化后对PDCoV的中和效价为1:141，此时单克隆抗体D‑2H10浓度为0.71μg/mL；在空斑减数实验中，纯化后的单克隆抗体能较好地中和PDCoV，减少病毒空斑的产生。

[0011] 因此，可将本发明的单克隆抗体D‑2H10或杂交瘤细胞株D‑2H10用于制备预防或治疗PDCoV感染的药物，或者用于制备猪δ冠状病毒检测试剂或者试剂盒，或者用于猪δ冠状病毒的科学研究。将单克隆抗体D‑2H10经过改造得到的单链抗体或者抗原结合片段也可以用于制备预防或治疗PDCoV感染的药物，或者用于制备猪δ冠状病毒检测试剂或者试剂盒；或者用于猪δ冠状病毒的科学研究。

[0012] 间接免疫荧光实验和Western‑blot检测证实，本发明单克隆抗体D‑2H10识别的抗原表位为PDCoV‑S1蛋白的构象表位。

[0013] 本发明还提供了编码所述的PDCoV中和性单克隆抗体D‑2H10的重链可变区、轻链可变区的基因序列，编码单克隆抗体D‑2H10的重链可变区、轻链可变区的基因序列是以保藏编号为CCTCC NO：C2022248的杂交瘤细胞株D‑2H10的cDNA为模板，经鼠源抗体可变区简并引物扩增获得。编码单克隆抗体D‑2H10的重链可变区的基因序列为5’‑GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGA AGATATCCTGCAAGACTTCTGGATACACATTCACTAAATACGCCATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGGTATTAATCCTAACAATGGTGGTACTACTTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGATTCTGCAGTCTATTACTGTGCAGGGAGAATGTGGTTTGCTTTC‑3’，如SEQ ID NO:8所示，编码单克隆抗体D‑2H10的轻链可变区的基因序列为5’‑GACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCAG TGTCTCTAGGACAGAGGGCCACCATTTCCTGCCAAGCCAGCGAAAGTGTCAGTTTTGCTGGTTCAATTTTAATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCGAAACTCCTCATCTATCGTGCATCCAACCTAGAATCTGGAGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGAGTCAGACTTCACTCTCACCATCGATCCTGTGGAGGATGATGATGCGGCAATGTATGTCTGTATGCAAAGTATGGAAGATCCGTACACG‑3’，如SEQ ID NO:9所示。

[0014] 本发明具有以下有益效果：

[0015] 本发明的杂交瘤细胞株D‑2H10可稳定分泌PDCoV中和性单克隆抗体D‑2H10。另外，本发明的单克隆抗体D‑2H10通过中和PDCoV，有效保护了细胞不被PDCoV感染，因此，单克隆抗体D‑2H10具有治疗和预防PDCoV感染猪的临床效果。

附图说明

[0016] 图1为本发明的技术路线图。

[0017] 图2为纯化病毒的SDS‑PAGE结果。附图标记说明：M：Protein Marker；1：30％～45％蔗糖分层处样品；2：45％～60％蔗糖分层处样品。

[0018] 图3为纯化病毒的Western‑blot结果。附图标记说明：M：Protein Marker；1：30％～45％蔗糖分层处样品；2：45％～60％蔗糖分层处样品。

[0019] 图4为IFA验证单克隆抗体D‑2H10特异性识别PDCoV。附图标记说明：A：PDCoV感染的LLC‑PK1细胞；B：未接毒的LLC‑PK1细胞对照。

[0020] 图5为空斑减数实验检测单克隆抗体D‑2H10对PDCoV的中和能力。附图标记说明：A～E：单克隆抗体D‑2H10实验组(A：4μg/mL单克隆抗体D‑2H10，B：2μg/mL单克隆抗体D‑2H10，C：1μg/mL单克隆抗体D‑2H10，D：0.5μg/mL单克隆抗体D‑2H10，E：0.25μg/mL单克隆抗体D‑2H10)；F：单克隆抗体对照；G：病毒对照。

[0021] 图6为IFA鉴定单克隆抗体D‑2H10识别的PDCoV抗原表位。附图标记说明：A：PDCoV S；B：PDCoV S1；C：PDCoV S1‑NTD；D：PDCoV S1‑CTD。

[0022] 图7为Western‑blot鉴定单克隆抗体D‑2H10识别的PDCoV抗原表位。附图标记说明：M：Protein Marker；1：纯化的PDCoV；2：PDCoV S。

[0023] 保藏信息

[0024] 杂交瘤细胞株D‑2H10：

[0025] 保藏时间：2022年8月18日；

[0026] 保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；

[0027] 保藏编号：CCTCC NO：C2022248；

[0028] 保藏单位地址：中国，武汉，武汉大学；

[0029] 分类命名：杂交瘤细胞株D‑2H10。

具体实施方式

[0030] 下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。

[0031] 本发明所述PDCoV病毒液由PDCoV感染LLC‑PK1细胞获得，用于动物免疫的抗原为扩大培养的PDCoV病毒液通过本领域中常规的蔗糖梯度离心纯化获得的病毒颗粒。

[0032] 本发明的能稳定分泌PDCoV中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株D‑2H10，保藏编号为CCTCC NO：C2022248，由PDCoV病毒液免疫后的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合获得。

[0033] 本发明的PDCoV中和性单克隆抗体D‑2H10，由所述的杂交瘤细胞株D‑2H10分泌得到。抗体纯化采用本领域中常规的腹水型单克隆抗体制备以及纯化方法，所述单克隆抗体7
D‑2H10的腹水型抗体的ELISA效价为1:100×2。

[0034] 本发明单克隆抗体D‑2H10与PDCoV感染的LLC‑PK1细胞能发生特异性荧光反应，而与未感染PDCoV的LLC‑PK1细胞不发生反应，表明单克隆抗体D‑2H10能与PDCoV发生特异性反应。

[0035] 在本发明中，中和实验方法优选“固定病毒‑稀释血清”法，优选LLC‑PK1细胞，结果表明：按Reed‑Muench法计算，纯化的单克隆抗体D‑2H10的中和效价为1:141，此时单克隆抗体D‑2H10的浓度为0.71μg/mL。在空斑减数实验中，结果表明：单克隆抗体D‑2H10实验组与PDCoV病毒对照组和PRRSV N蛋白单克隆抗体+PDCoV对照组相比，病毒空斑数明显减少，且病毒空斑减少的数量与单克隆抗体D‑2H10的用量呈正相关。在本发明中，单克隆抗体D‑2H10通过中和PDCoV，有效保护了细胞不被PDCoV感染，进而推测所述单克隆抗体D‑2H10可能具有治疗和预防PDCoV感染猪的临床效果。

[0036] 本发明单克隆抗体D‑2H10的抗原表位鉴定实验中，所涉及PDCoV S、PDCoV S1、PDCoV S1‑NTD、PDCoV S1‑CTD真核表达质粒均由发明人所在实验室构建保存。其中编码PDCoV S、PDCoV S1、PDCoV S1‑NTD、PDCoV S1‑CTD的DNA序列分别如SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示；PDCoV S1的氨基酸序列为MQRALLIMTLLCLVRAKFADDLLDLLTFPGAHRFLHKPTRNSSSLYSRANNFDVGVLPGYPTKNVNLFSPLTNSTLPINGLHRSYQPLMLNCLTKITNHTLSMYLQPSDIQTYSCGGAMVKHQTHDAVRIILDLTATDHISVEVVGQHGENYVFVCSEQFNYTTALHNSTVFSLNSELYCFTNNTYLGILPPDLTDFTVYRTGQFYANGYLLGTLPITVNYVRLYRGHLAANSAHFALANLTDTLITLTNTTISQITYCDKSVVDSIACQRSSHEVEDGFYSDPKSAVRARQRTIVTLPKLPELEVVQLNISAHMDFGEARLDSVTINGNTSYCVTKPYFRLETNFMCTGCTMNLRTDTCSFDLSAVNNGMSFSQFCLSTESGACEMKIIVTYVWNYLLRQRLYVTAVEGQTHTGTTSVHATDTSSVITDVCTDYTIYGVSGTGIIKPSDLLLHNGIAFTSPTGELYAFKNITTGKTLQVLPCKTPSLLIVINNTVVGAITSSNSTENNRFTTTIVTPTFFYSTNATTFNCTKPVLSYGPISVCSDGAIAGTSTLQNTRPSIVSLYDGEVEIPS，如SEQ ID NO:12所示。在本发明中，用重组真核表达质粒PDCoV S、PDCoV S1、PDCoV S1‑NTD、PDCoV S1‑CTD转染HEK293T细胞，用单克隆抗体D‑2H10作为一抗进行IFA检测，结果显示：所述单克隆抗体可与转染细胞表达的PDCoV S蛋白、PDCoV S1蛋白发生特异性荧光反应，但与转染细胞表达的PDCoV S1‑NTD、PDCoV S1‑CTD蛋白无特异性反应，表明单克隆抗体D‑2H10可特异性识别PDCoV S1蛋白，推测单克隆抗体D‑2H10识别的表位可能为PDCoV S1蛋白的构象表位。

[0037] 用纯化的PDCoV以及超表达得到的PDCoV S蛋白进行SDS‑PAGE电泳，以单克隆抗体D‑2H10作为一抗进行Western‑blot检测，结果显示：所述单克隆抗体D‑2H10与纯化的PDCoV及真核表达的PDCoV S蛋白均无特异性反应，表明所述单克隆抗体特异性识别的表位为PDCoV S1蛋白的构象表位。

[0038] 本发明提供的PDCoV中和性单克隆抗体D‑2H10的重链可变区、轻链可变区基因序列，是以所述的杂交瘤细胞株D‑2H10的总RNA反转为cDNA为模板，再分别通过鼠源抗体可变区重链、轻链简并引物进行PCR扩增并测序得到。本发明的技术路线图如图1所示。

[0039] 以下结合具体实施例对本发明中抗原、杂交瘤细胞、单克隆抗体进行详细说明。

[0040] 实施例1抗原的制备

[0041] 1.PDCoV的大量扩增

[0042] 将LLC‑PK1细胞传至175cm2细胞培养瓶中，培养基为含10％ FBS的MEM，37℃、5％CO2条件下培养至细胞长成单层。用含7.5μg/mL胰酶的无FBS的MEM培养基将细胞单层涮洗两遍，加入含7.5μg/mL胰酶的无FBS的MEM培养基，将PDCoV按0.1～0.5MOI的量进行接种，37℃、5％ CO2条件下培养。待细胞病变达到80％时，冻融2～3次，4000r/min离心15min去除细胞碎片，收获上清即获得PDCoV病毒液。

[0043] 2.PDCoV全病毒颗粒的纯化

[0044] 将PDCoV病毒液8000r/min离心45min，取上清，用0.8μm滤器过滤去除细胞碎片。向过滤后的病毒液中加入终浓度为0.5M的NaCl和终浓度为5％的聚乙二醇6000(PEG 6000)，充分混匀后于4℃沉淀24h，12000r/min离心1h，弃上清，向沉淀中加入适量PBS并于4℃重悬过夜。将PBS重悬的病毒加到预先加有质量分数为30％、45％和60％蔗糖溶液的超高速离心管上部，36000r/min离心3h，吸取位于30％～45％蔗糖溶液分层处、呈环带状的病毒层。将样品置于新的超高速离心管中，用PBS将离心管补满，轻微吹打混匀，35000r/min离心2h，弃上清，向沉淀中加入少量PBS重悬。将重悬的病毒液进行SDS‑PAGE检测。

[0045] 结果显示，在大小约170KDa、40KDa、25KDa处出现明显的条带，分别与PDCoV S蛋白、N蛋白、M蛋白的大小一致；如图2所示。

[0046] 进一步以本实验室制备并保存的PDCoV  N蛋白的单克隆抗体为一抗，通过Western‑blot对纯化的病毒进行检测，结果显示在大小约40KDa处出现单一的特异性条带，如图3所示。以上结果说明获得了纯度较高的病毒。将纯化后的病毒液分装后于‑80℃保存备用。

[0047] 实施例2单克隆抗体的制备

[0048] 1.杂交瘤细胞株D‑2H10的建立

[0049] 将纯化的PDCoV与等体积的快速免疫佐剂(购自博奥龙免疫技术有限公司)混合均匀后经后腿肌肉注射6～8周龄雌性BALB/c小鼠，3次免疫后通过PDCoV‑ELISA方法(以纯化的PDCoV为抗原建立的间接ELISA)检测小鼠血清中的PDCoV抗体，当抗体效价达到1:12800时，用纯化的PDCoV进行加强免疫。加强免疫后3～5d，眼眶放血处死小鼠，同时收集血液，分离血清，即为阳性血清。无菌取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP 2/0进行融合，经HAT培养基和HT培养基培养后，以PDCoV‑ELISA方法对融合细胞的培养上清进行检测，对阳性孔的细胞进行3轮亚克隆与筛选，将获得的阳性细胞株扩大培养后，取其培养上清进行中和试验，最终获得1株可以稳定分泌PDCoV中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将其命名为D‑2H10。

[0050] 申请人已将该杂交瘤细胞于2022年8月18日送交武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：C2022248。

[0051] 2.单克隆抗体D‑2H10的大量制备、纯化

[0052] (1)单克隆抗体D‑2H10的大量制备：选取3只10周龄健康雌性BALB/c小鼠，腹腔注5 6
射弗氏不完全佐剂，500μL/只，7d后腹腔注射杂交瘤细胞株D‑2H10，5×10 ～1×10个细胞/只。10～14d后根据小鼠腹部膨大情况，收集小鼠腹水。将收集的腹水4℃12000r/min离心
10min，收集中间黄色清亮层液体即获得腹水型单克隆抗体。

[0053] (2)腹水型单克隆抗体D‑2H10的效价检测：用本发明制备的PDCoV全病毒颗粒包被12
酶标板，将腹水型单克隆抗体从体积比1:100×2倍比稀释至1:100×2 作为一抗，以HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗进行间接ELISA检测，结果显示本发明单克隆抗体D‑2H10的腹水型
7
抗体的ELISA效价为1:100×2。

[0054] (3)腹水型单克隆抗体D‑2H10的纯化：根据说明书用Protein G柱(购自福因德科技有限公司)对制备的腹水型单克隆抗体D‑2H10进行纯化，将纯化后的单克隆抗体D‑2H10进行SDS‑PAGE检测。

[0055] 结果可见轻链和重链两条蛋白带，说明获得了纯度较高的单克隆抗体。

[0056] 实施例3IFA检测单克隆抗体D‑2H10与PDCoV的反应

[0057] 将LLC‑PK1细胞接种于24孔板内，待细胞长满单层后，按常规方法用PDCoV感染细胞，待细胞出现病变后，吸弃细胞培养上清，每孔加入1mL组织固定液(4％多聚甲醛，购自Biosharp公司)，固定15min，加入‑20℃预冷的甲醇，透化10min，用PBS洗涤3次，每次5min。加入含5％ BSA的PBS，37℃封闭1h，PBS洗涤3次，每次5min。加入纯化后的单克隆抗体D‑
2H10(用PBS做1000倍稀释)，每孔250μL，37℃孵育1h。用PBS洗涤3次，每次5min。每孔加入
250μL异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG(购自碧云天生物技术有限公司)(用PBS做
2000倍稀释)，37℃孵育1h，全程避光操作。每孔加入250μl DAPI(购自碧云天生物技术有限公司)(用PBS做5000倍稀释)，37℃孵育15min。吸弃荧光二抗与DAPI稀释液，PBS洗涤3次，每孔中加入200μl PBS，置于倒置荧光显微镜下观察并拍照。

[0058] 结果表明：本发明制备的单克隆抗体D‑2H10与PDCoV感染的LLC‑PK1细胞有特异性荧光反应，与不接毒的LLC‑PK1细胞无荧光反应，如图4所示，说明本发明制备的单克隆抗体D‑2H10在IFA中可特异性识别PDCoV。

[0059] 实施例4纯化后的单克隆抗体D‑2H10对PDCoV的中和活性检测

[0060] 1.中和试验(固定病毒‑稀释血清法)检测单克隆抗体的中和活性

[0061] 使用含7.5μg/mL胰酶的无血清MEM培养基将PDCoV稀释至200TCID50/0.1mL，纯化后的单克隆抗体D‑2H10从100μg/mL开始作2倍倍比稀释至0.048μg/mL。将不同稀释度的单克隆抗体D‑2H10与等体积200TCID50/0.1mL的病毒液混匀后，置于37℃1h。用含7.5μg/mL胰酶的无血清MEM培养液将96孔细胞培养板中长满单层的LLC‑PK1细胞洗2次，将抗体‑病毒混合物接种于96孔板，每个抗体稀释度接种4孔，每孔100μL，设置200TCID50/0.1mL、20TCID50/0.1mL、2TCID50/0.1mL和0.2TCID50/0.1mL的病毒对照，置于37℃、含5％ CO2细胞培养箱内1h后，用含7.5μg/mL胰酶的无血清MEM培养液洗涤细胞单层2次，每孔加入含7.5μg/mL胰酶的无血清MEM培养液100μL，置于37℃、含5％CO2细胞培养箱内，每天观察并记录细胞病变(CPE)情况，直至细胞病变稳定(约72h)，按Reed‑Muench法计算抗体对PDCoV的中和效价。

[0062] 中和实验结果表明，所述纯化后的单克隆抗体D‑2H10的中和效价为1:141，此时单克隆抗体D‑2H10的浓度约为0.71μg/mL。

[0063] 2.空斑减数实验检测单克隆抗体的中和活性

[0064] 用含7.5μg/mL胰酶的无血清MEM培养基将PDCoV稀释至200TCID50/0.1mL，纯化后的单克隆抗体D‑2H10从4μg/mL开始作2倍倍比稀释至0.25μg/mL。将不同稀释度的单克隆抗体D‑2H10与等量200TCID50/0.1mL的病毒液混匀后，置于37℃1h。用含7.5μg/mL胰酶的无血清MEM培养液将6孔细胞培养板中长满单层的LLC‑PK1细胞洗2次，将抗体‑病毒混合液接种于6孔板，每孔2mL，设置单克隆抗体对照(PRRSV N蛋白单克隆抗体(由发明人所在实验室制备保存)+PDCoV)和病毒对照(200TCID50/0.1mL的PDCoV)，置于37℃、含5％ CO2细胞培养箱内1h后，用含7.5μg/mL胰酶的无血清MEM培养液洗涤细胞单层2次。取2％的低熔点琼脂糖与等体积的含15μg/mL胰酶的无酚红2×DMEM混合后加入细胞板内，4℃放置直至琼脂糖凝固，将细胞培养板于37℃、含5％ CO2细胞培养箱内培养。出现空斑后，用4％多聚甲醛进行固定，室温作用15‑30min，吸弃固定液，加入结晶紫染色液，室温放置1～2h，弃去琼脂糖和染色液，用流水轻轻冲洗，烘干后对病毒空斑进行计数、统计。

[0065] 结果显示：单克隆抗体D‑2H10实验组结果较PDCoV病毒对照组和PRRSV N蛋白单克隆抗体+PDCoV对照组相比，病毒空斑均明显减少，且空斑减少的数量与单克隆抗体D‑2H10的用量呈正相关，当单克隆抗体D‑2H10浓度达到2μg/mL时可完全阻断空斑的出现，如图5所示，说明本发明制备的单克隆抗体D‑2H10能有效地保护细胞免受PDCoV感染，从而减少病毒空斑的形成。

[0066] 实施例5单克隆抗体D‑2H10特异性识别抗原表位的鉴定

[0067] 1.IFA鉴定单克隆抗体D‑2H10识别的抗原表位

[0068] 将表达PDCoV S、PDCoV S1的重组质粒分别转染HEK293T细胞，24h后吸弃细胞培养液，按照实施例3中的方法进行IFA鉴定。

[0069] 结果显示：本发明制备的单克隆抗体D‑2H10与转染PDCoV S或PDCoV S1重组质粒的细胞均有特异性荧光反应，说明本发明制备的D‑2H10单克隆抗体与PDCoV S重组蛋白和PDCoV S1重组蛋白均有良好的特异性反应。

[0070] 将表达PDCoV S1‑NTD、PDCoV S1‑CTD的重组质粒分别转染HEK293T细胞，24h后吸弃细胞培养液，按照实施例3中的方法进行IFA鉴定。

[0071] 结果显示：单克隆抗体D‑2H10与表达的PDCoV S1‑NTD重组蛋白和PDCoV S1‑CTD重组蛋白均无特异性荧光反应，如图6所示。说明单克隆抗体D‑2H10识别的表位可能为PDCoV S1蛋白的构象表位。

[0072] 2.Western‑blot鉴定单克隆抗体D‑2H10识别的抗原表位

[0073] 将表达PDCoV S蛋白的重组质粒转染HEK293T细胞，转染后24h收取重组蛋白样品与本发明中制备的PDCoV纯化病毒进行SDS‑PAGE电泳。电泳结束后，采用湿转法转印至PVDF(Polyvinylidene Fluoride)膜上。用含5％脱脂牛奶的TBST室温封闭2h，再用TBST缓冲液洗涤3遍。加入适量的单克隆抗体D‑2H10，室温孵育2h，用TBST缓冲液洗涤3遍后加入适量HRP标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗，室温孵育1h，用TBST缓冲液洗涤3遍后加入适量显色液，在化学发光成像仪上显色。

[0074] 结果显示，本发明制备的单克隆抗体D‑2H10在Western‑blot检测中与PDCoV及表达的PDCoV S重组蛋白均无特异性反应，如图7所示。

[0075] 上述结果表明，通过IFA可检测到本发明制备的单克隆抗体D‑2H10与PDCoV全病毒、真核表达的PDCoV S重组蛋白和PDCoV S1重组蛋白有特异性荧光反应，但与真核表达的PDCoV S1截短体(PDCoV S1‑NTD、S1‑CTD)无反应；同时Western‑blot检测发现本发明制备的单克隆抗体D‑2H10与PDCoV全病毒、真核表达的PDCoV S重组蛋白无特异性反应。由此可判定单克隆抗体D‑2H10识别的表位为PDCoV S1蛋白的构象表位。

[0076] 实施例6单克隆抗体D‑2H10可变区基因的扩增与分析

[0077] 提取杂交瘤细胞D‑2H10的总RNA并反转为cDNA作为模板，设计11对简并引物用于单克隆抗体D‑2H10轻链可变区基因扩增，设计12对简并引物用于单克隆抗体D‑2H10重链可变区基因扩增。

[0078] 表1扩增轻链可变区的引物序列

[0079]轻链引物名称 引物序列(5’～3’)
MKV1 ATGAAGATTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTG
MKV2 ATGGAGWCAGACACACTCCTGYTAYGGGTG
MKV3 ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGGSGTTG
MKV4 ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGMWTCTTG
MKV5 ATGGATTTWCAGGTGCAGATTWTCAGCTTC
MKV6 ATGAGGTKCYYTGYTSAYCTYCTCTGRGG
MKV7 ATGGGCWTCAAAGATGGAGTCACAKWYYCWGG
MKV8 ATGTGGGGAYCTKTTTYCMMTTTTTCAATG
MKV9 ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG
MKV10 ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT
MKV11 ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC
MKC ACTGGATGGTGGGAAGATGG

[0080] 表2扩增重链可变区的引物序列

[0081]

[0082]

[0083] 结果显示，有1对引物(MKV2、MKC)可扩增轻链可变区基因，有2对引物(MHV5/MHV7，MHCG1)可扩增重链可变区基因。将获得的扩增片段连接到T载体后测序，获得一种抗体轻链可变区基因序列，两种抗体重链可变区基因序列(其中一种属于含终止密码子的无效重排基因)。轻链可变区序列大小为303bp，具有完整的抗体可变区结构，第23位和92位是特征性氨基酸—半胱氨酸，与Musmus IGKV3‑9*01F同源性达96.91％；重链可变区序列大小为312bp，具有完整的抗体可变区结构，第22位和96位是特征性氨基酸—半胱氨酸，与Musmus IGHV1‑18*01F的同源性达95.49％。

[0084] 单克隆抗体D‑2H10的重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3；PDCoV中和性单克隆抗体D‑2H10的轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的CDR1、氨基酸序列为RAS的CDR2和氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的CDR3。PDCoV中和性单克隆抗体D‑2H10的重链可变区如SEQ ID NO:6所示、轻链可变区如SEQ ID NO:7所示。

[0085] 编码单克隆抗体D‑2H10的重链可变区的基因序列如SEQ ID NO:8所示，编码单克隆抗体D‑2H10的轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO:9所示。

[0086] 以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。