续断来源的类外泌体纳米囊泡在制备抗骨肿瘤药物中的应用

摘要

本发明属于生物技术领域，特别涉及续断来源的类外泌体纳米囊泡在制备抗骨肿瘤药物中的应用。本发明提供了续断来源的类外泌体纳米囊泡（Dipsacus asper Exosomes like nanovesicles,DAELNs）在制备抗骨肿瘤药物中的应用。本发明的续断来源的类外泌体纳米囊泡由续断经水提取、超速离心分离得到，成分天然，无毒副作用，且对抑制骨肿瘤细胞MG63和骨肿瘤细胞HOS的细胞活力、增殖能力、迁移和侵袭能力均有显著的效果，具有抗骨肿瘤的活性，因此，可应用于制备抗骨肿瘤药物中，具有广阔的应用前景。

权利要求

1.续断来源的类外泌体纳米囊泡在制备抗骨肿瘤药物中的应用，所述的续断来源的类外泌体纳米囊泡由续断经提取分离得到；

所述提取使用的提取剂为水或加入磷酸盐的缓冲液的水溶液；

所述分离的方法为对提取的提取液进行超速离心进行分离；

分离得到的沉淀为续断来源的类外泌体纳米囊泡；

所述超速离心的速度为100000g或以上；

所述超速离心的时间为10‑100min；

超速离心前对提取液进行预离心除去杂质沉淀；

预离心的速度为10000g或以下；

预离心的时间为10‑60min；进行一次或以上的预离心。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物包括治疗有效量的续断来源的类外泌体纳米囊泡。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物采用常规方法制成各种药用剂型，这些剂型包括：片剂、胶囊剂、口服液、颗粒剂、丸剂、丹剂、混悬剂、酒剂、酊剂的口服给药的剂型及注射液的给药剂型。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物还含有一种或多种药学上可接受的载体。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物还含有一种或多种药学上可接受的赋形剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的赋形剂包括稀释剂、湿润剂、润滑剂、填充剂、防腐剂中的至少一种。

说明书

续断来源的类外泌体纳米囊泡在制备抗骨肿瘤药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及续断来源的类外泌体纳米囊泡在制备抗骨肿瘤药物中的应用。

背景技术

[0002] 细胞外囊泡是细胞分泌到细胞外具有不同大小的脂质膜囊泡。这些囊泡能够将各种分子从产生细胞运送到目标细胞。细胞外囊泡的三种主要亚型是微泡、外泌体和凋亡小体，在不同类型的细胞外囊泡中，外泌体是存在于不同生物体中的纳米大小的囊泡（30‑150nm）。它们携带生产细胞的各种分子成分，包括蛋白质、脂质、mRNA和microRNA，由于其脂质膜结构以及膜表面蛋白，使其更有利于被细胞吸收。越来越多的证据表明，外泌体在细胞间的信息交流中发挥着重要作用，影响着生理和病理过程，已被用作纳米治疗剂、药物传递载体和生物标志物而得到广泛的研究。目前人们主要集中在研究哺乳动物来源的细胞外囊泡，而植物外囊泡在形态方面和哺乳动物外囊泡相似，但其组成和功能等方面研究较少。

[0003] 转移性骨肿瘤是原发于人体骨外其他组织、器官的恶性肿瘤，经血行传播或者淋巴传播转移至骨骼，或者直接侵犯至骨骼，并继续生长而形成。在所有恶性肿瘤发生转移的情况中，恶性肿瘤转移至骨的概率仅次于转移至肝和转移至肺。转移性骨肿瘤的主要症状为顽固性疼痛，还可导致骨质破坏而引起骨质疏松、高钙血症，甚至导致脊髓压迫、病理性骨折等严重并发症，严重影响患者的生活质量。中医药在治疗该类疾病方面具有独特优势。

[0004] 续断是中医临床上常用的补肝肾中药，又名接骨、属折，为川续断科植物川续断的干燥根，始载于《神农本草经》，被列为上品，归肝、肾经；具有补肝肾、强筋骨的作用。临床用于主治肝肾不足、跌扑损伤、筋伤骨折等，但对骨肿瘤的研究未见报道。

[0005] 因此，从中药续断中提取类外泌体纳米囊泡，并深入研究提取到的续断源性类外泌体纳米囊泡的功能，探讨其在治疗骨肿瘤方面的应用潜力，具有重要意义。

发明内容

[0006] 为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供续断来源的类外泌体纳米囊泡（Dipsacus asper Exosomes like nanovesicles, DAELNs）在制备抗骨肿瘤药物中的应用。

[0007] 本发明的目的通过下述方案实现：

[0008] 续断来源的类外泌体纳米囊泡（DAELNs）在制备抗骨肿瘤药物中的应用。

[0009] 进一步的，所述续断来源的类外泌体纳米囊泡具有抗骨肿瘤的活性，包括抗骨肿瘤细胞MG63和抗骨肿瘤细胞HOS的活性。

[0010] 进一步的，所述药物相同或不同的分别包括治疗有效量的续断来源的类外泌体纳米囊泡。

[0011] 进一步的，所述的药物相同或不同的分别可采用常规方法制成各种药用剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、颗粒剂、冲剂、丸剂、丹剂、混悬剂、酒剂、酊剂等口服给药的剂型及注射液的给药剂型，如针剂等。

[0012] 进一步的，所述的药物相同或不同的分别还可含有一种或以上药学上可接受的载体。

[0013] 进一步的，所述的药物相同或不同的分别还可含有一种或以上药学上可接受的赋形剂。

[0014] 进一步的，所述的赋形剂可包括稀释剂、湿润剂、润滑剂、填充剂、防腐剂等。

[0015] 本发明所述的续断来源的类外泌体纳米囊泡（DAELNs）可以通过本领域技术人员公知的方法制备得到，如可由续断经提取分离得到。

[0016] 进一步的，分离得到的沉淀即为续断来源的类外泌体纳米囊泡（DAELNs）。

[0017] 进一步的，所述提取使用的提取剂可为常规使用的水或加入磷酸盐等缓冲液的水溶液。

[0018] 进一步的，所述提取可为将续断浸泡于提取液中进行孵育，所得浸泡液即为提取液。

[0019] 进一步的，所述续断浸泡前优选切成丁状或切小，以便浸泡更充分。

[0020] 进一步的，所述分离的方法可为对提取的提取液进行超速离心进行分离。

[0021] 进一步的，所述超速离心的速度可为100000g或以上。

[0022] 进一步的，所述超速离心的时间可为10‑100min。

[0023] 进一步的，所述超速离心的时间可为70‑100min。

[0024] 进一步的，超速离心所得沉淀可用PBS等缓冲液重悬从而得到续断来源的类外泌体纳米囊泡悬浮液。可进行一次或以上的超速离心，以获得进一步纯化的类外泌体纳米囊泡。

[0025] 进一步的，超速离心前可对提取液进行预离心除去杂质沉淀。

[0026] 进一步的，预离心的速度可为10000g或以下。通过预离心可将分非目标物质分离除去，减少杂质对于后续超速离心分离的影响。

[0027] 进一步的，所述预离心的时间可为10‑60min。可进行一次或以上的预离心。

[0028] 进一步的，所述续断来源的类外泌体纳米囊泡悬浮液使用前可使用过滤器过滤以获得无菌的悬浮液。所述的过滤器可为0.22μm的过滤器。

[0029] 本发明的续断来源的类外泌体纳米囊泡由续断经水提取、超速离心分离得到，成分天然，无毒副作用，且对抑制骨肿瘤细胞MG63和骨肿瘤细胞HOS的细胞活力、增殖能力、迁移和侵袭能力均有显著的效果，具有抗骨肿瘤的活性，因此，可应用于制备抗骨肿瘤药物中，具有广阔的应用前景。

附图说明

[0030] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

[0031] 图1为本发明的DAELNs的透射电镜图。

[0032] 图2为本发明的DAELNs的NTA分析结果。

[0033] 图3为本发明的DAELNs的红外谱图。

[0034] 图4为本发明实施例中HOS和MG63细胞摄取DAELNs的倒置荧光显微镜图。

[0035] 图5和图6为本发明DAELNs对HOS和MG63细胞的活率的影响。

[0036] 图7为本发明DAELNs对HOS和MG63细胞增殖能力的影响。

[0037] 图8为本发明DAELNs对HOS和MG63细胞迁移能力的影响。

[0038] 图9为本发明DAELNs对HOS和MG63细胞侵袭能力的影响。

具体实施方式

[0039] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中涉及的物料若无特殊说明均可从商业渠道获得。所述方法若无特别说明均为常规方法。

[0040] 一实施方式，续断来源的类外泌体纳米囊泡（DAELNs）在制备抗骨肿瘤药物中的应用。

[0041] 一实施例中，所述续断来源的类外泌体纳米囊泡具有抗骨肿瘤的活性，包括抗骨肿瘤细胞MG63和抗骨肿瘤细胞HOS的活性。

[0042] 一实施例中，所述药物相同或不同的分别包括治疗有效量的续断来源的类外泌体纳米囊泡。

[0043] 一实施例中，所述的药物相同或不同的分别可采用常规方法制成各种药用剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、颗粒剂、冲剂、丸剂、丹剂、混悬剂、酒剂、酊剂等口服给药的剂型及注射液的给药剂型，如针剂等。

[0044] 一实施例中，所述的药物相同或不同的分别还可含有一种或以上药学上可接受的载体。

[0045] 一实施例中，所述的药物相同或不同的分别还可含有一种或以上药学上可接受的赋形剂。

[0046] 一实施例中，所述的赋形剂可包括稀释剂、湿润剂、润滑剂、填充剂、防腐剂等。

[0047] 另一实施例方式，本发明所述的续断来源的类外泌体纳米囊泡（DAELNs）可以通过本领域技术人员公知的任何方法制备得到，如可由续断经提取分离得到。

[0048] 一实施例中，分离得到的沉淀即为续断来源的类外泌体纳米囊泡（DAELNs）。

[0049] 一实施例中，所述提取使用的提取剂为常规使用的水；另一实施例中，所述提取使用的提取剂为加入磷酸盐等缓冲液的水溶液。

[0050] 一实施例中，所述提取可为将续断浸泡于提取液中进行孵育，所得浸泡液即为提取液。

[0051] 一实施例中，所述孵育的温度为30‑60℃。

[0052] 一实施例中，所述孵育的时间为12‑24h。

[0053] 一实施例中，所述续断浸泡前切成丁状；另一实施例中，所述续断浸泡前切小；以便浸泡更充分。

[0054] 一实施例中，孵育后可用医用纱布进行过滤，分离得到提取液；另一实施例中，孵育后分离得到的提取液用70μm筛子过筛后再进行分离。

[0055] 一实施例中，所述分离的方法可为对提取液进行超速离心进行分离。

[0056] 一实施例中，所述超速离心的速度可为100000g或以上。

[0057] 一实施例中，所述超速离心的时间为10‑100min。

[0058] 一实施例中，所述超速离心的时间为70‑100min。

[0059] 一实施例中，超速离心所得沉淀用PBS等缓冲液重悬从而得到续断来源的类外泌体纳米囊泡悬浮液。

[0060] 一实施例中，进行一次超速离心；另一实施例中，进行一次以上的超速离心以获得进一步纯化的类外泌体纳米囊泡。

[0061] 一实施例中，超速离心前对提取液进行预离心除去沉淀。

[0062] 一实施例中，预离心的速度为10000g；另一实施例中，预离心的速度为2500‑4000g。通过预离心可将分非目标物质分离除去，减少杂质对于后续超速离心分离的影响。

[0063] 一实施例中，所述预离心的时间为10‑20min；另一实施例中，所述预离心的时间为30‑60min；再一实施例中，所述预离心的时间为10‑40min。

[0064] 一实施例中，进行一次预离心；另一实施例中，进行一次以上的预离心。

[0065] 一实施例中，所述续断来源的类外泌体纳米囊泡悬浮液使用前可使用过滤器过滤以获得无菌的悬浮液。所述的过滤器可为0.22μm的过滤器。

[0066] 一实施例中，续断来源的类外泌体纳米囊泡（DAELNs），由续断经提取分离得到，具体包括以下步骤方法制备得到：将新鲜续断切成丁状，加入水中浸泡孵育，分离得到上清液，对上清液在离心力10000g下进行多次的预离心，如可依次在2500‑4000、10000g下分别离心10‑20min、30‑60min，分别取上清液，弃去沉淀；预离心后的上清液可采用0.45μm过滤器进行过滤，再在离心力100000g或以上进行超速离心，离心时间可为10‑100min，可进行多次超速离心，如将超速离心所得沉淀用无菌PBS重悬后再次进行超速离心，所得沉淀即为续断来源的类外泌体纳米囊泡。

[0067] 一实施例中，所述续断使用前先清洗干净。

[0068] 一实施例中，所得续断来源的类外泌体纳米囊泡利用PBS重悬，得到续断来源的类外泌体纳米囊泡泡悬液。

[0069] 一实施例中，利用透射电镜对DAELNs进行形态学鉴定。由透射电镜观察可见，DAELNs形态呈典型膜性“杯盘”状结构（见图1）。

[0070] 一实施例中，利用纳米颗粒跟踪分析仪测定悬浮液中DAELNs的粒径大小。结果显示DAELNs平均直径为107.5±0.7nm，且具有较低的多分散性指数（见图2）。

[0071] 一实施例中，利用Bruker TENSOR‑27型红外光谱仪测定续断来源的类外泌体纳米囊泡的红外谱图，并与续断皂苷标准品进行对比，结果如图3所示。由图可见，本发明DAELNs与川续断皂苷IV标准品的基团峰位并不相同，特征峰相差较大，因此，两者存在较大差别。

[0072] 实施例1：骨肿瘤细胞MG63和骨肿瘤细胞HOS对DAELNs的摄入

[0073] HOS和MG63购于中国科学院细胞库；

[0074] （1）PKH26荧光标记的DAELNs：将100μL的DAELNs悬浮液与4μL的PKH26混合共孵育10min，加入同等体积的无外泌体血清终止反应，超速离心机4℃、20000g、离心60min，去除多余染液，无菌PBS重悬沉淀，超高速离心机4℃、110000g、离心70min，去除上清，500μL PBS重悬，获得荧光标记后的DAELNs。

[0075] （2）将细胞数为1×104个的HOS或MG63分别接种在玻片上，待细胞贴壁后，加入10μL标记有PKH26荧光染料的DAELNs（浓度20‑40μg/mL），继续培养24h，去除细胞上清，4%的多聚甲醛固定20min，PBS洗涤3次，每次5min，加入含DAPI核染料的封片剂进行封片，倒置荧光显微镜进行拍照。结果如图4所示，胞质内散在的红色荧光颗粒即为染色后被HOS和MG63细胞吞噬的DAELNs。

[0076] 实施例2：DAELNs对骨肿瘤细胞MG63和骨肿瘤细胞HOS的细胞活力的影响[0077] 采用Cell Counting Kit‑8检测DAELNs对HOS和MG63细胞的活力抑制作用，以川续3
断皂苷为对比：将细胞数为5×10个的HOS或MG63分别接种在96孔板中，培养24h后，去除培养基，用PBS洗去多余的培养基，然后分别将不同浓度的DAELNs或川续断皂苷（0、1、2、4μg/mL）与细胞共孵育24h，再在细胞中添加10μL CCK‑8试剂，轻轻振摇96孔板，37℃避光条件下反应1h，最后酶标仪（BioTek，USA）测定在450nm处的吸光度。浓度为0μg/mL的设为空白对照组，结果见图5和图6。由图可见，与空白对照组相比，不同浓度的DAELNs均能够显著抑制HOS和MG63细胞的活力，并呈剂量依赖关系；而不同浓度的川续断皂苷均不具备抑制HOS和MG63细胞活力的效果。

[0078] 实施例3：DAELNs对骨肿瘤细胞MG63和骨肿瘤细胞HOS的增殖能力的影响[0079] 采用EdU法检测DAELNs对HOS细胞和MG63细胞的增殖能力的影响：分别在6孔板中5
接种3×10个HOS细胞和MG63细胞，待细胞贴壁后，分别加入不同浓度的DAELNs（0、1、2、4μg/mL）与细胞共孵育24h。配制2X的EdU工作液，将37℃预热的2X的EdU工作液（20μM），等体积加入6孔板中，EdU终浓度变为1X。继续孵育细胞1h，去除培养液，加入1mL免疫染色固定液固定20min，去除固定液，每孔用1mL洗涤液洗涤细胞3次，每次3‑5min。去除洗涤液，每孔加入
1mL通透液室温孵育10‑15min。去除通透液，每孔加1mL洗涤液洗涤细胞1‑2次，每次3‑5min。
去除洗涤液，加入0.5mL/孔Click反应液，轻轻摇晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖样品。室温避光孵育30min。吸除Click反应液，用洗涤液洗涤3次，每次3‑5min。为了检测细胞增殖的比例，使用Hoechst 33342进行细胞核染色，倒置荧光显微镜进行拍照，结果见图
7。

[0080] 肿瘤细胞的增殖失控是恶性肿瘤最基本的生物学特征，因此抑制肿瘤细胞的增殖能力对恶性肿瘤的防治具有重要意义。由图可见，与空白对照组相比，经1μg/mL、2μg/mL和4μg/mL的DAELNs处理后，EdU标记的绿色荧光细胞显著减少并呈剂量依赖关系，表明HOS细胞和MG63细胞的DNA合成被DAELNs抑制后，EdU的掺入也被抑制。

[0081] 实施例4：DAELNs对骨肿瘤细胞MG63和骨肿瘤细胞HOS的迁移和侵袭的影响[0082] 为了研究DAELNs对HOS细胞和MG63细胞在体外的迁移和侵袭能力的影响，本实施例采用细胞划痕实验和Transwell实验进行检测。

[0083] （1）细胞划痕实验：细胞划痕也叫伤口愈合，是研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外试验方法，其实验原理是，当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上制造一个空白区域，称为“划痕”，划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。本实施例中，将HOS细胞和MG63细胞以一定密度分别接种到24孔板，当细胞融合度达到100%时，用200μL的枪头轻轻地在细胞中间划痕，枪头尽量与孔板底部保持垂直，不要倾斜。划痕后用PBS溶液轻轻清洗孔板两次，以去除脱落的细胞，然后依次加入浓度为0、1、2、4μg/mL的DAELNs，分别在孵育的0h和24h对划痕区域用显微镜进行拍照记录，并用Image‑J软件测量细胞迁移面积，伤口愈合率以（0h时面积值‑24h时面积值）/（0h时面积值）%表示，每个浓度做三个平行，结果见图8。

[0084] 由图可见，与空白对照组相比，1μg/mL、2μg/mL和4μg/mL的DAELNs处理后的细胞伤口愈合率显著减低并呈剂量依赖关系，表明DAELNs能够显著抑制HOS细胞和MG63细胞的迁移能力。

[0085] （2）Transwell侵袭实验：是指细胞通过细胞外基质从一个区域迁移到另一个区域的能力。本实施例中，将Martigel基质胶用预冷的MEM培养基稀释，并在每个小室中加入100μL稀释后的基质胶，然后将侵袭板置于37℃的培养箱中静置30min，待基质胶成膜后，分别6
取100μL细胞浓度为1×10/ml的HOS细胞和MG63细胞悬液于上室，并分别加入0、1、2、4μg/mL的DAELNs，然后在下室加入600μL含10%牛血清的MEM培养基，在37℃，含5% CO2的培养箱中培养。培养24h后，将上室中的细胞用棉签擦拭干净，同时将侵袭到膜下的细胞用0.1%结晶紫染料染色10min，最后荧光显微镜下观察穿过基质胶的HOS细胞和MG63细胞的数量，用Image‑J软件对荧光图片进行细胞计数，每个浓度做三个平行，其中浓度为0μg/mL的实验组为实验的空白对照组，结果见图9。

[0086] 由图可见，与空白对照组相比，1μg/mL、2μg/mL和4μg/mL的DAELNs能够显著抑制HOS细胞和MG63细胞的侵袭能力，并呈剂量依赖关系。

[0087] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。